MDA 多重置換擴(kuò)增技術(shù)

1、多重置換擴(kuò)增（多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)對單）技術(shù)對單 細(xì)胞基因組測序技術(shù)研究進(jìn)展細(xì)胞基因組測序技術(shù)研究進(jìn)展 北大腫瘤醫(yī)院病因?qū)W教研室 （山東省千佛山醫(yī)院） 田源 基因測序技術(shù)基因測序技術(shù) 目前應(yīng)用的快速序列測定技術(shù)可以總的概括為兩 種：合成法和降解法?；赟anger等（1977）提 出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化學(xué)降解 法這兩種基本思想。 傳統(tǒng)用于DNA測序的方法有毛細(xì)管微陣列電泳測 序和焦磷酸測序等，這些方法往往技術(shù)要求高、 成本貴，而且容易出錯。 截至2007年，第二代基因測序方法已經(jīng)普遍推廣應(yīng)用，極 大地降低了測序的成本和時間，實(shí)現(xiàn)了高通量測序。 2008年

2、又提出了更快更好的第三代測序方法-單分子測序 （SMS） 基因測序技術(shù)基因測序技術(shù) 基因測序需要一定量的DNA模板，所以測序前需對微生 物進(jìn)行分離和培養(yǎng)，但是環(huán)境中大多數(shù)的微生物是不可 培養(yǎng)或?qū)ε囵B(yǎng)條件要求很高的，這無疑給測序增添了難 度。 單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)：單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)：通過一種叫做全基因組擴(kuò)增 技術(shù)，不需要進(jìn)行微生物培養(yǎng)，可以直接擴(kuò)增放大單個 細(xì)菌中的DNA獲得作為模板所需的微克DNA 。 單細(xì)胞全基因組測序單細(xì)胞全基因組測序 單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)：單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)：是在單細(xì)胞水平對 全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測序的一項(xiàng)新技術(shù)。 其原理是將分離的單個細(xì)胞的微量全基因組 DN

3、A進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)行擴(kuò)增，獲得高覆蓋率的完整的基因組 之后通過外顯子捕獲進(jìn)而高通量測序用于揭示 細(xì)胞群體差異和細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系。 全基因組擴(kuò)增技術(shù) 全基因組擴(kuò)增技術(shù)主要分為兩種類型： 一是基于熱循環(huán)以PCR為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技術(shù)，如簡并 寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR)、連接反應(yīng)介導(dǎo)的PCR (LM-PCR)、擴(kuò)增前引物延伸反應(yīng) (PEP)等； 一是基于等溫反應(yīng)不以PCR為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技術(shù)，如 多重置換擴(kuò)增 (MDA) 和基于引物酶的全基因組擴(kuò)增 (pWGA)。 通過MDA擴(kuò)增DNA 多重置換擴(kuò)增多重置換擴(kuò)增(Multiple dilacement amplification，MDA)是1998 年由耶魯

4、大學(xué)Lizardi博士首次提出。這種恒溫擴(kuò)增的方法依賴 于鏈置換擴(kuò)增鏈置換擴(kuò)增原理，利用噬菌體29DNA聚合酶，高度擴(kuò)增 DNA。該酶對于模板有很強(qiáng)的模板結(jié)合能力，能連續(xù)擴(kuò)增 100Kb 的DNA模板而不從模板上解離。同時這種酶具有3 -5外 切酶活性，錯誤率僅為5 x 10-6，大約比Taq DNA聚合酶低100倍， 因此可以保證擴(kuò)增的高保真性。 29DNA聚合酶強(qiáng)大的向前延伸活性和高保真度，使得通過 MDA可從極少量的DNA樣本獲取大量高質(zhì)量的DNA，是到目 前為止對整個基因組覆蓋最廣、各位點(diǎn)擴(kuò)增偏倚最小的WGA方 法。 目前單細(xì)胞微生物可以通過對多重置換擴(kuò)增反應(yīng)多重置換擴(kuò)增反應(yīng)（ MDA

5、）得到 的擴(kuò)增DNA進(jìn)行測序。 在細(xì)菌中幾個飛克 (10-15g)的DNA能擴(kuò)增得到微克(10-6g)的高分 子量DNA，擴(kuò)增得到的DNA 適合DNA文庫的構(gòu)建和Sanger測序。 MDA生成的DNA也可直接作為模板供焦磷酸測序。 單個細(xì)胞間基因序列的聯(lián)系也是一個功能強(qiáng)大的工具，它可用 于對從環(huán)境DNA的提取物（宏基因組序列）得到的多重有機(jī)體 通過鳥槍法測序來指導(dǎo)構(gòu)建基因芯片。 多重置換擴(kuò)增（多重置換擴(kuò)增（MDA）的示意圖）的示意圖： 首先隨機(jī)六堿基引物在多個位點(diǎn)與模板DNA退火，接 下來Phi 29 DNA 聚合酶在DNA的多個位點(diǎn)同時起始復(fù)制， 它沿著DNA模板合成DNA,同時取代模板的互

6、補(bǔ)鏈。被置換 的互補(bǔ)鏈又成為新的模板來進(jìn)行擴(kuò)增，因此最終我們可以 獲得大量高分子量的DNA. 模板 引物 引物 多重置換擴(kuò)增多重置換擴(kuò)增 (MDA) MDA是目前公認(rèn)的最好的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)，它能對全基因組進(jìn) 行高保真的均勻擴(kuò)增，擴(kuò)增出10100kb大小的片段，能提供大量均一 完整的全基因組序列。 但是MDA也有一些缺點(diǎn)，特別是顯著的非特異擴(kuò)增，往往空白對照樣 品也總是“無中生有”地產(chǎn)生大量的DNA，另外就是仍然存在序列偏 差。盡管各種改進(jìn)的策略正在逐步減少這些缺陷，高覆蓋率、高保真 性及高特異性的擴(kuò)增仍然是亟待解決的問題。 另外，對測序得到 的大量數(shù)據(jù)結(jié)果的專業(yè)分析也是一個重大的挑戰(zhàn)。

7、單細(xì)胞全基因組測序正在從基礎(chǔ)研究走向臨床應(yīng)用。 多重置換擴(kuò)增技術(shù)（MDA） 多重置換擴(kuò)增（多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplification，MDA）的）的 技術(shù)：技術(shù)： 不需要進(jìn)行微生物培養(yǎng)，可以直接擴(kuò)增放大單個細(xì)菌中的DNA 獲得作為模板所需的微克DNA 。 整個實(shí)驗(yàn)包括： 環(huán)境樣品的準(zhǔn)備、單細(xì)胞分離、MDA擴(kuò)增DNA、DNA測序等。 環(huán)境樣品的處理環(huán)境樣品的處理 富集環(huán)境樣品中的微生物片段以利于分離單個細(xì)胞。 分離單細(xì)胞前土壤先經(jīng)過密度梯度離心預(yù)處理。如果 是水樣本，假如對生物體濃度有要求則要考慮附帶過 濾。 離心、液體加壓沖擊法、過濾和靜電沉積法 。

8、液壓沖擊型空氣收集器可使細(xì)胞懸浮在用于分離單細(xì) 胞的溶液中，可高效地捕獲液體基質(zhì)中1-10m的微粒。 分離單細(xì)胞 根據(jù)所需要的生產(chǎn)量、環(huán)境以及靶生物體等情況，可以通過采 用稀釋法、熒光活性細(xì)胞篩選（FACS）、顯微操作和微流體分 離到單個細(xì)胞用于MDA，采用FACS可以在一分鐘內(nèi)分離到上 千個細(xì)胞。 單細(xì)胞分離結(jié)合熒光原位雜交（FISH）可以富集特異的菌屬， 機(jī)械的顯微操作（基于體外受精的裝備）結(jié)合現(xiàn)代研究顯微鏡 方法可以高效地分離到單細(xì)胞，如跟FISH結(jié)合從環(huán)境樣本中篩 選出特異的種類用于MDA擴(kuò)增單細(xì)胞DNA實(shí)驗(yàn)。 流式細(xì)胞儀的測量對象流式細(xì)胞儀的測量對象 大小 懸浮在溶液中的相互離散顆粒

9、。 大小范圍：0.2uM-300uM。 對象類型 細(xì)胞類型： （1） 高等真核細(xì)胞； （2）酵母； （3）細(xì)菌； （4）多細(xì)胞的聚集體，如胰島等。 非生命顆粒： 細(xì)胞核、染色體、和其它細(xì)胞器以及乳化微球等。 全基因組擴(kuò)增(WGA)是一組對全部基因組序列進(jìn)行非選擇性擴(kuò)增的技 術(shù)，其目的是在沒有序列傾向性的前提下大幅度增加DNA 的總量。 該技術(shù)通過對微量組織樣本，甚至單個細(xì)胞的整個基因組DNA擴(kuò)增， 再將其擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行后續(xù)分析，進(jìn)而完成多位點(diǎn)、多基因 以及全基因組DNA 組成的研究。 WGA技術(shù)發(fā)展至今主要IRS-PCR(interspersed repeat sequence PCR

10、 )、 LA-PCR(1inker adaptor PCR)、Alu PCR、T-PCR (tagged random primer PCRT-PCR)、擴(kuò)增前引物延伸(primer extension preamplification， PEP)和簡并寡核苷酸引物PCR (degenerate oligonucleotide primer-PCR， DOP-PCR)。但是，由于發(fā)生非特異性擴(kuò)增，位點(diǎn)覆蓋不完全，DNA 產(chǎn)物片段小于1 kb等缺點(diǎn)，限制了這些方法的應(yīng)用。 初始模板量分別為：0.1ng,1ng,10ng,100ng，產(chǎn)量均為40g左右。 MDA 反應(yīng)的產(chǎn)量 受起始DNA濃度的 影

11、響較小，Dean等 通過對不同量的模 板DNA進(jìn)行MDA 反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)終產(chǎn)量 較一致。這對于大 范圍的遺傳學(xué)應(yīng) 用十分有利，因?yàn)?不需要測量或平衡 DNA濃度而直接進(jìn) 行擴(kuò)增，而能產(chǎn)生 同樣量的DNA。 MDA的應(yīng)用 SNPs和STRs基因型檢測 基因拷貝數(shù)改變的檢測 DNA測序 總的來說，MDA 由于其基因型的可靠性、高敏感性、高基因組覆蓋 率以及較低的擴(kuò)增偏向性等優(yōu)點(diǎn)，使得該方法成為目前最有優(yōu)勢的 WGA方法。MDA 已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于包括定量PCR、SNP基因型分 析、Southern印跡分析、染色體圖譜中。 基于基于MDA的單細(xì)胞測序的單細(xì)胞測序 主要研發(fā)人：深圳華大基因研究院 技術(shù)看點(diǎn)：

12、將多重置換擴(kuò)增(MDA)和測序技術(shù)相結(jié)合。 技術(shù)簡介： 本技術(shù)基于多重置換擴(kuò)增(MDA)，并對該方法的擴(kuò)增均一性、靈敏度、特異性等 方面進(jìn)行了全面評估。這種將多重置換擴(kuò)增和測序技術(shù)相結(jié)合的單細(xì)胞測序方 法不僅具有更高的分辨率和基因組覆蓋度，而且具有更好的敏感性和特異性。 該方法從單核苷酸水平上為各種復(fù)雜疾病和生物學(xué)過程的研究開辟了新思路。 技術(shù)論文： Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Negative Myeloproliferative Neoplasm Single-Cell Exome Sequ

13、encing Reveals Single-Nucleotide Mutation Characteristics of a Kidney Tumor MDA的應(yīng)用 MDA的應(yīng)用 2012年，華大基因首次利用以MDA為基礎(chǔ)的單細(xì)胞測序技術(shù)對原發(fā)性血小板 增多癥(essential thrombocythemia, ET)病人的單個骨髓細(xì)胞進(jìn)行了測序并分析， 篩查出在ET發(fā)病和進(jìn)展中的驅(qū)動基因, 從而證實(shí)ET為單克隆來源的疾病1。同 時，也將該方法與經(jīng)典方法進(jìn)行比較，從而建立了具有高敏感性、高特異性、 假陽性率低等特點(diǎn)的單細(xì)胞測序方法，為分析疾病的遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)特征及克 隆 進(jìn)化過程提供了新的思路。

14、同樣的方法也用于分析單個腎癌細(xì)胞的單核苷酸 突變特征，從而在更高的分辨能力上為評價基因改變的復(fù)雜性提供了更為優(yōu) 化的方法 1Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Negative Myeloproliferative Neoplasm 近來對MDA 方法的改進(jìn)： 減少M(fèi)DA的反應(yīng)體積：通過減少污染的擴(kuò)增DNA和非特異性的合成，如引 物二聚體，本質(zhì)上就是通過消除不必要的反應(yīng)體積增強(qiáng)特異性的擴(kuò)增。 通過使用60 nl微流控反應(yīng)可提高擴(kuò)增的特異性。 在MDA中，分支的DNA 中間體的形成可導(dǎo)致在一些對初始模板D

15、NA鏈的 延長，然后被置換并對一個不同的模板延長，其結(jié)果是形成嵌合體。完 整的MDA反應(yīng)物和S1核酸酶處理后可以消除DNA的單鏈形式，這可使使嵌 合體達(dá)到80的減少。 對嵌合體形成酶路徑的了解目前正被用來減少嵌合體的發(fā)生。 微流控芯片微流控芯片 微流控芯片采用類似半導(dǎo)體的微機(jī)電加工技術(shù)在芯片上構(gòu)建微流路系統(tǒng),將實(shí)驗(yàn) 與分析過程轉(zhuǎn)載到由彼此聯(lián)系的路徑和液相小室組成的芯片結(jié)構(gòu)上。加載生 物樣品和反應(yīng)液后,采用微機(jī)械泵、電水力泵和電滲流等方法驅(qū)動芯片中緩沖 液的流動,形成微流路,于芯片上進(jìn)行一種或連續(xù)多種的反應(yīng)。激光誘導(dǎo)熒光、 電化學(xué)和化學(xué)等多種檢測系統(tǒng)以及與質(zhì)譜等分析手段結(jié)合的很多檢測手段已 經(jīng)被

16、用在微流控芯片中,對樣品進(jìn)行快速、準(zhǔn)確和高通量分析。 微流控芯片的最大特點(diǎn)是在一個芯片上可以形成多功能集成體系和數(shù)目眾多的復(fù) 合體系的微全分析系統(tǒng)。微型反應(yīng)器是芯片實(shí)驗(yàn)室中常用的用于生物化學(xué)反 應(yīng)的結(jié)構(gòu),如毛細(xì)管電泳、聚合酶鏈反應(yīng)、酶反應(yīng)和DNA 雜交反應(yīng)的微型反應(yīng) 器等。 近日， Nature出版集團(tuán)旗下刊物Scientific Reports刊發(fā)南方科技大學(xué)副 教授賀建奎賀建奎課題組最新研究成果單細(xì)胞基因組擴(kuò)增法的定量評估及 其在檢測單個海馬神經(jīng)元基因拷貝數(shù)變異的應(yīng)用，從多個角度評估 了三種最常用的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增方法。經(jīng)過細(xì)致比較發(fā)現(xiàn)， MALBAC和GenomePlex WGA4的方法

17、在拷貝數(shù)變異檢測方面明顯優(yōu)于 MDA方法。 (Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles,多重退火和多重退火和 成環(huán)循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)成環(huán)循環(huán)擴(kuò)增技術(shù))MALBAC:哈佛大學(xué)終身教授、美國科學(xué)院院士謝曉 亮（Sunney Xie）教授研發(fā)。 技術(shù)論文：PMID: 23258894 Amplification of Break-points PacBio RS測序系統(tǒng)是基于單分子實(shí)時測序技術(shù)（SMRT）和納米微孔應(yīng) 用的第三代測序平臺。SMRT技術(shù)以單分子為單位，實(shí)時地傳導(dǎo)、記 錄并分析帶熒光標(biāo)記的測序反應(yīng)；納米微孔技術(shù)保證了單一

18、熒光信號 強(qiáng)大的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確率。 許多實(shí)體瘤和惡性血液病患者的癌癥基因組中都存在著腫瘤抑制基因 缺失和其他染色體重組現(xiàn)象，而重組的斷點(diǎn)在個體間存在著很大差異， 例如常見的CDKN2A基因缺失。結(jié)構(gòu)變異中斷裂位點(diǎn)的特征可以作為 一種有用的腫瘤生物標(biāo)記物1。 1.Amplification and thrifty single-molecule sequencing of recurrent somatic structural variations Amplification of Break-points 文章中提出了一種專門針對異質(zhì)性腫瘤和生殖細(xì)胞樣本中SV斷 點(diǎn)的方法，稱為AmBre（Amplification of Break-points）。 AmBre方法是通過PCR擴(kuò)增SV（structure variation）斷裂位