蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

1、-蛋白互作網(wǎng)其原理是當(dāng)靶蛋白和蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用構(gòu)成了細胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的一個主要組成部分，蛋白spaces 空間上的一篇蛋白質(zhì)與蛋白(另補充 2 ：檢測兩種蛋白質(zhì)之間絡(luò)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對調(diào)控細胞及其信號有重要意義。把原來質(zhì)間相互作用研究方法轉(zhuǎn)來，算是實驗技巧分類目錄的首篇。相互作用的實驗方法比較 )、酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)研究的一種重要方法。誘餌蛋白特異結(jié)合后，誘餌蛋白結(jié)合于報道基因的啟動子，啟動報道基因在酵母細胞內(nèi)的表達， 如果檢測到報道基因的表達產(chǎn)物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。 將這種技術(shù)微量化、 陣列化后則可用于大規(guī)

2、模蛋白質(zhì)之間相互作用的研究。在實際工作中， 人們根據(jù)需要發(fā)展了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)等。 Angermayr 等設(shè)計了一個 SOS 蛋 白介導(dǎo)的雙雜交系統(tǒng)?？梢匝芯磕さ鞍椎墓δ?，豐富了酵母雙雜交系統(tǒng)的功能。 此外， 酵母雙雜 交系統(tǒng)的作用也已擴展至對蛋白質(zhì)的鑒定。二、噬茵體展示技術(shù)在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當(dāng)噬菌體生長時，表面就表達岀相應(yīng)的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若含目的蛋白，就會與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，這被稱為噬菌體展示技術(shù)。 此技術(shù)也主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，不僅有高通量及簡便的特點， 還具有直接得到基因、 高選擇性的篩選復(fù)雜混合物、 在

3、篩選過程中通過適當(dāng)改變條件可以直接評價相互 結(jié)合的特異性等優(yōu)點。 目前， 用優(yōu)化的噬菌體展示技術(shù)， 已經(jīng)展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的cDNA文庫，并分離岀了人上皮生長因子信號傳導(dǎo)途徑中的信號分子。三、等離子共振技術(shù)表面等離子共振技術(shù) (Surface Plasmon Reso nan ce,SPR)已成為蛋白質(zhì)相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種納米級的薄膜吸附上“誘餌蛋白”，當(dāng)待測蛋白與誘餌蛋白結(jié)合后， 薄膜的共振性質(zhì)會發(fā)生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結(jié)合情況。SPR技術(shù)的優(yōu)點是不需標(biāo)記物或染料， 反應(yīng)過程可實時監(jiān)控。 測定快速且安全， 還可用于檢測蛋白一核酸及其它生物大分子之間

4、的相互作用。四、熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ FRET ）廣泛用于研究分子間的距離及其相互作用; 與熒光顯微鏡結(jié)合，可定量獲取有關(guān)生物活體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類、DNA和RNA的時空信息。隨著綠色熒光蛋白（ GFP的發(fā)展， FRET 熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內(nèi)分子的動態(tài)性質(zhì)。提出了一種定量測量FRET效率以及供體與受體間距離的簡單方法， 僅需使用一組濾光片和測量一個比值， 利用供體和受體 的發(fā)射譜消除光譜間的串?dāng)_。該方法簡單快速，可實時定量測量FRET 的效率和供體與受體間的距離，尤其適用于基于 GFP 的供體受體對。五、抗體與蛋白質(zhì)陣列技術(shù)蛋白芯片技術(shù)的出現(xiàn)給蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來新的思路

5、。蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一個主要的內(nèi)容就是研究在不同生理狀態(tài)下蛋白水平的量變， 微型化， 集成化，高通量化的抗體芯片就是一個非常好的 研究工具， 他也是芯片中發(fā)展最快的芯片， 而且在技術(shù)上已經(jīng)日益成熟。 這些抗體芯片有的已經(jīng) 在向臨床應(yīng)用上發(fā)展，比如腫瘤標(biāo)志物抗體芯片等，還有很多已經(jīng)應(yīng)用再眼就的各個領(lǐng)域里。六、免疫共沉淀技術(shù)免疫共沉淀主要是用來研究蛋白質(zhì)與 蛋白質(zhì)相互作用 的一種技術(shù)， 其基本原理是， 在細胞裂解液 中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于Pansobin 珠上的金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA），若細胞中有正與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復(fù)合物：“目的蛋

6、白興趣蛋白抗興趣蛋白抗體|Pansobin ”，因為 SPA|Pansobin 比較大，這樣復(fù)合物在離心時就被分離出來。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物四組分又被分開。然后經(jīng)Western blotting法，用抗體檢測目的蛋白是什么，是否為預(yù)測蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內(nèi)天然與興趣蛋白結(jié)合的， 符合體內(nèi)實際情況， 得到的蛋白可信度高。 但這種方法有 兩個缺陷： 一是兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合， 而可能有第三者在中間起橋梁作用； 二是 必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實驗就得不 到結(jié)果，方法本身具有冒險性。七、pull-down 技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用的類型有牢固型相互作用和暫時型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復(fù)合體常見， 最好通過免疫共沉淀 （ Co-IP ） 、 Pull-down 技術(shù)或 Far-western 法研究。 Pull-down 技術(shù)用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋白或標(biāo)簽蛋白（生物素-、PolyH