生化第三版考研課件第14章核酸物理化學性質(zhì)

1、生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 一、核酸的水解一、核酸的水解 酸、堿、酶水解酸、堿、酶水解 作用于磷酸二酯鍵和糖苷鍵作用于磷酸二酯鍵和糖苷鍵 DNA/RNA對酸對酸/ /堿的堿的有差別有差別 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 二、核酸的酸堿性質(zhì)二、核酸的酸堿性質(zhì) 具有芳香環(huán)結構特點具有芳香環(huán)結構特點 能發(fā)生酮式能發(fā)生酮式/ /烯醇式、氨式烯醇式、氨式/ /亞氨式互變亞氨式互變 嘌呤和嘧啶堿基都具有弱堿性嘌呤和嘧啶堿基都具有弱堿性 _主要是環(huán)內(nèi)氨基的貢獻主要是環(huán)內(nèi)氨基的貢獻 1 1、堿基的解離、堿基的解離 生化第三版考研課件

2、第14章核酸物 理化學性質(zhì) O NH N H O O N- N H O CH3 O NH N H O CH3 O N- N H O 1 9.5pK 1 9.9pK H H O NH2 NH + N H O NH2 N N H O- NH2 N N H 2 12.5pK 1 4.6pK H H 胞嘧啶中胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中尿嘧啶及胸腺嘧啶中 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) N NH + NH N NH2 N N NH N NH2 N N N- N NH2 1 4.15pK H H 2 9.8pK N NH NH N H+ NH2 O N NH NH N NH2 O N N-

3、 NH N H+ NH2 O N N- N- N NH2 O H H H 1 3.2pK 2 9.6pK 3 12.4pK 鳥嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子鳥嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子則結合到則結合到N7上上 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 2、核苷的解離、核苷的解離 戊糖可增強堿基的酸性解離戊糖可增強堿基的酸性解離 核糖中的羥基也可發(fā)生解離核糖中的羥基也可發(fā)生解離 3.3.核苷酸的解離核苷酸的解離 磷酸基使核苷酸具有很強的酸性磷酸基使核苷酸具有很強的酸性 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) ROH OH O O P RO- OH O O P RO- O- O O P 1 0.7 1.

4、6pK H H 2 5.96.5pK OH N - CH2 O O OH O OP OH N CH2 O OH N - CH2 O O O- O OP OH N CH2 O H 1 1.5pK 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) DNADNA等電點為等電點為4 44.54.5； RNARNA等電點為等電點為2 22.52.5 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收 堿基含有共軛雙鍵堿基含有共軛雙鍵 最大吸收峰最大吸收峰260nm左右左右 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 核酸溶液紫外吸收以摩爾磷的吸光度表示，摩爾核酸溶液紫外吸收

5、以摩爾磷的吸光度表示，摩爾 磷即相當于摩爾核苷酸。磷即相當于摩爾核苷酸。 30.98A P WL （ ） ：摩爾吸光系數(shù)：摩爾吸光系數(shù) A：吸收值：吸收值 W：每升溶液磷重量：每升溶液磷重量 L ：比色杯內(nèi)徑：比色杯內(nèi)徑 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) OD260的應用：的應用： 1. DNA或或RNA的定量的定量 OD260=1.0相當于相當于 50g/ml雙鏈雙鏈DNA 40g/ml單鏈單鏈DNA（或（或RNA） 20g/ml寡核苷酸寡核苷酸 2.判斷核酸樣品的純度判斷核酸樣品的純度 DNA純品純品: OD260/OD280 = 1.8 RNA純品純品: OD260/OD28

6、0 = 2.0 含雜蛋白及苯酚，降低含雜蛋白及苯酚，降低 3.判斷判斷DNA是否變性是否變性 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 四、核酸的變性、復性與雜交四、核酸的變性、復性與雜交 ( (一一) ) 核酸的核酸的變性變性（denaturation） 1 1、DNA的變性：的變性： 在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解雙鏈解 開成兩條單鏈的過程。開成兩條單鏈的過程。 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力， 使核酸分子高級結構改變、理化性質(zhì)及使核酸分子高級結構改變、理化性質(zhì)及 生物活性發(fā)

7、生改變。生物活性發(fā)生改變。 不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級結構不變不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級結構不變 2 2、變性的實質(zhì)、變性的實質(zhì) 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 降解：核苷酸骨架上降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯鍵的斷裂磷酸二酯鍵的斷裂 DNADNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 高溫（一般高溫（一般7575） 熱變性熱變性 強酸、堿強酸、堿 酸堿變性酸堿變性 甲醛甲醛（Agarose中中RNA ） 尿素尿素（PAGE中中DNA ） 3 3、變性因素、變性因素 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì)

8、 OD OD260 260增高 增高 粘度下降粘度下降 比旋度下降比旋度下降 浮力密度升高浮力密度升高 酸堿滴定曲線改變酸堿滴定曲線改變生物活性喪失生物活性喪失 4、變性后理化性質(zhì)變化、變性后理化性質(zhì)變化 RNA變性：從螺旋到線團之間的轉變變性：從螺旋到線團之間的轉變 RNA的變性引起的性質(zhì)變化沒有的變性引起的性質(zhì)變化沒有DNA明顯明顯 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 完全變性后核酸紫外吸收值增加：完全變性后核酸紫外吸收值增加： 天然天然DNA 2540%、RNA 約約1.1% 實質(zhì)：堿基暴露實質(zhì)：堿基暴露 由于變性或降解引起紫外吸收

9、增加的現(xiàn)由于變性或降解引起紫外吸收增加的現(xiàn) 象稱增色效應象稱增色效應 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) DNA變性變性 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 5、DNA熱變性的特征熱變性的特征 變性過程是變性過程是“躍變式躍變式”的，而非漸的，而非漸 變變 解鏈曲線：解鏈曲線：連續(xù)加熱連續(xù)加熱DNADNA，以溫度對，以溫度對 A A260 260作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線 作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 指增色效應達指增色效應達50%時的溫度時的溫度 一般一般DNA Tm 值在值在85 - 90 C之間之間 Tm：DNA變性時

10、，變性時，OD260達達 到最大值的到最大值的50%時的溫度稱時的溫度稱 為為DNA的解鏈溫度或融解溫的解鏈溫度或融解溫 度度(Tm)。 大小與大小與G+C含量成正比。含量成正比。 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) （1 1）DNA的均一性：的均一性： （2）GC含量：含量： 經(jīng)驗公式：經(jīng)驗公式： XG+C（Tm69.3）2.44 （3）介質(zhì)中的離子強度：）介質(zhì)中的離子強度： Tm值大小與下列因素有關：值大小與下列因素有關： 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) ( (二二) )核酸的核酸的復性復性（renaturation）

11、變性變性DNA在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的 單鏈重新締合成雙鏈單鏈重新締合成雙鏈復性復性。 熱變性的熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，經(jīng)緩慢冷卻后即可復性， 這一過程稱為退火這一過程稱為退火(annealing) 。 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) DNA復性復性 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 分子量越大復性越難；分子量越大復性越難； 濃度越大，復性越容易；濃度越大，復性越容易； DNA復性也與它本身組成和結構有關復性也與它本身組成和結構有關 （具有很多重復序列（具有很多重復序列DNA，復性快）。，復性快）。 減色效應（低色效應）減色效應（低色效應） 復性時紫外吸收減少的現(xiàn)象復性時紫外吸收減少的現(xiàn)象 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) ( (三三) ) 核酸的雜交核酸的雜交 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) 生化第三版考研課件第14章核酸物 理化學性質(zhì) DNA-DNA 雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子