GB∕T 40226-2021 環(huán)境微生物宏基因組檢測 高通量測序法

?ICS07.080

CCSA40

中華人民共和國國家標準

GB/T40226—2021

環(huán)境微生物宏基因組檢測高通量測序法

Detectionofenvironmentalmicrobialmetagenome—Highthroughputsequencing

2021-05-21發(fā)布

2021-12-01實施

GB/T40226—2021

目次

ttiw m

i 難 i

2規(guī)范性引用文件 1

3術(shù)語和定義 1

4鶴? 2

5綱 2

6試驗條件 2

7刪 2

8儀器設(shè)備 2

9牛羊& 3

10試驗步驟 3

11試驗報告 4

12質(zhì)量控制 5

附錄A（規(guī)范性）糞便樣品采集、保存、運輸方法 6

附錄B（規(guī)范性）土壤樣品采集、保存、運輸方法 7

附錄C（規(guī)范性）水體樣品采集、保存、運輸方法 8

附錄D（資料性）樣品信息單 9

附錄E（資料性）DNA樣品的完整性圖譜和質(zhì)量級別分類 10

附錄F（資料性）參考數(shù)據(jù)庫 11

12

本文件按照GB/T1.1—2020((標準化工作導(dǎo)則第1部分:標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由全國生化檢測標準化技術(shù)委員會(SAC/TC387)提出并歸口。

本文件起草單位：深圳華大生命科學(xué)研究院、深圳華大基因科技有限公司、深圳市生命科技產(chǎn)學(xué)研資聯(lián)盟、中國測試技術(shù)研究院生物研究所、深圳華大臨床檢驗中心。

本文件主要起草人：陳冰、肖亮、鐘煥姿、李俊樺、李倩一、賈慧玨、姜華艷、周李華、唐美芳、吳昊、李陶莎、周媛、鐘宏彬。

庫七七標準下載

環(huán)境微生物宏基因組檢測高通量測序法

1范圍

本文件描述了采用高通量測序技術(shù)進行環(huán)境微生物宏基因組檢測的術(shù)語和定義、原理、試驗條件、試劑、儀器設(shè)備、樣品、試驗步驟、試驗報告和質(zhì)量控制要求。

本文件適用于運用高通量測序法進行環(huán)境微生物宏基因組的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析試驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T35537—2017高通量基因測序結(jié)果評價要求

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

環(huán)境environment

相對某項中心事物的周圍世界。

注：在本文件中特指人體（動物）環(huán)境與自然環(huán)境。人體（動物）環(huán)境包括但不限于口腔、皮膚、生殖道、腸道等；自然環(huán)境包括但不限于空氣、水體、土壤、沉積物等。

3.2

相對豐度relativeabundance

某一特定種類微生物在環(huán)境微生物群落中所占的相對比例。

注：通常以百分比表示。

3.3

微生物宏基因組microbialmetagenome

以特定環(huán)境中整個微生物群落作為研究對象，不分離培養(yǎng)，直接提取得到的所有微生物基因組DNA。

注：可用于分析其遺傳信息、物種分類、系統(tǒng)進化、基因功能及代謝網(wǎng)絡(luò)等。

3.4

堿基識別質(zhì)量qualityofbasecalling

評價堿基準確識別的概率。

注：簡稱為Q，通常以數(shù)值表示。堿基識別質(zhì)量值與堿基識別錯誤率負相關(guān)，二者遵循對數(shù)函數(shù)關(guān)系。堿基識別質(zhì)量值越高，錯誤率越低。

GB/T40226—2021

3.5

Q20

測序數(shù)據(jù)中，堿基識別質(zhì)量值為20的堿基識別準確率為99%，或錯誤率為1%。

3.6

Q30

測序數(shù)據(jù)中，堿基識別質(zhì)量值為30的堿基識別準確率為99.9%,或錯誤率為0.1%。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)

ID:識別碼(identifier)

PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction)

RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)

5原理

運用高通量測序技術(shù)對環(huán)境樣品中微生物基因組DNA進行測序，再將測序結(jié)果與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中序列進行比對.從而檢測樣品中所含微生物種類和相對豐度。

6試驗條件

6.1實驗室設(shè)施和設(shè)備要求應(yīng)符合GB19489的規(guī)定。

6.2實驗室用水應(yīng)符合GB/T6682的規(guī)定。

6.3實驗室應(yīng)做到防止污染，應(yīng)根據(jù)不同工作內(nèi)容劃分獨立區(qū)域，并有明顯標志.如試劑儲備和準備區(qū)、樣品制備區(qū)、擴增區(qū)等，各區(qū)域間應(yīng)避免交叉污染。

7試劑

7.1DNA提取試劑。

7.2PCR產(chǎn)物純化試劑。

7.3文庫制備試劑。

7.4高通量測序試劑。

8儀器設(shè)備8.1高通量測序儀。

8.2PCR儀。

8.3冷凍離心機:最大離心力12000g以上。

8.4微量移液器。

8.5紫外分光光度計。

8.6熒光定量儀。

8.7電泳儀。

8.8凝膠成像系統(tǒng)。

8.9水浴鍋。

8.10低溫冰箱：-20°C和一80°C。

9樣品

9.1樣品采集、保存和運輸

9.1.1樣品采集應(yīng)經(jīng)過倫理審查和生物安全評價審查。

9.1.2應(yīng)即刻采樣，減少樣品暴露于空氣中的時間，同時應(yīng)避免樣品被其他物質(zhì)污染。

9.1.3應(yīng)根據(jù)環(huán)境樣品類型等情況選擇相應(yīng)的采樣方法以保證樣品中微生物群落的代表性和準確性。糞便樣品采集、保存和運輸方法按附錄A，土壤樣品采集、保存和運輸方法按附錄B，水體樣品采集、保存和運輸方法按附錄C執(zhí)行。

9.2樣品接收與處理

應(yīng)核對樣品編號，記錄樣品信息，檢查樣品狀態(tài)，避免密封不嚴導(dǎo)致泄漏或污染等，否則該樣品應(yīng)廢棄，重新采樣。應(yīng)記錄樣品信息（見附錄D），以保證樣品的可追溯性。

10試驗步驟

10.1DNA提取

10.1.1原理

將環(huán)境樣品懸浮于裂解緩沖液中，通過抽提等步驟提取微生物基因組DNA，充分去除樣品中的蛋白質(zhì)、脂類、多糖、RNA等雜質(zhì)。宜選用手工提取方法或相應(yīng)DNA提取試劑盒。

10.1.2DNA樣品濃度和完整性檢測

環(huán)境樣品提取微生物基因組DNA后，應(yīng)使用熒光定量儀檢測DNA樣品濃度，使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA樣品完整性。宜綜合DNA樣品濃度及完整性，判斷DNA樣品質(zhì)量級別，判斷依據(jù)見附錄E。

10.2文庫構(gòu)建與高通量測序

10.2.1應(yīng)使用合適的DNA樣品和文庫構(gòu)建試劑進行文庫構(gòu)建。進行文庫構(gòu)建的DNA樣品類別選擇標準按表1。

表1進行文庫構(gòu)建的DNA樣品類別選擇標準

DNA樣品類別

是否滿足文庫構(gòu)建

A類

滿足文庫構(gòu)建要求.DNA總景＞1.0fig

B類

滿足文庫構(gòu)建要求，DNA總量＞0.5ftg，且＜1.0MS

C類

不完全滿足文庫構(gòu)建要求，可以嘗試進行該步驟，但不保證測序質(zhì)量。建議重新采樣.重新提取樣品微生物基因組DNA

3

庫七七標準下載

GB/T40226—2021

10.2.2應(yīng)使用合適的文庫和高通量測序試劑進行高通量測序。高通量測序按GB/T35537—2017的附錄A進行。

10.3數(shù)據(jù)處理

10.3.1數(shù)據(jù)質(zhì)控

質(zhì)控步驟

樣品經(jīng)過高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)，應(yīng)進行質(zhì)量控制，去除含接頭或低質(zhì)量的序列、外源或宿主基因組序列，再進行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

堿基識別質(zhì)量值要求

測序完成后，應(yīng)進行Q2O.Q3O的統(tǒng)計和評估。每個DNA樣品可用數(shù)據(jù)對應(yīng)的堿基識別質(zhì)量值應(yīng)符合如下要求：

——大于Q2O的堿基比例＞90%;

——大于Q30的堿基比例＞80%。

可用數(shù)據(jù)量要求

可用測序數(shù)據(jù)量應(yīng)達到聲明目標物種可從樣品中檢測到的最小測序數(shù)據(jù)量。每個樣品測序生成的可用高質(zhì)量序列數(shù)目應(yīng)大于1X1O7條。

注：序列數(shù)目為單端測序序列條數(shù)，或雙端測序序列對數(shù)。

10.3.2物種注釋

數(shù)據(jù)質(zhì)控后對樣品數(shù)據(jù)進行物種注釋。除特殊方法外，對于已知物種，宜使用數(shù)據(jù)庫中序列相似度95%以上，覆蓋度90%以上的物種信息進行注釋。數(shù)據(jù)庫見附錄F。

10.3.3序列拼接與組裝

數(shù)據(jù)質(zhì)控后對樣品數(shù)據(jù)可進行序列拼接與組裝。使用組裝軟件將序列進行拼接，得到更長的疊連群，將這些疊連群片段聚集起來，與參考數(shù)據(jù)庫進行比對，得到新的參考基因集。數(shù)據(jù)庫見附錄F。

10.3.4微生物物種相對豐度計算

數(shù)據(jù)質(zhì)控后對樣品數(shù)據(jù)進行物種相對豐度計算，應(yīng)對所使用的相對豐度計算方法進行記錄。除特殊方法外，宜將可用高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)比對到組裝好的參考基因集或合適的數(shù)據(jù)庫上，按相似度95%以上，覆蓋度90%以上進行統(tǒng)計，得到基因水平上的相對豐度分布情況，再將注釋到同一物種分類水平的基因序列相對豐度進行疊加，得到該物種的相對豐度結(jié)果。

11試驗報告

試驗報告應(yīng)包含環(huán)境樣品中微生物群落的物種組成及各成分相對豐度，可增加個性化功能分析部分.并應(yīng)至少包括下列內(nèi)容：

a） 檢測機構(gòu)名稱、聯(lián)系方式和地址、檢測員、樣品接收時間、樣品檢測時間及報告時間；

b） 測序平臺與測序策略；

1

庫七七標準下載

GB/T40226—2021

C）數(shù)據(jù)分析對應(yīng)使用的注釋方法、軟件、參數(shù)、流程和數(shù)據(jù)庫版本等;

d）樣品物種組成及各相應(yīng)豐度，宜選擇多元展現(xiàn)方式。

12質(zhì)量控制

12.1宜使用標準物質(zhì)進行質(zhì)量控制，評估定性與定量檢測結(jié)果的準確性。

12.2在描述結(jié)果時應(yīng)注明檢測結(jié)果的局限性.說明非本文件規(guī)定的可能影響檢測結(jié)果的所有操作細節(jié)。

附錄A

（規(guī)范性）

糞便樣品采集、保存、運輸方法

A.1糞便杯采集法

A.1.1采集

應(yīng)使用潔凈的器皿收集糞便樣品.確認器皿中無水、尿液或其他分泌物（如經(jīng)血）等污染。排便后即刻使用一次性糞便杯配套取樣勺對糞便樣品中部取樣，將糞便樣品從潔凈器皿轉(zhuǎn)移至糞便杯，立刻旋緊蓋子。每個糞便杯中轉(zhuǎn)移至少2cm3大小的糞便樣品。

A.1.2保存與運輸

A.1.2.1糞便杯采集糞便樣品后，應(yīng)立即置于干冰或一80°C保存。若不能即刻轉(zhuǎn)移，可暫存于＜4°C條件下（如冰盒），30min內(nèi)轉(zhuǎn)移至干冰或一80°C保存。

A.1.2.2應(yīng)在干冰條件下進行運輸。保存及運輸過程應(yīng)避免反復(fù)凍融。

A.2含穩(wěn)定液自采樣套裝采集法

A.2.1采集

應(yīng)使用潔凈的器皿收集糞便，確認器皿中無水、尿液或其他分泌物（如經(jīng)血）等污染，按照自采樣套裝操作要求取中段糞便，將采集的糞便樣品迅速轉(zhuǎn)移至含有穩(wěn)定劑的保存管中，使穩(wěn)定液完全浸沒糞便樣品，蓋緊管蓋。

A.2.2保存與運輸

含穩(wěn)定液保存管采樣后，該保存管按操作說明可于常溫保存和運輸，避免陽光直射。常溫放置時間應(yīng)不超過自采樣套裝操作說明限定的常溫保存時間范圍。對將超出自采樣套裝操作說明限定時間的常溫糞便保存管需轉(zhuǎn)移至一80°C凍存，應(yīng)在干冰條件下進行運輸。保存及運輸過程應(yīng)避免反復(fù)凍融。

附錄B

（規(guī)范性）

土壤樣品采集、保存、運輸方法

B.1采集

宜取土壤表層5cm?10cm處土壤，如果土壤有翻動，應(yīng)更深處采樣，避免空氣微生物污染。采樣區(qū)內(nèi)設(shè)置至少3個重復(fù)采樣點，保證所取樣本對所在地域的代表性。每個點取樣量應(yīng)一致（＞5g），去除土樣里植物根系或礫石，將重復(fù)土樣混合均勻，做好標記，裝人滅菌封口聚乙烯袋或其他無菌容器。

B.2保存與運輸

B.2.1采集樣品后，應(yīng)立即置于干冰或一80°C保存。若不能即刻轉(zhuǎn)移，可暫存于＜4°C條件下（如冰盒）,30min內(nèi)轉(zhuǎn)移至干冰或一80°C保存。

B.2.2應(yīng)在干冰條件下進行運輸。保存及運輸過程應(yīng)避免反復(fù)凍融。如需常溫保存或運輸，宜將樣品浸潤于穩(wěn)定劑中。

附錄C

（規(guī)范性）

水體樣品采集、保存、運輸方法

C.1采集

C.1.1根據(jù)水體不同的濁度，應(yīng)使用無菌器材采集4L-200L不等的水樣。采集好的水樣需要通過濾膜進行過濾，可選擇不同孔徑大小的濾膜。

示例：20ptm、3ftm、0.8pcm、0.4pm、0.2ftm、0.1等孔徑濾膜。

C.1.2濁度較大水樣應(yīng)先靜置，分離懸浮顆粒;再使用20 孔徑濾膜預(yù)過濾，再選擇小孔徑濾膜進行

過濾。濁度較小清涼水樣，可選擇小孔徑濾膜直接過濾。

C.2保存與運輸

C.2.1樣品最后一次過濾后的濾膜應(yīng)放置于無菌容器，并將無菌容器立即置于干冰或一80°C進行保存。若不能即刻轉(zhuǎn)移，可暫存于＜4°C條件下（如冰盒），30mm內(nèi)應(yīng)轉(zhuǎn)移至干冰或一80°C保存。

C.2.2應(yīng)在干冰條件下進行運輸。保存及運輸過程中應(yīng)避免反復(fù)凍融。如常溫保存或運輸，宜將樣品浸潤于穩(wěn)定劑中。

5

庫七七標準下載

GB/T40226—2021

附錄D

（資料性）

樣品信息單

樣本信息單記錄見表D.1。

表D.1樣本信息單

I運輸信息

運輸公司： 快遞單號： 城市：

樣品寄件人： 樣品寄件人聯(lián)系電話：

運輸狀態(tài)：口干冰 □冰袋 □常溫 □其他：

樣品聯(lián)系人*

樣品聯(lián)系人電話

樣品聯(lián)系人郵箱*

樣品聯(lián)系人單位

有無傳染性、

致病性*

□無 □有（致病傳染性說明： ） □未知

實驗室要求*

□普通實驗室 □P2實驗室（生物安全柜）

詳細提取方案*

樣品信息

信息欄

填寫標準

樣品名稱

1.樣品名稱必需唯一化以區(qū)分其他樣本

2.樣品名稱可由字母及數(shù)字組成；不能包含和“*”等非常規(guī)符號

3.人體相關(guān)樣品名稱不能包含任何可識別個體身份的信息

樣品狀態(tài)

樣本狀態(tài)包括：DNA、速凍組織（速凍糞便、速凍土壤、速凍水體等）、含穩(wěn)定劑組織等

分類單元ID

按照NCBItaxonID提供樣品分類單元信息。例如：410658代表土壤宏基因組樣品;749906代表腸道宏基因組樣品；412755代表海洋沉積物宏基因組樣品；408172代表海洋水體宏基因組樣品;449393代表淡水宏基因組樣品。

NCBI無記錄ID的樣品類型歸為408169

樣品環(huán)境名稱

樣本環(huán)境名稱必需與上述分類單元ID—致。包括土壤宏基因組、腸道宏基因組、海洋沉積物宏基因組、海洋水體宏基因組等

宿主名稱

（僅針對宿主相關(guān)樣本，含中文名與拉丁名）

宿主名稱：人(.Homosapiens)、豬(Susscrofa)

采集時間

樣本采集時間，按照年-月-日“yyyy-mm-dd”規(guī)范記錄，對無法精確日期的樣本可精確到月份或年份。例如：2017-01-23,

2017-01和2017

采集地點

采集地點信息需包括國家和省份信息（詳細位置信息由經(jīng)緯度提供）。例如：中國廣東省

采集經(jīng)度

采集地點經(jīng)度，正值代表東經(jīng)，負值代表西經(jīng)。例如：40.743和一10.530

采集緯度

采集地點緯度.正值代表北緯，負值代表南緯。例如:18.580和一89.122

注1：樣本信息標準參考國際基因組學(xué)標準聯(lián)盟的宏基因組序列最小信息（MIMS）標準。注2:"*”欄目為必填項。

庫七七標準下載

GB/T40226—2021

附錄E

(資料性)

DNA樣品的完整性圖譜和質(zhì)量級別分類

E.1DNA完整性判斷

使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測基因組DNA樣品的完整性，進行完整性判斷的電泳圖譜見圖E.1。

M2 1

2 3

Ml

標引序號說明：

1—重度降解：電泳圖中對應(yīng)樣品的泳道無明顯主帶，拖尾嚴重;

2—中度降解：電泳圖中對應(yīng)樣品的泳道可見主帶，略有拖尾；

3—輕微降解：電泳圖中對應(yīng)樣品的泳道可見主帶，略有拖尾；

Ml——DNA標準品1；

M2——DNA標準品2；

bp 堿基對(basepair)0

圖E.1基因組DNA樣品降解程度示意圖

E.2DNA質(zhì)量級別分類

結(jié)合基因組DNA樣品濃度和完整性，對DNA樣品質(zhì)量級別進行分類，分類標準見表E.1。

表E.1DNA樣品質(zhì)量級別分類表

樣品類型

檢測結(jié)果

判定結(jié)論

基因組DNA

m^l.Optg

^o^lOng//iL

無降解

或輕微降解

A類

0.5ptg^m<C1.0ftg

B類

m<0.5ptg

^<10ng/^L

中度降解或重度降解

C類

注1:m 指DNA總量。

注2:p 指DNA質(zhì)量濃度。

注3：A類樣品同時滿足Mg，p>10.0ng/fzL，無降解或輕微降解二個條件，合格。

注4：B類樣品同時滿足0.5 <??<1.0Mg^>10.0ng/ML，無降解或輕度降解三個條件，合格。

注5:C類樣品滿足m<0.5Mg,(o<10.0ng/^L,中度降解或重度降解三個條件其中之一或以上，不完全合格。

附錄F

（資料性）

參考數(shù)據(jù)庫

數(shù)據(jù)處理過程可使用如下參考數(shù)據(jù)庫：

a） 國家生物信息中心（CNCB）/國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心（NGDC）的基因組數(shù)據(jù)庫https：///gwh/

b） 國家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心（NMDC）的微生物宏基因組數(shù)據(jù)庫

https：///

c） 國家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心（NMDC）的全球微生物菌種目錄數(shù)據(jù)庫

http:///

d） 中國國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺的微生物數(shù)據(jù)庫

https：///datamart/microbe

e） 美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的基因銀行數(shù)據(jù)庫

https：///genbank

f） 美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的參考序列數(shù)據(jù)庫

https：///refseq

g） 美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的微生物基因組數(shù)據(jù)庫

http://www.ncbi.nlm.nih,gov/genome/microbes

h） 美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的物種分類數(shù)據(jù)庫

http:///taxonomy

i） 美國能源部聯(lián)合基因組研究中心（DOE-JGI）的微生物基因組數(shù)據(jù)庫/

j） 美國能源部聯(lián)合基因組研究中心（DOE-JGI）的細菌核糖體RNA基因序列數(shù)據(jù)庫http://

k） 歐洲生物信息研究所（EBI）的核酸數(shù)據(jù)庫

http://www.ebi.ac.uk/embl/

l） 歐洲生物信息研究所（EBI）的蛋白數(shù)據(jù)庫

https:///

m） 斯坦福國際研究所（SRIinternational）的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫

https：///

n） 日本京都大學(xué)的基因與基因組百科全書

https://www.genome.jp/kegg/

o） 日本國立遺傳學(xué)研究所（NIG）的核酸數(shù)據(jù)庫

http://www.ddbj.nig.ac.jp

P）加拿大麥克馬斯特大學(xué)的抗性基因數(shù)據(jù)庫

https：//card.mcmaster.ca/

q）全球海洋微生物數(shù)據(jù)庫（TARAOceans）

https：///

參考文獻

[1]Crits—christoph，A.，Diamond，S.，Butterfield9C.N.，Thomas?B.C.&Banfield?J.F.Novelsoilbacteriapossessdiversegenesforsecondarymetabolitebiosynthesis.Nature558，440-444(2018).

[2]Fierer,N.etal.Comparativemetagenomic,phylogeneticandphysiologicalanalysesofsoilmicrobialcommunitiesacrossnitrogengradients.ISMEJ.6,1007-1017(2012).

[3]Handelsman,J.,Rondon,M.R.，Brady,S.F.，Clardy,J.&Goodman,R.M.Molecularbiologicalaccesstothechemistryofunknownsoilmicrobes:anewfrontierfornaturalproducts.Chem.Biol.5，R245-R249(1998).

[4]Lauber,C.L.，Zhou，N.，Gordon,J.I.&Knight，R.Effectofstorageconditionsontheassessmentofbacterialcommunitystructureinsoilandhumann-associatedsamples.FEMSMicrobiol.Rev.307,80-86(2010).

[5]Methe，B.A.etal.Aframeworkforhumanmicrobiomere