大腸癌早期診斷技術(shù)

1、Septin9基因甲基化結(jié)直腸癌早期診斷基因甲基化結(jié)直腸癌早期診斷 早發(fā)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)大腸癌早期發(fā)現(xiàn)大腸癌 無創(chuàng)傷無創(chuàng)傷無恐懼感無風險無恐懼感無風險 高靈敏高靈敏與腸鏡符合率與腸鏡符合率95.6% 易采樣易采樣僅需抽取靜脈血僅需抽取靜脈血 u已經(jīng)獲得了國際專利； u獲得了歐盟CE認證； u即將取得美國FDA認證，完成了近萬例臨 床試驗。 u美國和歐洲的著名臨床檢測中心已列為常 規(guī)檢測項目，至今已檢測幾十萬例。 u美國和歐洲已將此檢測列入醫(yī)療保險。 u國內(nèi)正在進行SFDA申報的臨床實驗。 u參與國內(nèi)重大課題“五癌”篩查國家項目， 并已經(jīng)啟動。 Epi公司Septin9基因甲基化進行結(jié)直 腸癌早

2、期診斷的國際認證 3 3 1 結(jié)直腸癌背景介紹 4 4 大腸是消化系統(tǒng)的最后 一部分，是一個長約1.5米的 較粗的管狀器官。大腸由兩 個主要部分組成：結(jié)腸和直 腸。它們在腹部彎曲病形成 一個圍繞著小腸的長方形。 世界范圍內(nèi)結(jié)直腸癌發(fā)病率與死亡率高 u癌癥是世界嚴重的公共衛(wèi)生問題，每年全球約800萬人死于癌癥，其中結(jié)直腸癌是 人類最常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第三位，隨著人口趨向老齡 化，生活水平日益提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變等因素的影響，在西方發(fā)達國家，結(jié)直腸 癌已成為僅次于肺癌的第二大惡性腫瘤。 u結(jié)直腸癌是腫瘤中第二大殺手，每年在美國有140,000新發(fā)病例，以及每年導(dǎo)致 50

3、,000人死亡； u在發(fā)達國家中，北美和歐洲發(fā)病率最高，每10萬人中就有15-20人死于結(jié)直腸癌； 中國結(jié)直腸癌發(fā)病率與死亡率呈急劇上升趨勢 u近十年發(fā)病率逐年攀升 u每年新發(fā)約40萬人 u每年死亡約19.5萬人 u每年增速約為4.2%，遠 超2%的國際平均水平 u已從第六位躍為第三位 u在上海是第二位，僅次于 肺癌2 1 2012 中國腫瘤登記年報 2 2013年第九屆上海國際大腸癌高峰論壇報道 結(jié)直腸癌早期篩查可以拯救生命 病人病人5 5年生存率年生存率 早期篩查73%73% 不做早期篩查46% u結(jié)直腸癌患者在診斷時，80%為中晚期， 早期診斷的比例僅為11.8%。 u有效的早期篩查和干

4、預(yù)治療可使癌的發(fā) 生率下降60%，病死率下降80% 篩查可提高結(jié)直腸癌篩查可提高結(jié)直腸癌5 5年生存率年生存率 Epigenomics AG Corporate Presentation 2013.1 中山大學附屬第一醫(yī)院監(jiān)測數(shù)據(jù) 北京大學腫瘤醫(yī)院，上海市疾控中心 李世榮, 大腸癌早期診斷的基本策略.繼續(xù)醫(yī)學教育, 2007. 21(9): p. 22-25 目前中國結(jié)直腸癌檢測主要有兩種方法：目前中國結(jié)直腸癌檢測主要有兩種方法： n便潛血檢測 (FOBT)和糞便免疫化學法（FIT）：主要針對消化道出 血；糞便樣本，采樣不方便；假陽性率高，結(jié)果穩(wěn)定性差；受檢率 3% n結(jié)腸鏡檢查: 雖然是檢測

5、金標準， 但患者對檢查有恐懼感，存在腸 道出血及感染等風險，依從性差； 左右半腸結(jié)果差異明顯。受檢率 5% n現(xiàn)有方法受檢率低，急需更易于患者接受的早期檢測方法。 結(jié)直腸癌的方法和面臨的主要問題 便潛血（FOBT) 檢測結(jié)腸鏡檢查 患者的需求？ 早發(fā)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)能夠早期發(fā)現(xiàn)大腸癌能夠早期發(fā)現(xiàn)大腸癌 無創(chuàng)傷無創(chuàng)傷沒有恐懼感，沒有風險沒有恐懼感，沒有風險 高靈敏高靈敏檢出率高檢出率高 易采樣易采樣不臟，不煩，不痛不臟，不煩，不痛 v我們提供的方法：我們提供的方法： v采采10ml10ml血樣血樣 v95.6%95.6%與腸鏡吻合與腸鏡吻合 v可檢測到可檢測到I I期結(jié)腸癌期結(jié)腸癌 v當日拿到檢測結(jié)果當

6、日拿到檢測結(jié)果 1010 2 Septin9基因檢測項目介紹 1111 1212 熒光定量PCR技術(shù) 包括 oligos, 聚合酶、 和專利的緩沖液 對照是基于博爾誠 提供的細胞系 基于磁珠提取及專利 的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化技術(shù) SEPTIN9SEPTIN9的生物學功能的生物學功能 人類SEPTIN (SEPT) 蛋白家族成員-13個 在在SeptinSeptin蛋白家族中，蛋白家族中， Septin9Septin9蛋白最明顯的蛋白最明顯的 特征：特征： 長延伸的N端可變區(qū) 非極性的脯氨酸富集區(qū) 缺少C端螺旋區(qū) Septin蛋白復(fù)合物的形成 Septin9 Septin9 獨特的結(jié)構(gòu)特征決定了其在復(fù)合

7、物中的位置獨特的結(jié)構(gòu)特征決定了其在復(fù)合物中的位置 缺少C端螺旋區(qū)的Septin9 蛋白，使其位于在八聚體復(fù)合中末端。 暴露的Septin9 N端可變區(qū)影響復(fù)合物的整體功能。 保守的Septin9 N端的脯氨酸富集區(qū)決定了復(fù)合物的非極性末端。 哺乳動物的Septin蛋白家族形成非極性、棒狀八聚體的復(fù)合物 （SEPT9-SEPT7SEPT6SEPT2SEPT2SEPT6SEPT7-SEPT9)。 SEPTIN蛋白復(fù)合物在細胞分裂期的作用 Septin蛋白復(fù)合物參與細胞分裂的功能： Cytoskeletal scaffold （細胞骨架的支架），平行于肌動蛋白應(yīng)力纖維（Actin filament）

8、，為參與肌球蛋白II（Myosin II）活性的分子提供附著點，參與Rho 信號通路，涉及細胞類型和功能變化。 Diffusion barrier（膜蛋白擴散障礙），束縛跨膜蛋白和胞內(nèi)膜蛋白的無序擴散。 腫瘤細胞具有很高的膜動力學特征。 若若Septin9Septin9蛋白蛋白失調(diào)，失調(diào)，SeptinSeptin蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定，從而擾亂細胞分裂過程，導(dǎo)蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定，從而擾亂細胞分裂過程，導(dǎo) 致細胞朝癌變發(fā)展致細胞朝癌變發(fā)展 甲基化5甲基胞嘧啶 基因啟動子區(qū)甲基化 效應(yīng)：基因表達下降或失活，蛋白水平下降效應(yīng)：基因表達下降或失活，蛋白水平下降 甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件 Epig

9、enetic changes resulting in transcriptional silencing of cancer genes are among the most frequently discovered evens in human tumor samples and altered chromain structure in 5-regulatory region. Hypermethylation of gene promoter associated CpG islands occurs early during colorectal cancer developmen

10、t, suggesting its utility as a molecular marker for both early detection and monitoring progression of the disease. - Glockner, S.C., et al., Cancer Research, 2009, 69:4691-9 在基因啟動子區(qū)域CpG島區(qū)域發(fā)生的甲基化事件，通 常發(fā)生在結(jié)直腸癌的早期，因此可以把甲基化作為 結(jié)直腸癌早期診斷和監(jiān)測疾病進展的分子標記物。 Septin9基因啟動子gamma區(qū)域的甲基化導(dǎo)致該基因的表達發(fā)生改變 發(fā)生甲基化的發(fā)生甲基化的septin

11、9septin9基基 因從腫瘤細胞中脫落，因從腫瘤細胞中脫落， 進入血管進入血管 血液血液 游離甲基化片段游離甲基化片段 和腫瘤細胞和腫瘤細胞 結(jié)直腸癌的癌變與septin9基因甲基化 游離游離DNADNA 血紅細胞血紅細胞 腫瘤細胞腫瘤細胞 德國EpiGenomics公司專利的外周血游離DNA甲基化檢測技術(shù)提 高了微量甲基化DNA檢測的靈敏度 Blocker引物屏蔽非甲基化的DNA，避免其與探針結(jié)合。 特異水解探針的應(yīng)用提高了血液中甲基化基因的檢出率。 德國Epigenomics公司在世界不同國家，包括 中國都申請了該技術(shù)的專利 游離的腫瘤游離的腫瘤 細胞細胞DNADNA 大腸大腸 血管血管

12、 Septin 9Septin 9基因基因 的甲基化在腫的甲基化在腫 瘤中特異發(fā)生瘤中特異發(fā)生 SEPTIN9 基因甲基化結(jié)直腸癌的檢測原理 n外周血采樣 n甲基化基因檢測 n熒光定量PCR法 n自動化結(jié)果判讀自動化結(jié)果判讀 腫 瘤 細 胞 正 常 細 胞 2424 CE數(shù)據(jù) 2011.9 德國埃爾 蘭根大學 醫(yī)學院 提交FDA關(guān)鍵 臨床數(shù)據(jù) FDA補充實驗 2012.12 病例對照 ARUP實驗室 腫瘤病 理分期 pT1 pT4 pT1 pT4 pT0/Tis pT4 pT0/Tis pT4 病例數(shù)2471847,940300144 敏感性80.6%179.3%68%171%190%2 特異

13、性99.3%199%80%186%188%2 注：CE要求是I期期腫瘤病人。FDA要求腺瘤，原位癌和I期期腫瘤病人。 1) Epigenomics AG Corporate Presentation 2013.1 2) Case control study results with ARUPs LDT test published Nov 16, 2011 國內(nèi)臨床驗證實驗顯示SEPTIN9檢測針 對中國人群同樣具有高靈敏性和特異性 總數(shù)靈敏性特異性 結(jié)直腸癌組4785.1% （4047) 健康正常組36100% （3636） u檢測樣本總數(shù)83例，包括47例結(jié)直腸癌和36例健康對照 u結(jié)果：

14、靈敏性85.1%，特異性100% SEPTIN9 檢測可檢出大部分早期大腸癌 Warren, J.D., et al., Septin 9 methylated DNA is a sensitive and specific blood test for colorectal cancer. BMC Med, 2011. 9: p. 133. SEPTIN9檢測結(jié)腸左右側(cè)無差異 左側(cè)腫瘤右側(cè)腫瘤 Septin9檢測96.4%94.4% 便潛血檢測83.3%50.0% Grutzmann, R., et al., Sensitive detection of colorectal cancer

15、in peripheral blood by septin 9 DNA methylation assay. PLoS One, 2008. 3(11): p. e3759. 2828 注：注：FIT 國內(nèi)不常用。國內(nèi)不常用。 這組數(shù)據(jù)結(jié)果是這組數(shù)據(jù)結(jié)果是Epigenomics在美國采用目前最先進靈敏度最高的試劑盒（日本產(chǎn)），受檢者連續(xù)三在美國采用目前最先進靈敏度最高的試劑盒（日本產(chǎn)），受檢者連續(xù)三 天取便樣，檢測天取便樣，檢測3次大便標本。次大便標本。 1)Chin J Gastroenterol，2001，Vo|6，No 4 244-251 2) Case control study re

16、sults with Epi proColon 2.0 final product published Sep 19, 2011 3) Case control study results with ARUPs LDT test published Nov 16, 2011 方法靈敏性特異性 Septin9 2,380.6%99.3% 愈刨木酯法gFOBT1 便潛血試驗 45.8%78.9% 免疫法iFOBT1 便潛血試驗 52.9%86.1% 免疫化學法 FIT(美國數(shù)據(jù)） 便潛血（3次便樣）2,3 68.2%70.6% 癌胚抗原CEA2、351.8%85.3% SEPTIN9結(jié)直腸癌檢測適

17、用于哪些人群 u1）一般風險人群：大于40歲人群 u2）高風險人群： 結(jié)直腸癌家族史和家族性腺瘤性息肉病,大于20歲 人群。 炎癥性腸病多年不愈、病變范圍較廣的潰瘍性結(jié) 腸炎 化放療治療效果評估，術(shù)后檢測。 u建議上述人群，每年進行一次結(jié)直腸癌早期篩查。 The Best Screening Test Is the Screening Test That Gets Done . 最好的篩查項目是容易操作的項目 -Sidney Winawer, MD Chief of Gastroenterology at Memorial Sloan Kettering Cancer Center ASCO

18、2001 The Best Test Is the Test the Patients Can Get and Will Take. 最好的檢測是病人能夠做并愿意做的檢測 -Durado Brooks American Cancer Society -2009 專家評語 SEPTIN9 結(jié)直腸癌篩查檢測周期短 DNA提取及亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化 5小時 整個結(jié)果在8小時內(nèi)完成 10ml10ml外周血外周血 SEPTIN9 結(jié)直腸癌篩查就診流程 u與腸鏡檢測“優(yōu)勢互補”，提高腸鏡的一次陽性檢出率 u與腸鏡檢測有很高的符合率 可使用的四種熒光定量PCR儀 Applied Biosystems 7500 Fast Dx 配有SDS 1.4軟件帶有 21 CFR part 11 Roche LightCycler 480 Instrument I Software Version 1.5 Roche LightCycler 480 Instrument II Software Version 1.5 Applied Biosystems 7500 Fast 配有SDS 1.4軟件 SEPTIN9 結(jié)直腸癌早期篩查 早發(fā)現(xiàn)、無創(chuàng)傷、高靈敏、易采樣 世界上獨一無二的甲基化基因外周血檢測方法