克隆載體PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1 克隆載體克隆載體 噬菌體或病毒的噬菌體或病毒的DNADNA能被開發(fā)能被開發(fā) 成為基因工程的有用載體，因為成為基因工程的有用載體，因為 ： 1.1.高效率的感染性高效率的感染性能使外源基能使外源基 因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞；因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞； 2.2.自主復(fù)制繁殖性能自主復(fù)制繁殖性能使外源基使外源基 因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增。因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增。 第1頁/共25頁 （一）（一） - -噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性 1 1、由外殼包裝蛋白和、由外殼包裝蛋白和-DNA-DNA組成組成 2 2、 - -DNADNA的物理圖譜的物理圖譜 （1 1）功能相近的基因在基因組中聚集在一起）功能

2、相近的基因在基因組中聚集在一起 目前已經(jīng)被確定的基因至少目前已經(jīng)被確定的基因至少6161種，一半為必需種，一半為必需 基因基因 第2頁/共25頁 48.5kb （2 2）線狀雙鏈）線狀雙鏈DNADNA，兩端各有一個，兩端各有一個1212bpbp的互補(bǔ)單鏈的互補(bǔ)單鏈 （粘性末端，粘性末端，cohesivecohesive-end site-end site），稱），稱coscos site site ，粘性末端粘連接變成，粘性末端粘連接變成環(huán)狀環(huán)狀DNADNA。 lcoscos位點是噬菌體包裝必需序列。位點是噬菌體包裝必需序列。 第3頁/共25頁 功能區(qū)：裂解相關(guān)功能區(qū)：裂解相關(guān)S S和和R R

3、，復(fù)制相關(guān)，復(fù)制相關(guān)O O和和P P 非必須區(qū)：非必須區(qū)： 非必須，基因重組非必須，基因重組intint（intagrateintagrate ）及及xisxis（excisionexcision） 結(jié)構(gòu)區(qū)：結(jié)構(gòu)區(qū)：A A J19J19個基因，編碼個基因，編碼頭、頭、 尾部蛋白質(zhì)尾部蛋白質(zhì) 第4頁/共25頁 第5頁/共25頁 DNADNA復(fù)制早期：一個復(fù)制早期：一個ori ori ，雙向復(fù)制，雙向復(fù)制 晚期：滾環(huán)復(fù)制晚期：滾環(huán)復(fù)制-多個多個DNADNA分子形成線狀多聯(lián)體分子形成線狀多聯(lián)體 第6頁/共25頁 頭部包裝蛋白頭部包裝蛋白首先結(jié)合在首先結(jié)合在coscos區(qū)區(qū)的附近，形成的附近，形成包包

4、 裝啟動復(fù)合物裝啟動復(fù)合物，A A蛋白蛋白切割切割coscos位點位點。 包裝包裝 第7頁/共25頁 噬菌體感染大腸桿菌后，噬菌體感染大腸桿菌后，DNADNA直接直接整合整合到到宿宿 主細(xì)胞染色體主細(xì)胞染色體DNADNA上，并不裂解細(xì)胞，這種情況上，并不裂解細(xì)胞，這種情況 稱為稱為溶源狀態(tài)溶源狀態(tài)。 DNADNA重組技術(shù)一般需要噬菌體處于溶源狀態(tài)。重組技術(shù)一般需要噬菌體處于溶源狀態(tài)。 整合主要由整合主要由cIcI和和intint基因的產(chǎn)物所激活，這兩個基因的開放基因的產(chǎn)物所激活，這兩個基因的開放 與關(guān)閉取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。與關(guān)閉取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。 cIcI基因：基因：編碼阻遏蛋白

5、，編碼阻遏蛋白，是感染了是感染了噬菌體的寄主細(xì)胞進(jìn)噬菌體的寄主細(xì)胞進(jìn) 入溶源化的必要條件。入溶源化的必要條件。cIcI基因失活或缺失基因失活或缺失的的噬菌體無法噬菌體無法 使寄主細(xì)胞使寄主細(xì)胞發(fā)生溶源化發(fā)生溶源化效應(yīng)。效應(yīng)。 第8頁/共25頁 噬菌體基因組可以整合到大腸桿菌染色體噬菌體基因組可以整合到大腸桿菌染色體DNADNA上上 ，成為，成為原噬菌體原噬菌體。 適當(dāng)條件下，原噬菌體又可以脫離寄主染色體，適當(dāng)條件下，原噬菌體又可以脫離寄主染色體， 重新變成獨立的復(fù)制子，這種過程叫做重新變成獨立的復(fù)制子，這種過程叫做原噬菌體原噬菌體 的刪除作用。的刪除作用。 l噬菌體噬菌體DNADNA的整合與刪

6、除：的整合與刪除： 溶源性細(xì)菌，由于含有溶源性細(xì)菌，由于含有原噬菌體原噬菌體，故不能再，故不能再 次被次被同種同種噬菌體感染。溶源性細(xì)菌所具有的這種噬菌體感染。溶源性細(xì)菌所具有的這種 抗御抗御同種噬菌體再感染同種噬菌體再感染的特性叫做的特性叫做超感染免疫性超感染免疫性。 第9頁/共25頁 噬菌體的溶源和裂解噬菌體的溶源和裂解 第10頁/共25頁 - -DNADNA載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建 噬菌體的缺陷：噬菌體的缺陷： 基因組太大（基因組太大（48.5kb48.5kb）；）； 酶切點太多，它有酶切點太多，它有5 5個個BamH1BamH1位點（位點（GGATCCGGATCC），），6 6 個個BgB

7、g位點（位點（AGATCTAGATCT），），5 5個個EcoREcoR位點（位點（ GAATTCGAATTC）。）。 野生型只能接納一定長度的野生型只能接納一定長度的DNADNA。若相當(dāng)于。若相當(dāng)于噬菌噬菌 體的體的75-105%75-105%，那么只能接納，那么只能接納48.5kb48.5kb5%=2.425kb5%=2.425kb 的的DNADNA。 重組的重組的DNADNA分子難于直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞分子難于直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞利用體利用體 外包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入外包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入DNADNA 。 第11頁/共25頁 切去部分非必須的區(qū)域；切去部分非必須

8、的區(qū)域； 抹去多余的限制性內(nèi)切酶切割位點；抹去多余的限制性內(nèi)切酶切割位點； 插入可供選擇的標(biāo)記基因；插入可供選擇的標(biāo)記基因； 建立體外包裝系統(tǒng)。建立體外包裝系統(tǒng)。 構(gòu)建構(gòu)建噬菌體克隆載體的基本策略：噬菌體克隆載體的基本策略： 第12頁/共25頁 插入型載體、取代型載體插入型載體、取代型載體 u根據(jù)切除的多少，將根據(jù)切除的多少，將-DNA分為兩大類載體：分為兩大類載體： 1、縮短長度、縮短長度 野生型野生型:上限上限51kb -DNA：48.5kb，外源基因，外源基因2.5kb -DNA上有上有40-50%的的DNA是復(fù)制，裂解所不必需的，是復(fù)制，裂解所不必需的， 切除便提高裝載量。切除便提高裝

9、載量。 第13頁/共25頁 經(jīng)改造后經(jīng)改造后只具有只具有一個一個可供外源可供外源DNA插入的插入的克隆位點克隆位點,長度長度 為為37kb，為包裝的下限，它本身也能被包裝，允許插入，為包裝的下限，它本身也能被包裝，允許插入 片段最大為片段最大為14kb. 必須攜帶標(biāo)記基因必須攜帶標(biāo)記基因 第14頁/共25頁 具有具有成對的克隆位點成對的克隆位點,空載的載體空載的載體DNA只只26kb，不能被包，不能被包 裝，無法進(jìn)入受體細(xì)胞中去裝，無法進(jìn)入受體細(xì)胞中去,不需要標(biāo)記基因不需要標(biāo)記基因. 第15頁/共25頁 插入型載體只能承受插入型載體只能承受較小分子量較小分子量（一般在（一般在 10kb以內(nèi)）的

10、外源以內(nèi)）的外源DNA片段的插入，廣泛片段的插入，廣泛 應(yīng)用于應(yīng)用于cDNA及小片段及小片段DNA的克隆。的克隆。 替換型載體可承受替換型載體可承受較大分子量較大分子量的外源的外源 DNA片段的插入，所以適用于片段的插入，所以適用于克隆高等克隆高等 真核生物的染色體真核生物的染色體DNA。 第16頁/共25頁 2、酶切位點的刪除或增加、酶切位點的刪除或增加 采用定點突變技術(shù)或甲基化酶處理必采用定點突變技術(shù)或甲基化酶處理必 需區(qū)內(nèi)的酶識別序列使其失活。需區(qū)內(nèi)的酶識別序列使其失活。 第17頁/共25頁 基因工程實驗中使用的受體是具有基因工程實驗中使用的受體是具有琥珀型突變琥珀型突變 體校正功能體校

11、正功能的菌株。的菌株。 第18頁/共25頁 4、加裝選擇標(biāo)記、加裝選擇標(biāo)記 野生型野生型-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加 裝選擇標(biāo)記是裝選擇標(biāo)記是-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容。克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容。 選擇標(biāo)記主要有兩類：選擇標(biāo)記主要有兩類： l免疫功能類標(biāo)記免疫功能類標(biāo)記 l顏色反應(yīng)類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記 第19頁/共25頁 當(dāng)當(dāng)外源外源DNA插入插入到標(biāo)記基因中，到標(biāo)記基因中， 基因滅活，基因滅活， -重組分子便進(jìn)入重組分子便進(jìn)入 溶菌循環(huán)，溶菌循環(huán)，形成形成透明斑。透明斑。 第20頁/共25頁 第21頁/共25頁 5、建立、建立 -噬菌體的體外包裝系統(tǒng)噬菌體的體外包裝系統(tǒng) 體外包裝原理：體外包裝原理： 噬菌體的頭部和尾部的裝配是分開進(jìn)行的噬菌體的頭部和尾部的裝配是分開進(jìn)行的。 頭部基因頭部基因發(fā)生了發(fā)生了突變突變的噬菌體只能的噬菌體只能形成尾部和形成尾部和 頭部蛋白所需的蛋白因子頭部蛋白所需的蛋白因子； 將這兩種突變型的噬菌體的將這兩種突變型的噬菌體的提取物混合起來，提取物混合起來， 便能夠在便能夠在體外裝配成