總RNA的提取和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告.doc

1、。實(shí)驗(yàn)二總 RNA的提取和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握從動(dòng)物組織細(xì)胞中提取總 RNA的方法；2. 熟悉紫外吸收法檢測(cè) RNA濃度與純度的原理及測(cè)定方法；3. 掌握 RNA瓊脂糖凝膠電泳方法并分析總 RNA的電泳圖譜；實(shí)驗(yàn)原理（一）概述1. 10 -5 g RNA/細(xì)胞含有 rRNA 80-85%： 28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15%mRNA 1-5%2. mRNA3端存在 20-250 個(gè)多聚腺苷酸 (polyA) 結(jié)構(gòu)，可用 oligo(dT) 親和層析柱分離 mRNA。3.RNA 分離的方法：異硫氰酸胍氯化銫超速離心法，鹽酸胍- 有機(jī)溶劑法，氯化鋰 - 尿素法，蛋白酶K-

2、細(xì)胞質(zhì) RNA提取法、異硫氰酸胍 - 酚- 氯仿一步法等。4. 目前常用的是 Trizol 法。（二） Trizol 的主要成分1.Trizol是一種新型總 RNA 抽提試劑，主要成分是異硫氰酸胍和苯酚。異硫氰酸胍屬于解偶劑， 是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)， 其主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白/ 核酸物質(zhì)解聚得到釋放。2. 酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制 RNA酶活性，因此 Trizol 中還加入了 8- 羥基喹啉、 - 巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源 RNase。3. 溶解組織細(xì)胞的混合物在氯仿作用下溶液分為水相和有機(jī)相， RNA在上層水相中。4. 取出水相用異丙醇沉淀可

3、回收 RNA；用乙醇沉淀中間層可回收 DNA。( 三) 總 RNA的純度檢測(cè)原理：不同波長(zhǎng)的單色光通過(guò)溶液時(shí)其光的能量就會(huì)被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系。RNA在 260nm紫外光波長(zhǎng)處有最大的吸收峰。1。因此，可以用 260nm波長(zhǎng)分光測(cè)定 RNA濃度，OD值為 1 相當(dāng)于大約 40g/mL 的單鏈 RNA。用 PH=7.6 的 TE（tris HCl 緩沖液）稀釋 RNA樣品 n 倍并以 TE為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的 OD 260 值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度 : RNA (mg/mL) = 40 OD 260 讀數(shù)稀釋倍數(shù) (n)/1000實(shí)驗(yàn)步驟（一

4、）樣品處理與Trizol用量1. 提取組織 RNA時(shí)，每 50100mg組織（即 0.5 0.5 0.5cm, 約合 0.1cm3）用1ml Trizol試劑對(duì)組織進(jìn)行裂解；2. 懸浮細(xì)胞先離心沉淀，每 5-10 106 個(gè)細(xì)胞加 1mL Trizol 后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞。3. 培養(yǎng)貼壁細(xì)胞不須消化，可直接用 Trizol 進(jìn)行消化、裂解， Trizol 體積按10cm2/mL比例加入。 ( 注意：勻漿一定要徹底，是提取高質(zhì)量 RNA的前提；細(xì)胞數(shù)量與 Trizol 的比例，細(xì)胞的數(shù)量不能過(guò)多。 )（二）操作步驟1.細(xì)胞中加入 1 mLTrizol 用移液槍反復(fù)吹吸直無(wú)明顯沉

5、淀后，室溫放置5min，使其充分裂解。（注意：此時(shí)可放入 -70 長(zhǎng)期保持）2.按 200 L 氯仿 /mL Trizol 加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置2-3min 。 ( 注意：此步一定要振蕩混勻，使氯仿和Trizol不分層 )3. 4 12,000g 離心 5-10min 。樣品分為三層：底層為黃色（紅或綠）有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。 RNA主要在水相中，水相體積約為所用 Trizol試劑的 60。4. 吸取上層水相，至另一新的離心管中。一般400-450 L 就足夠了，千萬(wàn)不要貪多?。ㄗⅲ呵f(wàn)不要吸取中間界面）5. 加入與水相等體積異丙醇后，上下顛倒混勻，4放置 5 min 。

6、7.4 12,000g 離心 10 min ，棄上清，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。8. 加入 1 mL 75%乙醇，（在沉淀對(duì)面管壁加入，切勿觸及沉淀！ ）蓋緊蓋子后，溫和轉(zhuǎn)離心管 1 周，充分潤(rùn)洗管壁。9.4 12,000g 離心 5 min ，盡量棄上清。10. 室溫晾干或真空干燥5 min 。（注： RNA樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解）。2。11. 加入適量冰冷無(wú) RNase的 PEPC水（一般 10 -20 L），充分震蕩混勻，瞬時(shí)離心，備用。（三）檢測(cè)步驟1. 將提取的 RNA，按 1：20 加入 TE進(jìn)行稀釋2. 稀釋過(guò)后用分光光度儀進(jìn)行檢測(cè)，先使用 TE行進(jìn)校對(duì)，空白對(duì)照，所有樣品要先潤(rùn)洗三次之后，再加入50L 樣液進(jìn)行檢測(cè)3. 可直接顯示 260nm下的 OD值以及， 260/280 的對(duì)比結(jié)果4. 再將剩余未稀釋的 RNA提取液，進(jìn)行