端粒酶在面突外胚間充質細胞干細胞中的表達

1、端粒酶在面突外胚間充質細胞干細胞中的表達 作者：鄧蔓菁 金巖 史俊南 董蕊 何大為 【關鍵詞】 外胚間充質干細胞 expression of human telomerase in ectomesenchymal stem cells of early embryonic facial process 【abstract】 aim: to evaluate the activity of telomerase in ectomesenchymal stem cells of early embryonic facial process. methods: ectomesenchymal ste

2、m cells of early human embryonic facial process were isolated and cultured in undifferentiated conditions by supplementing with leukemia inhibitor factor (lif). immunohistochemistry assay and image analysis were used to detect the expression extent of human telomerase reverse transcriptase (htert) w

3、hen cells were passaged for 1, 8, 15 and 22 times. cells without lif for 10 days were also evaluated. results: ectomesenchymal stem cells expressed htert. the expression extent of htert decreased with the increasing times of passages. the differentiated cells didnt express htert. conclusion: though

4、ectomesenchymal stem cells of early embryonic facial process have somewhat high telomerase activity, the telomerase activity at this level is not enough to prevent cells from senescence. 【keywords】 ectomesenchymal stem cell； human telomerase reverse transcriptase 【摘要】 目的： 探討面突外胚間充質干細胞的端粒酶活性狀況. 方法： 體

5、外培養(yǎng)妊娠50 d人胚胎面突外胚間充質干細胞，白血病抑制因子（lif）抑制細胞分化，于第1, 8, 15和第22代免疫組化檢測人端粒酶逆轉錄酶（htert）的表達并進行圖像分析，同時檢測無lif抑制下，第5代細胞自發(fā)分化10 d端粒酶逆轉錄酶的表達情況. 結果： 外胚間充質干細胞表達端粒酶逆轉錄酶，表達強度隨傳代次數的增多而下降. 在分化狀態(tài)，該細胞不再表達端粒酶逆轉錄酶. 結論： 早期胚胎面突外胚間充質干細胞具有較高的端粒酶活性，但不足以抑制該細胞的衰老. 【關鍵詞】 外胚間充質干細胞； 端粒酶逆轉錄酶 0引言 端粒酶在胚胎干細胞、生殖細胞、永生化細胞及大部分腫瘤細胞中表達，但在正常體細胞中

6、一般不表達. 近來發(fā)現(xiàn)胎兒組織、正常人的骨髓干細胞等也不同程度地表達端粒酶1-3. 這表明更廣泛的組織細胞可能存在端粒酶活性. 為了解面突外胚間充質干細胞作為多種終末細胞的來源細胞4,5，端粒酶是否有活性，表達的端粒酶是否可以阻止衰老的發(fā)生，我們通過檢測與端粒酶高度相關的端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase, htert)的表達，獲取面突外胚間充質干細胞端粒酶表達的信息. 1材料和方法 1.1材料dmem（低糖）/f12培養(yǎng)基、胎牛血清(fbs)、非必須氨基酸（neaa）(gibco, usa)；白血病抑制因子（leukemia inhi

7、bitor factor， lif）（chemicon, usa）；抗hnk1 mab, 抗htert多抗(santa cruz bio，usa)；抗波形絲蛋白mab（vimentin）, lsab免疫組化檢測試劑盒（dako, usa）. 1.2方法 面突外胚間充質干細胞的培養(yǎng)和鑒定： 50 d因外傷流產自愿捐贈的胚胎，切取上下頜突，分切為1 mm3大小， 2.5 gl-1胰酶37消化20 min，血清中和，吹散，離心. 再懸并以1106接種于100 ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為含100 mll-1 fbs, 0.1 moll-1 neaa的dmem/f12(11)，并添加1106 ul-1的白血

8、病抑制因子（ lif），以使細胞保持未分化狀態(tài). 孵箱內靜置50 min，約50%細胞貼壁，棄培養(yǎng)液，添加新培養(yǎng)液. 間充質細胞貼壁速度較上皮細胞貼壁快，利用其貼壁時間的差異進行初步分離，去除部分上皮細胞. 細胞長滿90%時，棄培養(yǎng)液，加入2.5 gl-1胰酶. 間充質細胞對胰酶的耐受性較差，先脫壁，而上皮細胞脫壁需要的時間較長. 將消化下來的細胞置于培養(yǎng)瓶中，12傳代，再次利用貼壁時間的差異分離上皮和間充質. 最初3代以12傳代，并在消化和傳代時分離上皮細胞. 從第4代開始，以13傳代，并不再分離上皮. 免疫組化抗hnk1, vimentin染色陽性鑒定細胞為外胚間充質干細胞； 免疫組化檢測

9、及圖像分析： 細胞傳代時，于第1, 8, 15及第22代制備細胞爬片；同時，將第5代細胞培養(yǎng)于無lif的培養(yǎng)液中，10 d后爬片. pbs 洗，40 gl-1多聚甲醛固定后，按免疫組化檢測試劑盒的程序進行抗htert染色. 每個樣本隨機選擇30個細胞，利用hpias1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)檢測陽性細胞的平均灰度值. 同時以舌癌tca8113細胞系為陽性對照，胎兒皮膚成纖維細胞為陰性對照. 統(tǒng)計學處理：采用spss統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析（方差分析）. 2結果 細胞生長情況：面突外胚間充質干細胞在條件培養(yǎng)液中生長良好，約34 d傳代1次. 培養(yǎng)至15代以后，細胞增殖速度減慢. 傳至第2

10、3代，細胞不再增殖； 外胚間充質干細胞表達端粒酶逆轉錄酶（htert）：外胚間充質干細胞htert染色呈陽性，以第1、第8代著色明顯（圖1a，b），第15代著色較淡（圖1c），第22代幾乎不著色. tca8113著色明顯（圖2）. 第5代細胞培養(yǎng)于無分化抑制劑lif中10 d后，細胞不再表達端粒酶逆轉錄酶； 圖像分析結果：細胞著色灰度值隨傳代的增多而變大，各組細胞灰度值分別為：第1代154.97.5，第8代173.48.5，第15代190.27.9，第22代、自發(fā)分化10 d和陰性對照組細胞未見著色，灰度值為參照值220，tca8113 143.89.9. 第1, 8, 15代組間比較有顯著差

11、異（p0.001）. 各組與陽性對照tca8113比較也有顯著差異（p0.001）. 注：灰度值越大，陽性程度越低. 3討論 我們發(fā)現(xiàn)，妊娠50 d胚胎面突外胚間充質干細胞有較強的端粒酶活性. 在分化抑制劑lif作用下，該細胞能保持較強的增殖活力. 第8代細胞的端粒酶逆轉錄酶htert較第1代有下降，但表達較強，肉眼無法判斷著色的差異. 第15代細胞仍表達htert，但著色程度明顯弱于第1代和第8代. 隨后細胞的增殖能力開始明顯下降，htert的活性有較大程度下降，至第22代，細胞幾乎不再增殖，而此時細胞不再表達htert. 表明htert可能對維持細胞a：第1代；b：第8代；c：第15代.

12、圖1圖2(略) 的增殖起作用，而這種作用可能是通過端粒酶活性來實現(xiàn)的. 去除白血病抑制因子lif后，細胞出現(xiàn)明顯的自發(fā)分化現(xiàn)象，細胞體積變大，形態(tài)多樣，增殖速度變慢. 去除lif 10 d，無法檢測到htert的表達. 表明干細胞的特性已完全喪失. 與舌癌tca8113細胞系比較，外胚間充質干細胞的端粒酶活性較低. 外胚間充質干細胞表達端粒酶活性，表明此時細胞仍處于未分化狀態(tài)，比較幼稚，生命周期較長. 但隨著培養(yǎng)時間延長，細胞的增殖能力逐漸減弱，端粒酶的活性也逐漸喪失. 二者呈現(xiàn)某種程度的一致性. 推測，在這個過程中，端粒的長度也在逐漸變短. 對胚胎干細胞的研究發(fā)現(xiàn)，在條件培養(yǎng)基中，胚胎干細胞

13、可以長期保持未分化狀態(tài)，端粒酶保持高水平表達，細胞呈現(xiàn)無限增殖活力，無衰老跡象6. 而面突外胚間充質干細胞則不能維持端粒酶的高活性，細胞增殖到一定程度就會出現(xiàn)衰老，最后停止生長. 細胞的衰老、端粒酶活性的降低可能與細胞逐漸分化相關. 這與分化10 d后細胞不表達htert相一致. 推測，在目前的條件培養(yǎng)液中，外胚間充質干細胞并不能完全保持其未分化狀態(tài)，隨培養(yǎng)時間的延長，逐漸喪失干細胞的特性. 本結果表明，面突外胚間充質干細胞的增殖、分化能力與端粒酶的活性保持一致. 但這種端粒酶活性并不能維持該細胞的無限增殖，隨著細胞的增殖、分化會逐漸喪失，或者互為因果. 【參考文獻】 1 broccoli d

14、, young jw, de lange t. telomerase activity in normal and malignant hematopoietic cells j. proc natl acad sci usa, 1995;92(20):9082-9086. 2 counter cm, gupta j, harley cb, leber b, bacchetti s. telomerase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies j. blood, 1995;85(9):2315-2320. 3

15、 hiyama k, hirai y, kyoizumi s, akiyama m, hiyama e, piatyszek ma, shay jw, ishioka s, yamakido m. activation of telomerase an human lymphocytes and hematopoietic progenitor cells j. j immunol, 1995;155(8):3711-3715. 4 deng mj, jin y, shi jn，lu hb, liu y, zhao y. induced differentiation of ectomesen

16、chymal cells of balb/c fetal mice mandibular process to smooth muscle cells by tgfand rhbmp2 j. yati yasui yazhou bing xue zazhi (chin j conserv denti), 2002;12(10):5 84-587. 5 deng mj, jin y, shi jn，lu hb, liu y, zhao y. induced differentiation of ectomesenchymal cells of balb/c mice fetal mandibular process to glial cells