基因編輯方法CRISPR-Cas9

1、CRISPR-Cas9一種新型基因編輯一種新型基因編輯 方法方法 又稱基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)，通過在某些物種基因組中進(jìn)行靶向特異 性的突變，從而解答并提出更多精確的生物學(xué)問題。 方法包括： 鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）技術(shù) 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技術(shù) Cas9/gRNA 系統(tǒng)系統(tǒng)(CRISPR-cas9技術(shù)技術(shù)) 基因組編輯技術(shù)基因組編輯技術(shù) Cell 2014 157,1262-1278 Figure2B 不論是TALEN技術(shù)還是ZFN技術(shù)，其定向打靶

2、都依賴于 DNA序列特異性結(jié)合蛋白模塊的合成,將蛋白模塊與限制性內(nèi)切 酶 (Fok) 的DNA切割域融合而得到。由蛋白特異結(jié)合域定位， DNA切割域剪切。 鋅指核酸酶（鋅指核酸酶（ZFN）轉(zhuǎn)錄激活因子）轉(zhuǎn)錄激活因子 樣效應(yīng)物核酸酶（樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)）技術(shù) Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A CRISPR-Cas9 技術(shù)技術(shù) 原理：規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs） CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在不斷進(jìn)化的過程中獲得一

3、種適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，研究者根據(jù) CRISPR-Cas 系統(tǒng)的特 性對(duì)此系統(tǒng)進(jìn)行改造產(chǎn)生了第 3 代人工核酸內(nèi)切酶技術(shù) CRISPR-Cas9技術(shù)。該技術(shù)通過小片段的 RNA 介導(dǎo)對(duì)入侵的 核酸進(jìn)行靶向定位并通過Cas酶對(duì)核酸進(jìn)行酶切、 降解。 CRISPR-Cas9 技術(shù)是一種多物種適應(yīng)性的，位點(diǎn)特異性的有 效基因組編碼工具。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure4 CRISPR-Cas9 技術(shù)技術(shù) 從已知的序從已知的序 列中通過列中通過 PAM 進(jìn)行進(jìn)行 定位尋找合定位尋找合 適的靶位點(diǎn)適的靶位點(diǎn) 并合成并合成 gRNA 構(gòu)建構(gòu)建gRNA 與與/Cas9 重重 組質(zhì)

4、粒。組質(zhì)粒。 對(duì)重組質(zhì)粒對(duì)重組質(zhì)粒 進(jìn)行活性檢進(jìn)行活性檢 測，敲除活測，敲除活 性的計(jì)算性的計(jì)算 挑選活性較挑選活性較 高的敲除質(zhì)高的敲除質(zhì) 粒導(dǎo)入培養(yǎng)粒導(dǎo)入培養(yǎng) 的細(xì)胞或者的細(xì)胞或者 生物體內(nèi)進(jìn)生物體內(nèi)進(jìn) 行基因組定行基因組定 點(diǎn)編輯操作點(diǎn)編輯操作 利用測序、利用測序、 RFLP 等方等方 法檢測基因法檢測基因 組定點(diǎn)修飾組定點(diǎn)修飾 結(jié)果結(jié)果 sgRNA 的設(shè)計(jì)的設(shè)計(jì) 選擇 PAM（NGG）5端的一段堿基序列20nt作為原間隔序列，即 敲除的靶位點(diǎn)。(PAM，Protospacer adjacent motifs 原間隔序列 臨近基序。一般形式為 NGG，其作用是將間隔序列定位于入侵 的噬菌

5、體或質(zhì)粒的 DNA 序列中) 原則： 選擇的序列必須在全基因組中進(jìn)行比對(duì)，原間隔序列必須唯一， 否則會(huì)對(duì)其他基因進(jìn)行敲除而出現(xiàn)錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 優(yōu)先選擇 DSB 位點(diǎn)的側(cè)翼存在重復(fù)序列（如果 DSB 的側(cè)翼存在重 復(fù)序列，在進(jìn)行非同源末端重組時(shí)能夠精確的介導(dǎo)斷裂位點(diǎn)堿基 的缺失）。 PAM 的5端盡量存在酶切位點(diǎn)。（有利于后期的活性檢測） 構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒 構(gòu)建方案 ： 1.一是將gRNA 與 Cas9 連入同一個(gè)質(zhì)粒載體中并以雙啟動(dòng)子啟動(dòng)，載 體中攜帶熒光報(bào)告基因（用于流式細(xì)胞儀篩選）或抗性基因（用于 藥物篩選） 。 2.二是將 gRNA與 Cas9 分別連載不同的載體上，兩個(gè)載體攜

6、帶有不同 的熒光報(bào)告基因或抗性基因 載體選擇： 慢病毒載體 以HIV-1的主要功能元件為基礎(chǔ)構(gòu)建起來的轉(zhuǎn)基因和基 因治療載體。區(qū)別于腺病毒載體，可實(shí)現(xiàn)外源基因在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的 傳代表達(dá)。 gRNA的活性檢測的活性檢測 限制性內(nèi)切酶法限制性內(nèi)切酶法 當(dāng) Cas9/sgRNA靶點(diǎn)位置中間序列存在限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)時(shí)，如果 通過 Cas9/sgRNA 發(fā)生突變，這個(gè)位點(diǎn)將可能被破壞，而不能被 內(nèi)切酶 酶切。可采用電泳的方法估計(jì)突變效率， 以突變效率的高低來衡量 sgRNA 的活性。 非配對(duì)內(nèi)切酶法非配對(duì)內(nèi)切酶法 T7 核 酸 內(nèi) 切 酶 I（T7 endonuclease I，T7E1） 能夠識(shí)別

7、不完全配 對(duì) DNA 并對(duì)其進(jìn)行切割，如果通過 Cas9/sgRNA 發(fā)生突變，將基因組 DNA 做 PCR，將相對(duì)應(yīng)的 PCR 產(chǎn)物與野生型 DNA的 PCR 產(chǎn)物等量混合， 并退火雜交，將產(chǎn)生非配對(duì)DNA 片段，將能被非配對(duì)內(nèi)切酶 T7E1 剪切。 用電泳的方法估計(jì)突變效率，以突變效率的高低來衡量 sgRNA 的活性。 SSA 活性檢測活性檢測 一個(gè)終止子插入 luciferase（GFP）的編碼區(qū)中央，luciferase（GFP） 就會(huì)失去活性。為檢測 Cas9/sgRNA 剪切活性，將一個(gè) Cas9/sgRNA的靶 點(diǎn)位置序列插在終止子后。在Cas9/ sgRNA 的作用下，靶點(diǎn)位置

8、產(chǎn)生 DSB，細(xì)胞通過同源重組方式修復(fù) DNA，形成一個(gè)有活性的luciferase。 通過與對(duì)照組的比值變化就可反應(yīng) Cas9/sgRNA 剪切的活性水平。 降低降低sgRNA/Cas9脫靶率的方法脫靶率的方法 Cas9的兩個(gè)內(nèi)切酶活性域?yàn)镽uvC和HNH,兩個(gè)亞基分別負(fù)責(zé)對(duì)一條 DNA單鏈的切割。任一亞基的失活都將形成DNA單鏈斷裂（nicked DNA）。 當(dāng)結(jié)合于兩條互補(bǔ)的 DNA 鏈上相鄰位置的一對(duì) sgRNA 同 時(shí)引 導(dǎo) Cas9 D10A 識(shí)別并切割靶位點(diǎn)時(shí)才能造成 DSB，從而加大了識(shí)別的長度， 有效的提高了 Cas9-sgRNA 技術(shù)的特異性。 Cell 2014 157,

9、1262-1278 Figure6A,B 重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞/生物體生物體 C、將編碼Cas9和sgRNA的表達(dá)質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染至細(xì)胞系中。 D、將純化的Cas9和體外表達(dá)的sgRNA顯微注射至受精卵，快速得到轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物模型。 E、將編碼CRISPR組分的高效價(jià)的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至組織或細(xì)胞，完成特 定時(shí)間，組織的基因編輯。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6C,D,E CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展 1. CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以作為一種位點(diǎn)特異性基因編輯平臺(tái)系統(tǒng)可以作為一種位點(diǎn)特異性基因編輯平臺(tái) Cas9-sgRNA 在靶位點(diǎn)切

10、割產(chǎn)生DSB后， 細(xì)胞可以通過兩種方式對(duì) DNA 進(jìn)行修復(fù)， 非同源末端連接 （non-homologous endjoining，NHEJ） 修復(fù)方式和同源重組方式（homology-directed repair，HDR）。 NHEJ 往 往使得核酸鏈被剪切的區(qū)域發(fā)生基因突變，導(dǎo)致編碼的基因Knockdown。 而HDR往往通過供體 DNA 與基因組 DNA 之間的同源重組造成靶位點(diǎn)的糾 正或者靶向插入外源基因Knockin。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展 2. 利用利用 Cas9 系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因

11、表達(dá)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié) 通過點(diǎn)突變使 Cas9 蛋白的兩個(gè)核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域活性全部喪失獲得 dCas9，將 dCas9-sgRNA 作為與 DNA 特異性識(shí)別的平臺(tái)，令轉(zhuǎn)錄因子或 表觀調(diào)控酶與dCas9-sgRNA 融合表達(dá)，即可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因表達(dá)的調(diào) 節(jié)。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6G CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展 3. 利用利用 Cas9 系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)系統(tǒng)對(duì)目標(biāo) RNA 序列進(jìn)行操縱序列進(jìn)行操縱 CRISPR/Cas 蛋白亞型（型）被證明可以靶向消化 RNA 底物。預(yù) 示著該技術(shù)的發(fā)展將會(huì)代替shRNA/siRN

12、A 等傳統(tǒng) RNAi技術(shù)成為一種新型 的 RNA 干擾物而對(duì)不同種類的細(xì)胞及動(dòng)物模型中特定的基因的下游產(chǎn)物進(jìn) 行RNA 干擾。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure4截圖 CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展 4. 利用利用 Cas9 系統(tǒng)對(duì)基因組功能進(jìn)行篩查系統(tǒng)對(duì)基因組功能進(jìn)行篩查 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6F CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展 5. Cas9 系統(tǒng)作為系統(tǒng)作為DNA特定位點(diǎn)標(biāo)簽特定位點(diǎn)標(biāo)簽 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6H Cas9和GFP融合表達(dá)，

13、可動(dòng)態(tài)記錄胞內(nèi)DNA特定位 點(diǎn)的染色體結(jié)構(gòu)狀態(tài) 。 CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展 6.利用利用 Cas9 系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的誘導(dǎo)調(diào)控 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6I 通過化學(xué)或可控因素誘導(dǎo)Cas9肽片段的重建，實(shí)現(xiàn)對(duì)基 因的誘導(dǎo)調(diào)控。 展望展望 到目前為止對(duì) CRISPR/Cas9 技術(shù)的開發(fā)尚屬初步。雖然 Cas9 系 統(tǒng)會(huì)被 sgRNA 引導(dǎo)從而識(shí)別出靶序列，但脫靶效應(yīng)依然存在，特異 性仍待提高。 與成熟的 ZFN 和 TALEN 等遺傳物質(zhì)靶向編輯系統(tǒng)相比， CRISPR/Cas9 核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)具有構(gòu)建簡單方便快捷、安全性高、 毒性小等得天獨(dú)厚的優(yōu)越性，勢必將在臨床治療、基礎(chǔ)理論研究和 農(nóng)牧漁業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮巨大的作用，并且將會(huì)對(duì)分子生物學(xué)研究和基 因治療領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。 參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn) 1 Patrick D. Hsu, Eric S. Lander,and Feng Zhang.Development and Applications ofCRISPR-Cas9 for Genome Engineering. Cell .2014 (157):1262-1278. 2 左其生等. CRISPR-Cas 介導(dǎo)