GDNFmRNA、GFR.α1mRNA在不同年齡大鼠SVZ和海馬表達(dá)的變化及其意義(一).doc

1、GDNFmRNA、GFR. 1 mRNA在不同年齡大鼠SVZ和海馬表達(dá)的變化及其意義 (一)作者：劉方舟，楊寧，朱巖，曾水林，潘秋輝，劉云龍摘要目的:觀察不同年齡SD 大鼠腦室管膜下區(qū)（SVZ）和海馬GDNFmRNA及其受體 GFR. 1mRNA表達(dá)水平的變化，探討其在神經(jīng)發(fā)生及腦老化中的作用。 方法 :用 RT.PCR方法檢測胚胎 18d、新生以及 1、3、8、12 月齡 SD大鼠 SVZ和海馬 GDNFmRNA及其受體 GFR. 1mRNA的變化。結(jié)果 :隨著年齡增長， SD大鼠 SVZ和海馬 GDNFmRNA及其受體 GFR.1mRNA表達(dá)水平逐漸降低。且各年齡組海馬表達(dá)參數(shù)的幅度小于

2、SVZ。結(jié)論 :GDNF及其受體 GFR.1在神經(jīng)發(fā)育及腦老化進(jìn)程中起到一定的作用。關(guān)鍵詞腦室管膜下區(qū) ;海馬 ;膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 ;膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體 . 1;大鼠近年來神經(jīng)科學(xué)研究的一項重要進(jìn)展是，發(fā)現(xiàn)成年哺乳動物腦內(nèi)某些特定區(qū)域在正常狀態(tài)下存在神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象。其中腦室管膜下區(qū)（ subventricularzone， SVZ）和海馬顆粒下層（ subgranularlayerzone，SGZ）已被證實是神經(jīng)前體細(xì)胞產(chǎn)生最為活躍的區(qū)域1，2。成年腦的神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象局限于特定的腦區(qū)，提示相關(guān)生發(fā)腦區(qū)的微環(huán)境可能對神經(jīng)發(fā)生起著重要作用。也有的研究證明微環(huán)境的變化與腦老化的過程相關(guān)

3、。腦的神經(jīng)發(fā)生與腦老化有可能就是微環(huán)境變化影響神經(jīng)前體細(xì)胞的結(jié)果。神經(jīng)生長因子是目前研究最多的調(diào)節(jié)因子，在體內(nèi)外，EGF、FGF、IGF.1等均可刺激 SVZ細(xì)胞增殖，甚至可以調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞的定向分化 3，4。轉(zhuǎn)化生長因子 . （transforminggrowthfactor. ， TGF.） 超 家 族 成 員 的 膠 質(zhì) 細(xì) 胞 源 性 神 經(jīng) 營 養(yǎng) 因 子（ glialcellline-de-rivedneurotrophicfactor ，GDNF）是現(xiàn)有神經(jīng)營養(yǎng)因子作用最強(qiáng)的一種 5，因其廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)作用及潛在的促神經(jīng)前體細(xì)胞分化作用而成為近年來的研究熱點。GDNF 的受體由

4、固定于質(zhì)膜外層的糖基磷脂酰肌醇（GPI），稱為 GDNF家族受體 1-4（GDNFfamilyrecep-tor 1-4，GFR.1-4）和 GDNF功能性受體孤兒酪氨酸 RET蛋白（由原癌基因 C.RET編碼）所組成。當(dāng) GDNF 結(jié)合于 GFR.（主要高親和性地結(jié)合于 GFR.1）時，通過招募 RET蛋白形成受體復(fù)合物激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑， 從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng) 6。另外研究發(fā)現(xiàn)， 缺乏 RET時，GDNF通過激活 GFR.1相關(guān) Src蛋白樣激酶途徑進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 7，故 GDNF 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有依賴和不依賴RET蛋白兩種方式，而GFR.1是兩者的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子?，F(xiàn)在已知中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可

5、塑性和修復(fù)能力隨年齡的增加而下降，神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象也隨年齡增加而降低，但作為具有廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)作用及潛在的促神經(jīng)前體細(xì)胞分化作用的GDNF及其受體 GFR.1，在不同年齡大鼠的表達(dá)水平是否與神經(jīng)發(fā)生有關(guān) ?其增齡變化目前還不是很清楚，尤其從分子水平研究 GDNF及其受體的增齡性變化尚未見報道。 本研究采用 RT.PCR方法觀察了不同年齡大鼠 GDNF 及其受體 GFR.1在SVZ、海馬的表達(dá)變化，探討其在神經(jīng)發(fā)生及腦老化進(jìn)程中的生物學(xué)意義。1 材料與方法1.1 材料RNA抽提試劑盒 TrizolReagent（Gibco），RT.PCR試劑盒（ TaKaRa），Tris堿、溴酚藍(lán)、 EB、EDTA

6、、瓊脂糖， SDS（上海生工生物工程公司） ，DEPC（Fluka 公司），DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DNAMarkerDL2000（TaKaRa）。GDNF分子引物序列 :上游引物5.GACTCCAATGTGCCCGAAGA，.下3游引物5 .CCTACCTTGTCACTTGCTAGCC，該.3引物產(chǎn)生394bp 的 cDNA 片段;GFR.1分子引物序列 :上游引物 5.CTGGAAAGATGAACCGATTG，.3下游引物 5.CTCTGTGAGAGGGTGAGAAG，該.3引物產(chǎn)生 290bp 的 cDNA片段。上述引物由作者潘秋輝設(shè)計。.actin分子引物序列 :上游引物5 .ATGCC

7、ATCCTGCGTCTGGACCTGGC.3， 下 游 引 物5.AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG，該.3引物產(chǎn)生 603bp 的 cDNA 片段，上述引物序列由上海生工生物工程公司合成。1.2 動物分組與取材SD大鼠每組 4 只，分為孕 18d（取胚胎）、新生以及 1、3、8、12 月齡 6 組（由中山大學(xué)第二附屬醫(yī)院實驗動物中心提供） 。孕 18d 組大鼠以0.4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，在體視顯微鏡下取出胚胎，快速分離胚胎大腦組織，顯微鏡下分離側(cè)腦室周圍區(qū)域與海馬，用0.01mol?L-1PBS液洗凈血液，快速勻漿，置于液氮中保存?zhèn)溆?。其? 組大鼠以 0.4%戊巴比妥

8、鈉腹腔注射麻醉，按Swanson大鼠腦圖譜 8，于坐標(biāo) bregma+1.45、bregma+0.45 處進(jìn)行定位，快速斷頭、剝離側(cè)腦室周圍區(qū)域（切取雙側(cè)側(cè)腦室外側(cè)壁自室腔面向外側(cè)，其厚度約為1.0mm）9與海馬組織，用 0.01mol? L1PBS液洗凈血液，快速勻漿，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?.3RNA抽提、 RT反應(yīng)及 PCR擴(kuò)增過程1.3.1 大鼠 SVZ、海馬組織 RNA的抽提分別取 50100mg 腦室管膜下區(qū)和海馬凍存腦組織，采用Trizol 一步法獲得 RNA，RT和 PCR反應(yīng)過程前取少量作紫外掃描分析和瓊脂糖電泳分析。1.3.2RT反應(yīng)在無 Rnasin的離心管中依次加入總RN

9、A2l和 DEPC處理水7.5 l，99變性 5min，冰浴 5min，然后加入終濃度為5mmol? L-1 的MgCl24l、1 RTbuffer2、1mmol?l L-1 的 dNTP2l、20U 的 rnasin0.5 、l15U 的 RT1l、Oligo（dT15）1l，42水浴 45min，99水浴 5min，然后冰浴 5min，產(chǎn)物置于 -20保存?zhèn)溆谩?.3.3PCR擴(kuò)增在 0.5ml 的薄壁離心管中依次加入 RT產(chǎn)物 2l、25mmol ? L-1 的 MgCl22l、10buffer4 、l終濃度為 0.2mmol? L-1 的 dNTP、 30 mol? L-1 的 Pri

10、mer（GDNF、GFR.1）.2 l、1U? l-1的 Taq酶 1.5 l、DEPC處理水 31.3 l、石蠟油 50l，瞬時離心后于 94反應(yīng) 7min，然后在 941min、541min 、721min 下反應(yīng) 35 個循環(huán)，最后在 72下反應(yīng) 10min。產(chǎn)物于 4下保存?zhèn)溆谩?.actin擴(kuò)增反應(yīng)同上述步驟，用作 RT.PCR檢測基因表達(dá)時的陽性對照。1.4PCR產(chǎn)物檢測與數(shù)據(jù)處理PCR產(chǎn)物 10l上樣于含溴化乙錠的 2%瓊脂糖凝膠，電壓降為 5V? cm-1，凝膠掃描系統(tǒng)進(jìn)行密度掃描后， 以對應(yīng)組 .actin密度為 100%對照校正，用凝膠圖像分析系統(tǒng)（ leica）進(jìn) 行擴(kuò)增產(chǎn)物半定量分析，得到GDNFmRNA、GFR. 1mRNA的光密度值，結(jié)果以 xs表示，用 t 檢驗比較各組標(biāo)本差異的顯著性。2 結(jié)果2.1 不同年齡大鼠 SVZ、海馬總 mRNA 分析在 1%瓊脂糖凝膠電