轉(zhuǎn)座子插入敲除PPT優(yōu)秀課件

1、轉(zhuǎn)座子(transposon)是存在于DNA上可自 主復(fù)制和移位的基本單位。 由Barbara McClintock 在20世紀40年代首 次從玉米中發(fā)現(xiàn)，從此改變了人們對基因 組序列穩(wěn)定性的認識，打破了遺傳物質(zhì)在 染色體上呈線性固定排的傳統(tǒng)理論。 1983年McClintock因發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子被授予諾 貝爾獎 1 2 3 特點： 1、所有生物的染色體都有轉(zhuǎn)座子 2、轉(zhuǎn)座相關(guān)序列可以占據(jù)物種基因的很大 一部分，如人和玉米基因組的50%以上是由 轉(zhuǎn)座相關(guān)序列組成 3、轉(zhuǎn)座子的含量在不同基因組中變化很大 4、當轉(zhuǎn)座子移位時，轉(zhuǎn)座因子通常對插入 位點幾乎沒有序列選擇性 4 轉(zhuǎn)座子類型： 1、DNA轉(zhuǎn)座子

2、 2、類病毒反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 3、聚腺苷酸（poly-A）反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 5 6 轉(zhuǎn)座機制： 1、剪切-粘貼機制 2、復(fù)制-粘貼機制 7 插入突變 轉(zhuǎn)座子插入突變是利用轉(zhuǎn)座子在染色體上可移 動的特點，當其跳躍插入到某個功能基因內(nèi)部 或鄰近位點時時，就會引起該基因的失活，并 誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型。 因此我們可以利用某些能隨機插入基因序列的 轉(zhuǎn)座子，在目標細胞基因組中進行隨機插入突 變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然 后通過相應(yīng)的標記（如Tn5轉(zhuǎn)座子含kan抗性基 因）進行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細胞。 8 9 10 睡美人轉(zhuǎn)座子(sleeping bueaty,轉(zhuǎn)座子SB)已證明在小鼠和人細胞中 可以激

3、活,轉(zhuǎn)座子插入新的位點后，該位點附近的基因即受到抑制 呈現(xiàn)隱性的“睡美人”表型。 一旦轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座酶的作用下從這一位點上轉(zhuǎn)走，該位點的基因 隱性表型又恢復(fù)為顯性表型，即“睡美人蘇醒”。調(diào)控轉(zhuǎn)座酶和 轉(zhuǎn)座子活性的系統(tǒng)稱為青蛙王子(Frog Prince)。 用特異的開放閱讀框捕獲技術(shù)，可以使自然散在的轉(zhuǎn)座酶編碼基 因高表達，人為催化激活轉(zhuǎn)座子使其蘇醒，執(zhí)行插入、切除等任 務(wù)。目前已經(jīng)應(yīng)用于微生物、昆蟲、植物、動物及人類基因組功 能的研究。例如蛙類基因組含有Tcl水手轉(zhuǎn)座子超家族，呈自然失 活狀態(tài)，轉(zhuǎn)座酶與轉(zhuǎn)座增強子序列末端結(jié)合,在HMGBI蛋白協(xié)助下， 激活轉(zhuǎn)座子，使睡美人轉(zhuǎn)座子蘇醒。 11 使

4、用轉(zhuǎn)座子進行插入突變的優(yōu)點有： （1 ）轉(zhuǎn)座子能夠在轉(zhuǎn)座酶的存在下從插入位點剪切下來，造成突 變體反轉(zhuǎn)。采用這種方法可進一步確證突變體表型是否由轉(zhuǎn)座子 插入突變引起。 （2）大多數(shù)轉(zhuǎn)座的位點偏好于連鎖位點，所以如果有一個可轉(zhuǎn)座 的元件靠近目的基因，那么可轉(zhuǎn)座的元件即會高效地移動并插入 目的基因。因此，即使在突變體庫中沒有發(fā)現(xiàn)期望的插入位點， 仍可以采用轉(zhuǎn)座子在連鎖位點上的轉(zhuǎn)座獲得目的基因被插入失活 的品系。 （3 ）當一個基因家族的多個成員沿染色體串連排列時，可采用復(fù) 制型的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)創(chuàng)建該基因家族全部成員均被敲除的突變體。 12 隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，早期技術(shù)中的許多 不足和缺陷都已經(jīng)解決，但基因敲除技術(shù)始終 存在著一個難以克服的缺點，即敲掉一個基因 并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括： 一方面，許多基因在功能上是冗余的，敲掉一 個在功能上冗余的基因，并不能造成容易識別 的表型，因為基因家族的