酮洛芬對(duì)錦鯽的環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

1、摘 要酮洛芬作為一種抗炎藥被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域中，因其具有生物累積性而在環(huán)境中長(zhǎng)期存在。本實(shí)驗(yàn)選擇酮洛芬(Ketoprofen，簡(jiǎn)稱(chēng)KP)和錦鯽作為實(shí)驗(yàn)材料，在室內(nèi)模擬條件下進(jìn)行半靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn)，研究低濃度10 mg/kg、高濃度100 mg/kg的酮洛芬對(duì)錦鯽肝臟抗氧化防御系統(tǒng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在KP 10mg/kg時(shí)，錦鯽的SOD酶活性均受到抑制，CAT酶活性先抑制后誘導(dǎo)上升，這說(shuō)明錦鯽的抗氧化防御系統(tǒng)損傷并不明顯；在KP100mg/kg時(shí)，錦鯽SOD酶活性均受到抑制，CAT酶活性先誘導(dǎo)后抑制下降，這說(shuō)明了錦鯽的抗氧化損傷不明顯。這表明了更高濃度的KP或者更長(zhǎng)的暴露時(shí)間才會(huì)對(duì)錦鯽的SOD、

2、CAT酶活性起到顯著的抑制作用，但這些體內(nèi)表征的變化都說(shuō)明了酮洛芬會(huì)造成錦鯽肝臟的氧化損傷。關(guān)鍵詞：錦鯽；抗氧化防御系統(tǒng)；酮洛芬；SOD；CATAbstractKetoprofen is widely used as an anti inflammatory drug in the field of medicine and has long been found in the environment due to its bioaccumulation. Ketoprofen Ketoprofen Ketoprofen Ketoprofen (KP) and Carassius Auratu

3、s Gibelio were selected as experimental organisms to carry out semi-static toxicity experiments under indoor simulated conditions, the effects of Ketoprofen at low concentration (10mg / kg) and high concentration (100mg / kg) on antioxidant defense system in liver of Carassius auratus were studied.

4、Results: When KP was 10mg / kg, the activity of SOD in Carassius auratus was inhibited, and the activity of CAT in Carassius auratus was induced to increase, which indicated that the antioxidant defense system of Carassius auratus was not damaged obviously, cat Activity was first induced and then de

5、creased, which indicated that the antioxidant damage of Carassius auratus was not obvious. This indicated that higher concentration of KP or longer exposure time could significantly inhibit the activity of SOD and CAT in Carassius auratus, but these changes of in Vivo characterization suggested that

6、 Ketoprofen could cause oxidative damage in liver of Carassius auratus.Keywords:Brocadecarp;antioxidantdefensesystem;Ketoprofen;SOD;CAT目 錄1 引言11.1 酮洛芬的物理化學(xué)性質(zhì)11.2 酮洛芬的藥理作用21.3 酮洛芬的毒性21.4 酮洛芬的研究進(jìn)展31.5 錦鯽的抗氧化防御系統(tǒng)41.5.1 生物體的抗氧化防御系統(tǒng)41.5.2 抗氧化防御的機(jī)理41.6 本文的研究目的和意義52 實(shí)驗(yàn)部分52.1 實(shí)驗(yàn)材料52.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑52.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器52.1.

7、3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物52.2 實(shí)驗(yàn)步驟62.2.1 錦鯽的飼養(yǎng)62.2.2 染毒處理62.2.3 取樣和制備樣品62.3 總蛋白測(cè)定72.4 酶活性的測(cè)定72.4.1 SOD活性的測(cè)定72.4.2 CAT活性的測(cè)定73 數(shù)據(jù)分析及處理73.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法73.2 數(shù)據(jù)記錄及處理83.3 結(jié)果分析與討論103.3.1 結(jié)果分析103.3.2 討論114 結(jié)論與展望124.1 結(jié)論124.2 展望12參考文獻(xiàn)13致謝15酮洛芬對(duì)錦鯽的環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)1 引 言炎癥和疼痛是影響人類(lèi)健康的頑疾，非甾體類(lèi)抗炎藥可以減緩這一類(lèi)疾病，其在在市場(chǎng)上看到有很多種類(lèi)。全世界每天服用非甾體類(lèi)抗炎藥的人據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)約有

8、3千萬(wàn)人，中國(guó)約20%25%的病人選擇使用這類(lèi)藥物以減緩急慢性疼痛。臨床醫(yī)師特別是骨科醫(yī)師最常用的抗炎藥物便是非甾體類(lèi)抗炎藥。酮洛芬作為一種被公認(rèn)的最為安全的非選擇性的非甾體類(lèi)抗炎藥（Non-Steroids Anti-Inflammatory Drugs,NSAIDs），其被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥學(xué)行業(yè)。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，酮洛芬在生物體中具有生物累積性，在環(huán)境中可以長(zhǎng)期存在，具有一定的生物毒性。雖然其在水體中的殘留濃度只屬于微量級(jí)別，但近年來(lái)，隨著藥物需求量的增加，生產(chǎn)量和使用量增多，導(dǎo)致其在水環(huán)境中的濃度逐漸提高，在地表水環(huán)境中被廣泛檢測(cè)出，成為新興污染物之一1，給水生生物帶來(lái)了潛在風(fēng)險(xiǎn)2-4。有大量

9、研究表明NSAIDs會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)的腎臟、DNA、胃和腸道等造成損傷，甚至還會(huì)通過(guò)食物鏈和食物網(wǎng)影響人類(lèi)健康5，引起了人們極大的關(guān)注6。1.1 酮洛芬的物理化學(xué)性質(zhì)酮洛芬7(Ketoprofen，簡(jiǎn)稱(chēng)KP)，又名酮基布洛芬，是一種芳基烷酸類(lèi)化合物，化學(xué)名3-苯甲?；?甲基苯乙酸，分子式C16H14O3，分子量254.29，熔點(diǎn)約93-96，白色的結(jié)晶狀粉末，無(wú)臭或幾乎無(wú)臭味。在水中幾乎不溶，在甲醇中極易溶，在乙醇、丙酮及乙醚中易溶。圖1-1 酮洛芬的結(jié)構(gòu)式1.2 酮洛芬的藥理作用非甾體抗炎藥通常被認(rèn)為是通過(guò)抑制環(huán)氧合酶（COX）發(fā)揮藥效的。同工酶COX可以分為COX-1和COX-2。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)抑制

10、COX-2會(huì)減少前列腺素（PG）合成，因此會(huì)有消炎止痛的作用，而抑制COX-1的話會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，尤其是胃腸道及肝臟。近年來(lái)非甾體抗炎藥被發(fā)現(xiàn)了其還具有中樞鎮(zhèn)痛的作用，但是還沒(méi)有研究出它是怎樣達(dá)到中樞鎮(zhèn)痛的效果的。不過(guò)我們知道去甲腎上腺素（NE）可以轉(zhuǎn)導(dǎo)疼痛，因此如果可以產(chǎn)生更多量的去甲腎上腺素，這樣就可以降低疼痛。那么我們?cè)撛鯓哟碳な箼C(jī)體的去甲腎上腺素生產(chǎn)量增多呢，據(jù)研究報(bào)道，前列腺素會(huì)抑制去甲腎上腺素，這樣就需要我們抑制前列腺素使去甲腎上腺素不被抑制。由此可以推斷出，非甾體抗炎藥的中樞鎮(zhèn)痛作用也是通過(guò)減少前列腺素的合成達(dá)到效果的。酮洛芬屬于非甾體類(lèi)抗炎藥，因而她們的作用機(jī)制應(yīng)該是差不多的

11、。所以酮洛芬是通過(guò)抑制環(huán)氧酶和脂氧酶，減少前列腺素和白三烯的合成，從而降低釋放的緩激肽的活化，提高痛閾，發(fā)揮消炎止痛作用；它能在一定范圍能抑制血小板的黏附和聚集8-9；通過(guò)抑制前列腺素的合成促進(jìn)去甲腎上腺素釋放從而發(fā)揮中樞鎮(zhèn)痛作用。人們把酮洛芬分為左旋酮洛芬、右旋酮洛芬以及由左、右旋體共同構(gòu)成的外消旋酮洛芬。其中只有右旋酮洛芬能選擇性的作用COX-1，因此只有右旋酮洛芬才有抗炎止痛作用；左旋酮洛芬和外消旋酮洛芬不僅不能達(dá)到消炎止痛效果還會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良的反應(yīng)。酮洛芬被廣泛應(yīng)用于慢性癌痛，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)炎疼痛及術(shù)后疼痛等10的消炎止痛。由于以上疾病大多為多發(fā)病和慢

12、性病，因此在治療中，通常要求治療藥物的有效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)11-12。酮洛芬的鎮(zhèn)痛效用比其他同類(lèi)藥物治療效果更好，有效血藥濃度維持時(shí)間更長(zhǎng)，副作用較少且小，毒性較低，安全性以及耐受性更高，是一類(lèi)較為安全有效的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，對(duì)于人們是一個(gè)很好的選擇。1.3 酮洛芬的毒性1971年John Vane發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)NSAIDs都是因?yàn)閷?duì)COX的有效抑制，干擾減緩花生四烯酸代謝從而減少前列腺激素的合成才有治療效果以及不良反應(yīng)。目前普遍的認(rèn)為非甾體類(lèi)抗炎藥是通過(guò)對(duì)COX-2進(jìn)行抑制從而有效治療炎癥，對(duì)COX-1和COX-2的共同抑制則會(huì)導(dǎo)致不良反應(yīng)。酮洛芬藥片自口服以后在胃腸道就會(huì)先被吸收一部分，這樣就導(dǎo)致了藥物

13、的有效利用度降低，但吸收程度受到食物的影響，因此服用此藥時(shí)也要注意飲食方面。酮洛芬在在體內(nèi)半衰期t1/2僅1.6-1.9 h，有效發(fā)揮治療效果的時(shí)間短。這樣就使得一般的酮洛芬需要每日服用3至4次，這會(huì)造成了血藥濃度波動(dòng)大，且服用量多，不良反應(yīng)的發(fā)生率也會(huì)隨之升高13。若是長(zhǎng)期服用這類(lèi)藥物可能會(huì)出現(xiàn)各種不良的胃腸道反應(yīng)，如胃痛、脹氣、反胃惡心等，嚴(yán)重的話還會(huì)出現(xiàn)消化道潰瘍、出血及穿孔等現(xiàn)象。且調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，酮洛芬在生物體中具有生物累積性，能在環(huán)境中長(zhǎng)期保存，具有一定的生物毒性。隨著酮洛芬的廣泛應(yīng)用，藥物持續(xù)生產(chǎn)，導(dǎo)致其在地表水環(huán)境中含量越來(lái)越高，給生物帶來(lái)了潛在風(fēng)險(xiǎn)。近幾年來(lái)各個(gè)水域中紛紛被檢測(cè)

14、出水中含有酮洛芬，其中西班牙污水處理廠檢測(cè)出高達(dá)2.5g/L的KP14；英國(guó)的伊利河及塔夫河檢測(cè)出0.5ng/L到1.4ng/L的KP15；中國(guó)漳渭南運(yùn)河河流系統(tǒng)中也檢測(cè)出31.35ng/L的KP16。1.4 酮洛芬的研究進(jìn)展生物體若是具有血管系統(tǒng)，那機(jī)體當(dāng)致炎因子作用在它身上時(shí)，機(jī)體發(fā)生復(fù)雜的防御反應(yīng)，消除致炎因子，使其能恢復(fù)損傷，這是損傷及抗損傷過(guò)程?？寡姿幹阅軌蜻_(dá)到消炎止痛作用，是因?yàn)槠淠軌蜃钄嘌装Y介質(zhì)的產(chǎn)生及釋放 。近幾年以來(lái)，隨著科學(xué)水平的提高，人們對(duì)于炎癥機(jī)制可以進(jìn)行更加深入的研究分析，再加上分子生物學(xué)的廣泛應(yīng)用，使得抗炎類(lèi)藥物的研究水平逐漸從只能片面的了解“器官組織”的水平向

15、能夠更加深入的了解細(xì)胞及分子水平過(guò)渡。市場(chǎng)上抗炎藥物呈現(xiàn)出種類(lèi)更加多樣化，應(yīng)用范圍更加廣泛，治療水平更加高的特點(diǎn)。因此我們可以更加深入的分析探討抗炎藥物的作用機(jī)理和毒性反應(yīng)，以便于更好的理解炎癥反應(yīng)的發(fā)生過(guò)程。這對(duì)于降低炎癥發(fā)生率及治療炎癥有著深遠(yuǎn)的意義。酮洛芬是1972年由法國(guó)羅納普朗克（Rhone-poulenc）公司研發(fā)出來(lái)的。我們知道酮洛芬難溶于水，若是口服的話在胃道便會(huì)先被吸收掉一部分，所以它的有效利用度低，需要服用較多次才能達(dá)到較好的治療效果，且對(duì)胃腸道還有毒副作用，這就導(dǎo)致了對(duì)機(jī)體的不良作用會(huì)更嚴(yán)重。因此我們要針對(duì)做酮洛芬的不足進(jìn)行相關(guān)的研究，對(duì)酮洛芬進(jìn)行改進(jìn)。針對(duì)口服會(huì)被胃腸道

16、吸收，研究人員便研制出了不同的劑型，如用膠囊等將包裹起來(lái)的緩釋膠囊和緩釋片劑，以及靜脈注射等，這寫(xiě)不僅能有效的避免其與胃腸道接觸，降低了毒副作用，還能增加酮洛芬的有效血藥熱度時(shí)間，達(dá)到服用更少量便能達(dá)到原來(lái)劑量的效果，這更好的滿足了治療關(guān)節(jié)炎疾病的藥物要求。其中有研究人員從靜脈注射中啟發(fā)提高酮洛芬的溶解性研制出了可以用作注射的粉針劑。在研究人員的不懈努力下，酮洛芬的劑型變得多樣化，還研制出了許多具有同樣的藥效作用但副作用更小的藥物以及酮洛芬衍生物，這更好的滿足了社會(huì)需求 。1.5 錦鯽的抗氧化防御系統(tǒng)1.5.1 生物體的抗氧化防御系統(tǒng)基因會(huì)控制抗氧化防御系統(tǒng)內(nèi)酶物質(zhì)的合成與減少這對(duì)維持機(jī)體的正

17、常代謝十分重要。例如當(dāng)機(jī)體組織受到化學(xué)毒物等外源因子的刺激后，產(chǎn)生更多的自由基，機(jī)體為了保護(hù)自己會(huì)誘導(dǎo)抗氧化酶合成，這就是應(yīng)激補(bǔ)償效應(yīng)，在動(dòng)植物中十分普遍17-18。因此，酶活性變化可以用作檢測(cè)有毒物質(zhì)、動(dòng)物生物毒性的生物標(biāo)志物?？寡趸烙到y(tǒng)可以分為酶類(lèi)抗氧化防御系統(tǒng)及非酶類(lèi)抗氧化防御系統(tǒng)。SOD、CAT、SeGpx等抗氧化酶組成第一道防線，維生素C、維生素E等抗氧化劑構(gòu)成了第二道抗氧化防線。1.5.2 抗氧化防御的機(jī)理隨著漫長(zhǎng)的生物進(jìn)化衍生，需氧生物為防止氧化損傷發(fā)展出了抗氧化防御系統(tǒng)。魚(yú)類(lèi)是生活在水中的需氧生物，因此也擁有較為完整的抗氧化防御系統(tǒng)，系統(tǒng)內(nèi)的抗氧化酶能夠消除機(jī)體自由基起到對(duì)

18、氧化脅迫的清除功能，還能增強(qiáng)機(jī)體免疫防御等19。SOD、CAT是抗氧化防御系統(tǒng)的重要防線。SOD催化O-2生成H2O2后H2O2 被CAT催化轉(zhuǎn)化成 H2O和O2，使得能與O2-反應(yīng)生成有毒羥基自由基的H2O2能被及時(shí)清除，二者相輔相成，從而保護(hù)機(jī)體組織，維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定20。清除活性氧自由基的反應(yīng)如下：O-2+2H+ H2O2 +O2 (SOD催化反應(yīng))H2O2 H2O +O2 (CAT催化反應(yīng))自由基是有氧生物所必需的，如果自由基的產(chǎn)生量過(guò)大，抗氧化防御系統(tǒng)的抗氧化清除能力不足，不能及時(shí)得到清除，系統(tǒng)便會(huì)受到抑制，抗氧化酶活性也會(huì)下降，長(zhǎng)期下來(lái)就會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)損傷。因此，抗氧化酶活性的

19、變化在一定程度上能反映機(jī)體的現(xiàn)狀，因此在本實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)檢測(cè)SOD、CAT酶活性的變化知道魚(yú)體是否氧化損傷以及其氧化損傷能否得到恢復(fù)。因此研究魚(yú)類(lèi)的抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)于了解并提高機(jī)體的免疫具有深遠(yuǎn)的意義。1.6 本文的研究目的和意義酮洛芬作為一種消炎止痛藥被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，是一種新型環(huán)境污染物。目前酮洛芬的相關(guān)研究大多是在各地區(qū)環(huán)境中的分布特征和針對(duì)酮洛芬的分析技術(shù)，而關(guān)于酮洛芬的生物毒理研究報(bào)道相對(duì)較少，對(duì)人類(lèi)健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)這一方面還很匱乏，因此關(guān)于這方面的研究有待進(jìn)一步的探討。本文研究的主要內(nèi)容通過(guò)在室內(nèi)進(jìn)行半靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn)，研究不同濃度的酮洛芬中對(duì)錦鯽的肌肉和內(nèi)臟團(tuán)中CAT及SOD酶活性

20、的影響，從而評(píng)價(jià)酮洛芬對(duì)錦鯽的毒性效應(yīng)及酶系的響應(yīng)，為評(píng)價(jià)酮洛芬對(duì)水生動(dòng)物，尤其是魚(yú)類(lèi)的毒性影響和潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為酮洛芬的毒理學(xué)研究提供參考。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 實(shí)驗(yàn)材料2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑酮洛芬（KP）購(gòu)自Sigma公司，純度98%；酒精、二甲苯和福爾馬林（國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司，上海）；SOD、CAT和蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）；（實(shí)驗(yàn)用100純度的試劑）2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Unico UV2000 spectrometry，上海)；低溫高速冷凍離心機(jī)(Allegra64R，美國(guó)Beckman公司)。2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用

21、錦鯽，與鯽魚(yú)是近親，且顏色與錦鯉一般，便被叫做錦鯽，也是人們俗稱(chēng)的草金魚(yú)。屬于廣布、廣適性魚(yú)類(lèi)，其在各種環(huán)境下都能很好的適應(yīng)，因而常用于水生態(tài)毒理學(xué)的研究。錦鯽作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有較多優(yōu)勢(shì)：個(gè)體小、繁殖快、適應(yīng)能力強(qiáng)、生成緩慢、易飼養(yǎng)、管理簡(jiǎn)單等。本實(shí)驗(yàn)的錦鯽都是從寧德市金馬市場(chǎng)訂購(gòu)。2.2 實(shí)驗(yàn)步驟2.2.1 錦鯽的飼養(yǎng)在染毒實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，我們要先篩選健康活潑、無(wú)明顯病態(tài)樣的錦鯽在實(shí)驗(yàn)室條件下馴養(yǎng)至少15天以上，每天固定時(shí)間投餌一次（錦鯽的專(zhuān)用食料），水體要持續(xù)充氧。馴養(yǎng)期間，水PH值偏中性7.6 0.3水溫變化在（242），溶解氧大于 5 mg/ L。馴養(yǎng)過(guò)程嚴(yán)格遵守我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和處理規(guī)范

22、。待馴養(yǎng)的死亡率在1%以下開(kāi)始染毒實(shí)驗(yàn)。2.2.2 染毒處理本實(shí)驗(yàn)選用KP作為影響因子，設(shè)置暴露濃度10mg/kg、100mg/kg，以及一組空白組。染毒實(shí)驗(yàn)采用半靜態(tài)染毒接觸，從馴養(yǎng)的錦鯽中選取健康、活潑、食性好的錦鯽，放入事先準(zhǔn)備好干凈的魚(yú)缸中，每個(gè)魚(yú)缸15條，加曝氣水至30L，并做好水位標(biāo)記，每個(gè)魚(yú)缸做到平均2L水一條魚(yú)，之后往魚(yú)缸中投毒。在染毒實(shí)驗(yàn)期間，天天固定時(shí)間喂食，喂食量約0.035g/魚(yú)，喂食過(guò)后撈起未食用的飼料，然后換水。為保證每個(gè)魚(yú)缸的暴露濃度盡量保持在同一水平，換水時(shí)先放到剩下一半的水，再加入一定體積事先配置好的KP母液和水。其中，KP母液濃度為100mg/L（用二甲基亞

23、砜DMSO溶解配置）。2.2.3 取樣和制備樣品在暴露7、14、30天后的魚(yú)缸中選擇3條大小相仿，無(wú)明顯病態(tài)的錦鯽，用鐵棒力擊打魚(yú)的頭部使其昏倒，使用電子天平稱(chēng)重記錄后迅速解剖取出肝臟沖洗（注：用0.9的生理鹽水），用濾紙稍微吸干其表面的水分，然后放入密封袋中，做好標(biāo)記后保存于80的冰箱中待測(cè)。從冰箱中取出低溫保存的樣品，稍微解凍后用濾紙吸干剩余的表面水分，快速稱(chēng)重記錄后放置于燒杯，往燒杯中加入冷生理鹽水（質(zhì)量體積比為1：9），用電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿后得到混合物，而后將混合物用冷凍離心機(jī)離心，設(shè)置條件為：-4，15min，靜置后取上清液測(cè)定肌肉和內(nèi)臟的蛋白質(zhì)含量及酶活性。（注意：在4個(gè)小時(shí)內(nèi)要完成測(cè)

24、定）2.3 總蛋白測(cè)定Bradford法21可用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，用牛血清蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。棕紅色的考馬斯亮藍(lán)G-250和蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)，變成藍(lán)色。吸光度小于595nm時(shí)反應(yīng)的結(jié)合物光密度與蛋白質(zhì)含量成正比。測(cè)定時(shí)先用蒸餾水為空白校準(zhǔn)儀器，若是樣品濃度偏高，要將樣品稀釋至在吸光度的線性范圍內(nèi)。取上清液加入3mL的G-250，充分混勻后反應(yīng)10分鐘后，然后在595nm的波長(zhǎng)下比色。測(cè)定的蛋白質(zhì)含量可以用來(lái)校正SOD及CAT的酶活性。2.4 酶活性的測(cè)定2.4.1 SOD活性的測(cè)定基于黃嘌呤氧化酶法 22-23測(cè)定SOD活性。黃嘌呤氧化酶和黃嘌呤能發(fā)生顯色，變?yōu)樽霞t色，然后用分光

25、光度計(jì)測(cè)定在550nm處的吸光度（應(yīng)先用蒸餾水為空白校正儀器），用公式計(jì)算，便能知道SOD活性其表達(dá)式為U/mg protein。SOD活性定義：每毫克組織蛋白在每毫升反應(yīng)液的抑制率達(dá)五成時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)活性單位（U）。2.4.2 CAT活性的測(cè)定基于鉬酸銨比色法24測(cè)定CAT活性。CAT酶能使H2O2發(fā)生反應(yīng)，鉬酸銨能與過(guò)量的H2O2反應(yīng)生成淡黃色的絡(luò)合物，然后用分光光度計(jì)測(cè)定在405nm處的吸光度（應(yīng)先用蒸餾水為空白校正儀器），用公式計(jì)算便能知道CAT活性其表達(dá)式為U/mg protein。CAT活性定義：每秒鐘1毫克組織蛋白分解1molH2O2的量為一個(gè)活性單位（U）。3 數(shù)據(jù)分

26、析及處理3.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法本實(shí)驗(yàn)采用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校驗(yàn)后使用單因素方差分析(ANOVA)，當(dāng)P0.01時(shí)，表示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間有極顯著性差異；當(dāng)0.01P0.05時(shí)，表示無(wú)顯著性的差異。實(shí)驗(yàn)時(shí)數(shù)據(jù)記錄的應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析圖均用Origin 8.6繪制。3.2 數(shù)據(jù)記錄及處理表3-1 不同濃度的KP在不同時(shí)間暴露下的蛋白質(zhì)濃度的變化暴露時(shí)間/天暴露濃度0 mg/kg10 mg/kg100 mg/kg71.020.091.330.101.320.15140.980.101.400.291.110.18301.010.091.160.1

27、91.020.10圖3-1 不同濃度的KP在不同時(shí)間暴露下的蛋白質(zhì)濃度的變化表3-2 不同濃度的KP在不同時(shí)間暴露下的SOD酶活性變化暴露時(shí)間/天暴露濃度0 mg/kg10 mg/kg100 mg/kg770.885.1250.296.3845.062.861483.084.3764.576.6182.682.013078.304.4866.815.1577.625.63圖3-2 不同濃度的KP在不同時(shí)間暴露下的SOD酶活性變化表3-3 不同濃度的KP在不同時(shí)間暴露下的CAT酶活性變化暴露時(shí)間/天暴露濃度0 mg/kg10 mg/kg100 mg/kg717.763.5215.284.9019

28、.082.801417.790.5920.085.1016.951.683017.240.9818.770.8515.841.13圖3-3 不同濃度的KP在不同時(shí)間暴露下的CAT酶活性變化3.3 結(jié)果分析與討論3.3.1 結(jié)果分析從圖1中我們可以分析不同濃度KP和時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響。第7天的時(shí)候10 mg/kg的低濃度組蛋白質(zhì)酶活性與空白對(duì)照組相比較，呈現(xiàn)極顯著性差異（p0.01），蛋白質(zhì)酶活性有明顯上升，酶活性顯著被誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率為30.39；100mg/kg高濃度組與空白對(duì)照組相比較，呈現(xiàn)顯著性差異（0.01p0.05），蛋白質(zhì)活性有明顯上升，酶活性顯著被誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率為29.96。在14

29、天的時(shí)候，10 mg/kg低濃度組蛋白質(zhì)酶活性與空白組相比較，呈現(xiàn)顯著性差異（0.01p0.05），但與10mg/kg低濃度組蛋白質(zhì)酶活性對(duì)比呈現(xiàn)抑制下降的趨勢(shì)，其抑制率為21.06。在30天的時(shí)候，10mg/kg低濃度組蛋白質(zhì)酶活性與空白組其酶活性呈現(xiàn)誘導(dǎo)上升的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異（p0.05）；100mg/kg高濃度組蛋白質(zhì)酶活性與空白組相比沒(méi)有顯著性差異（P0.05），但與10mg/kg低濃度組蛋白質(zhì)酶活性對(duì)比呈現(xiàn)抑制下降的趨勢(shì)，其抑制率為11.88。從圖2中我們可以分析不同濃度KP和時(shí)間對(duì)SOD酶活性的影響。第7天的時(shí)候10mg/kg組SOD酶活性與空白對(duì)照組相比有顯著性差異（0.01

30、p0.05），SOD酶活性明顯降低，酶活性顯著被抑制，抑制率為29.05；100mg/kg與空白對(duì)照組相比有極顯著性差異（p0.01），SOD酶活性明顯降低，酶活性抑制明顯，抑制率為36.43。在14天的時(shí)候，10 mg/kg低濃度組SOD酶活性與空白組對(duì)比呈現(xiàn)顯著性差異（0.01p0.05），但與10mg/kg組蛋白質(zhì)酶活性對(duì)比呈現(xiàn)誘導(dǎo)上升的趨勢(shì)，其誘導(dǎo)率為28.06。在30天的時(shí)候，10mg/kg組SOD酶活性與空白組對(duì)比有顯著性差異（0.01p0.05），但與10mg/kg低濃度組蛋白質(zhì)酶活性對(duì)比呈現(xiàn)誘導(dǎo)上升的趨勢(shì)，其誘導(dǎo)率為16.18。從圖3中我們可以分析不同濃度KP和時(shí)間對(duì)CAT酶活

31、性的影響。第7天的時(shí)候10mg/kg低濃度組CAT酶活性與空白對(duì)照組相比較，呈現(xiàn)抑制下降的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異（p0.05）；100mg/kg組CAT酶活性與空白組相比無(wú)顯著性差異（P0.05），但與10mg/kg低濃度組CAT酶活性對(duì)比呈現(xiàn)誘導(dǎo)上升的趨勢(shì)，其誘導(dǎo)率為24.84。在14天的時(shí)候，10 mg/kg低濃度組CAT酶活性與空白對(duì)照組相比較，呈現(xiàn)誘導(dǎo)上升的趨勢(shì)，但是沒(méi)有顯著性差異（p0.05）；100mg/kg組CAT酶活性與空白組相比無(wú)顯著性差異（P0.05），但與10mg/kg低濃度組蛋白質(zhì)酶活性對(duì)比呈現(xiàn)抑制下降的趨勢(shì)，其抑制率為15.58。在30天的時(shí)候，10mg/kg低濃度組C

32、AT酶活性與空白對(duì)照組相比較，呈現(xiàn)誘導(dǎo)上升的趨勢(shì)，但是沒(méi)有顯著性差異（p0.05）；100mg/kg高濃度組CAT酶活性與空白組相比沒(méi)有顯著性差異（P0.05），但與10mg/kg低濃度組蛋白質(zhì)酶活性對(duì)比呈現(xiàn)抑制下降的趨勢(shì)，其抑制率為15.59。3.3.2 討論雖然酮洛芬對(duì)機(jī)體的氧化脅迫作用會(huì)使得機(jī)體產(chǎn)生自由基，而自由基的大量累積不能得到及時(shí)的清除會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷，但是抗氧化防御系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT），在生物體內(nèi)共同發(fā)揮作用可清除體內(nèi)產(chǎn)生的多余自由基，維持機(jī)體正常的生理平衡25。錦鯽擁有完整的抗氧化防御系統(tǒng)，因此其在一定濃度的外源染毒物的脅迫下仍能保持良好的

33、生命跡象。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)室模擬自然水生條件研究酮洛芬對(duì)錦鯽的肝臟中超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性的影響，從而評(píng)價(jià)酮洛芬對(duì)錦鯽的毒性效應(yīng)及酶系的響應(yīng)，為評(píng)價(jià)酮洛芬對(duì)水生動(dòng)物的毒性影響和潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。結(jié)果表明：對(duì)于10mg/kg低濃度實(shí)驗(yàn)組，SOD受到不同程度的抑制，且抑制率隨時(shí)間的延長(zhǎng)降低而CAT酶活性首先受到抑制隨后誘導(dǎo)上升，說(shuō)明錦鯽在KP的毒性作用下，抗氧化酶受到損傷，活性降低，但隨后還能誘導(dǎo)CAT酶，清除累積的自由基，使其恢復(fù)自身的抗氧化損傷。這說(shuō)明10mg/kg的KP對(duì)錦鯽的抗氧化防御系統(tǒng)損傷不明顯。對(duì)于100mg/kg的高濃度組，SDO酶活性受到不同程度的抑制；CAT酶活性

34、先被誘導(dǎo)后隨時(shí)間延長(zhǎng)抑制下降，這說(shuō)明錦鯽在KP100mg/kg的毒性作用下，抗氧化酶受到損傷，活性降低，抗氧化防御系統(tǒng)受到損傷。綜上可知在KP會(huì)對(duì)錦鯽的抗氧化防御系統(tǒng)造成損傷，損傷程度受KP的濃度以及暴露時(shí)間的影響。孫啟越26研究非甾體抗炎藥對(duì)人體肝臟的損傷。研究表明NSAIDs能導(dǎo)致患者用藥后約10%出現(xiàn)輕度的肝臟受損，酮洛芬便是常見(jiàn)的導(dǎo)致藥物性肝臟損傷的NSAIDs藥物之一。馮興27NSAIDs所致的肝損害, 從輕度的肝酶升高到嚴(yán)重的肝細(xì)胞壞死。據(jù)Rodriguez等人分別統(tǒng)計(jì)的228 和392例服用NSAIDs患者，其肝病發(fā)生率為0.00005%，比沒(méi)有服用此類(lèi)藥物的高出2.3倍，其中嚴(yán)

35、重肝損害16例。4 結(jié)論與展望4.1 結(jié)論本論文針對(duì)酮洛芬進(jìn)入環(huán)境后對(duì)錦鯽肝臟的損傷以及對(duì)肝臟抗氧化防御系統(tǒng)影響的研究結(jié)論如下：隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)和暴露濃度的增加，錦鯽體內(nèi)蛋白質(zhì)濃度略微升高或降低，并未呈現(xiàn)顯著性差異；在KP 10mg/kg時(shí)，錦鯽的SOD酶活性均受到抑制，但抑制率慢慢下降，CAT酶活性則先抑制后誘導(dǎo)上升，這說(shuō)明錦鯽的抗氧化防御系統(tǒng)損傷并不明顯；在KP100mg/kg時(shí)，錦鯽SOD酶活性均受到不同程度的抑制，CAT酶活性則先誘導(dǎo)后抑制下降，這說(shuō)明錦鯽的抗氧化防御系統(tǒng)受到損傷。由此可知需要在高濃度的KP或者更長(zhǎng)的暴露時(shí)間下才會(huì)使SOD、CAT酶活性顯著被抑制，難以清除過(guò)多的自由基

36、，使得錦鯽的肝臟受到難以恢復(fù)的氧化損傷，造成抗氧化防御系統(tǒng)損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明一定濃度的KP會(huì)致SOD和CAT酶活性受到抑制下降，影響自由基代謝，進(jìn)而對(duì)錦鯽的肝臟造成氧化損傷，這也說(shuō)明了SOD、CAT是抗氧化防御系統(tǒng)重要的防御系統(tǒng)之一，因此SOD、CAT酶活性的變化可以作為衡量污染物對(duì)魚(yú)類(lèi)有沒(méi)有影響的一個(gè)重要生物指標(biāo)。酮洛芬對(duì)生物的具有毒性，因此在必要的使用中若使用不當(dāng)就會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境影響，在未來(lái)的使用當(dāng)中，應(yīng)謹(jǐn)慎小心或發(fā)展出更加安全可靠、效果相同可替代的酮洛芬其他藥品。4.2 展望隨著酮洛芬在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，生產(chǎn)量也隨之增加，這使其進(jìn)入到空氣中的量增多，因此更容易被動(dòng)物吸入，另一方面大

37、部分酮洛芬進(jìn)入水土環(huán)境與生物體及其他污染物間發(fā)生相互作用，給水生生物及環(huán)境造成了很大的影響。因此，對(duì)于酮洛芬的水環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)的研究就顯得十分必要。到目前為止，關(guān)于酮洛芬的毒性研究仍然很少,尤其是對(duì)錦鯽的毒性效果，但是酮洛芬對(duì)生物具有毒性是公認(rèn)的，因此在必要的使用應(yīng)注意使用安全，減少其對(duì)生物及環(huán)境的影響。在未來(lái)的使用當(dāng)中，應(yīng)謹(jǐn)慎小心或發(fā)展出更加安全可靠、效果相同副作用小的酮洛芬替代藥品。參 考 文 獻(xiàn)1 Klaudia S,Jakub M,Katarzyna S,et al. Mytilidae as model organisms in the marine eco toxicology of

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