反相高效液相色譜法測(cè)定毛魚(yú)藤中魚(yú)藤酮的含量

1、藥物分析反相高效液相色譜法測(cè)定毛魚(yú)藤中魚(yú)藤酮的含量胡道德,顧磊,劉皋林(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院,上海200080作者簡(jiǎn)介:胡道德(19642,男,副主任藥師,副教授,研究生導(dǎo)師1Tel:(021632400904801,E 2mail:shanghaiyaosina .com 1摘要目的:建立以反相高效液相色譜法測(cè)定毛魚(yú)藤中魚(yú)藤酮含量的方法。方法:以Z ORBAX Ecli p se XDB-C 18(5m ,4.6150mm 色譜柱為固定相;乙腈:0.1%磷酸溶液(4852,v/v,pH 2.6為流動(dòng)相;流速1.0mL /m in;柱溫40.0;檢測(cè)波長(zhǎng)299n m 。結(jié)果:魚(yú)藤酮在濃

2、度為3050mg/L 范圍內(nèi),其峰面積與濃度線性關(guān)系良好,線性方程為A =20.7311C -0.3616(r =0.9998,平均加樣回收率為100.74%,RSD 為0.86%。結(jié)論:本方法操作簡(jiǎn)便、快速,結(jié)果準(zhǔn)確,可用于毛魚(yú)藤中魚(yú)藤酮的含量測(cè)定。關(guān)鍵詞毛魚(yú)藤;魚(yú)藤酮;反相高效液相色譜法中圖分類(lèi)號(hào):R917文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1006-0111(200703-0159-03D eter m i n a ti on of rotenone i n D erris elliptica by reversed 2pha se h i gh performance li qu i d chr

3、oma tographyHU Dao 2de,Gu Lei,L i ou Gao 2lin (Depart m ent of Phar macy,Affiliated First Peop les Hos p ital,Shanghai J iaot ong University,Shanghai 200080,China ABSTRCT O bjecti ve:To establish a reversed 2phase high perf or mance liquid chr omat ography method f or r otenone in D erris elliptica

4、.M ethods:The deter m inati on was perfor med on Z ORBAX Ecli p se XDB 2C 18(5m,4.6150mm colu mn .The mobile phase consisted of acet onitrile and 0.1%phos phate acid s oluti on (4852,v/v,pH 2.6with fl ow rate at 1.0mL /m in and deter m inati on wavelength at 299n m under 40.0.Results:Under the condi

5、ti ons described,the calibrati on curve of r otenone was linear over the concentrati on range of 30t o 50mg/L.The regressi on equati on was:A =20.7311C 20.3616,r =0.9998(n =5,P 0.01.The average recovery for r otenone was 100.74%.The mean relative standard deviati on (RSD was 0.86%.Conclusi on:The me

6、thod is si m p le and accurate,and suitable for the deter m inati on of r otenone in D erris elliptica .KE Y WO R D S D erris elliptica ;r otenone;reversed 2phase high perfor mance liquid chr omat ography毛魚(yú)藤(D erris elliptica 為豆科魚(yú)藤屬植物,廣泛生長(zhǎng)在東南亞各國(guó)1。毛魚(yú)藤根、莖中魚(yú)藤酮(r otenone 含量高,是目前我國(guó)魚(yú)藤酮原藥生產(chǎn)的主要原料。魚(yú)藤酮是一種抑制神經(jīng)

7、組織和肌肉組織的選擇性植物源殺蟲(chóng)劑,具有活性高、殺蟲(chóng)譜廣的特點(diǎn),在無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品的害蟲(chóng)防治方面,具有較好的應(yīng)用前景。近年文獻(xiàn)報(bào)道2,3,大鼠長(zhǎng)時(shí)間接觸魚(yú)藤酮會(huì)對(duì)大鼠黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元有選擇性損傷作用,可出現(xiàn)特征的Le wy 小體,而對(duì)膽堿能神經(jīng)元無(wú)影響,從而使大鼠產(chǎn)生類(lèi)似于人類(lèi)帕金森病(Parkins on disease 的癥狀,利用魚(yú)藤酮的這一藥理毒理作用可以建立大鼠帕金森病動(dòng)物模型。我們?cè)诮ㄔ齑笫笈两鹕?dòng)物模型之前,參考了有關(guān)文獻(xiàn)4,5,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的具體條件,建立了測(cè)定毛魚(yú)藤中魚(yú)藤酮含量的反相高效液相色譜法,該方法操作簡(jiǎn)便、快速,結(jié)果準(zhǔn)確,為魚(yú)藤酮定量測(cè)定提供又一分析手段。1儀器與試藥1

8、11儀器Agilent 1100型高效液相色譜儀,包括四元梯度泵、二極管陣列檢測(cè)器(DAD 190950nm 、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、在線脫氣機(jī)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為美國(guó)Agilent 公司化學(xué)工作站(Che m stati on ,Z ORBAX Ecli p se XDB 2C 18(5m ,4.6150mm 色譜柱,微孔濾膜(0.45m ,HP 201真空過(guò)濾裝置,Mettler Toledo 電子天平(AL104。112試藥對(duì)照品魚(yú)藤酮(Sig ma 2A ldrich,含量98.0%,乙腈(美國(guó)天地公司,批號(hào):412021,色譜純;三氯甲烷、丙酮、乙醇等均為分析純;三蒸水(自制。2方法與結(jié)果

9、211毛魚(yú)藤根、莖提取物的制備稱取毛魚(yú)藤根、莖干粉適量,裝入索氏提取器中,用三氯甲烷浸漬過(guò)951藥學(xué)實(shí)踐雜志2007年第25卷第3期夜(12h ,然后回流提取1h,所得提取液先粗濾,后精濾(0.45m ,減壓濃縮即得樣品。212標(biāo)準(zhǔn)溶液配制精密稱取干燥至恒重的魚(yú)藤酮對(duì)照品適量,加丙酮-乙醇(12溶解并稀釋至刻度,配成500mg/L 儲(chǔ)備液,置4冰箱保存。臨用時(shí)將魚(yú)藤酮儲(chǔ)備液以乙醇按適當(dāng)比例稀釋,配制成濃度分別為30、35、40、45、50mg/L 的魚(yú)藤酮標(biāo)準(zhǔn)溶液。213供試品溶液配制精密吸取樣品1.0mL,置50mL 量瓶中,加乙醇至刻度,搖均,再精密吸取上述溶液1.0mL,置25mL 量瓶

10、中,加乙醇至刻度,搖均,即得。214檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇精密配制濃度40mg/L 的魚(yú)藤酮標(biāo)準(zhǔn)溶液,按色譜條件進(jìn)樣,結(jié)果顯示魚(yú)藤酮標(biāo)準(zhǔn)溶液在299n m 波長(zhǎng)處有最大的面積響應(yīng)值,因此,本實(shí)驗(yàn)選定檢測(cè)波長(zhǎng)為299nm 。215色譜條件色譜柱:Z ORBAX Ecli p se XDB 2C 18(5m ,4.6150mm ;流動(dòng)相:乙腈0.1%磷酸溶液(4852,v/v,pH 2.6;色譜參數(shù):流速1.0mL /m in;柱溫40.0;檢測(cè)波長(zhǎng)299n m;進(jìn)樣量:10L;記錄的魚(yú)藤酮峰面積為響應(yīng)參數(shù),外標(biāo)法定量。魚(yú)藤酮的典型色譜圖譜見(jiàn)圖1和圖2。由圖可知,在建立的色譜條件下,毛魚(yú)藤根、莖提取物中魚(yú)

11、藤酮和其它組分達(dá)到了完全分離,魚(yú)藤酮的保留時(shí)間為13.0m in 。圖1魚(yú)藤酮對(duì)照品的色譜圖216標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別進(jìn)樣30、35、40、45、50mg/L 的魚(yú)藤酮標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行測(cè)定,以峰面積A 對(duì)濃度C 進(jìn)行線性回歸,得線性方程為A =20.7311C-0.3616(r =0.9998。表明魚(yú)藤酮在濃度為3050mg/L 范圍內(nèi),其峰面積與濃度線性關(guān)系良好。217溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液10L,分別于0、2、4、6、8h 進(jìn)樣,共進(jìn)樣5次,觀察魚(yú)藤酮峰面積變化,結(jié)果表明,該溶液在8h 內(nèi)穩(wěn)定,峰面積測(cè)量值的RSD 為0.27% 。圖2供試品的色譜圖218進(jìn)樣精密度試驗(yàn)取標(biāo)準(zhǔn)曲線下溶液10

12、L,進(jìn)樣5次,計(jì)算魚(yú)藤酮進(jìn)樣精密度,結(jié)果魚(yú)藤酮峰面積測(cè)量值的RSD 為0.11%。219中間精密度試驗(yàn)取供試品溶液10L,分別在第1天、第2天、第3天由不同的分析人員在不同的儀器上分別進(jìn)樣5次,結(jié)果魚(yú)藤酮的RSD 為0.13%。2110方法回收率精密吸取已知含量的樣品,共9份,分別精密加入一定量的魚(yú)藤酮對(duì)照品貯備液適量,使成高、中、低濃度,分別進(jìn)樣3次測(cè)定,代入回歸方程,外標(biāo)法定量,計(jì)算得平均加樣回收率為100.74%,RSD 為0.86%。如表1。表1魚(yú)藤酮方法回收率(n =3序號(hào)樣品量(mg 加入量(mg 測(cè)得量(mg 回收率(%平均回收率(%RSD (%124.46 5.7830.302

13、1100.21224.46 5.7830.3911100.50324.46 5.7830.063799.42424.4612.1236.460899.67524.4612.1236.9429100.99100.740.86624.4612.1236.9667101.06724.4620.2445.2274101.18824.4620.2445.4344101.64924.4620.2445.5875101.992111專屬性在建立的色譜條件下,峰形良好,其他物質(zhì)對(duì)魚(yú)藤酮測(cè)定無(wú)干擾。用強(qiáng)酸(1mol/L HCL 溶液、強(qiáng)堿(1mol/L Na OH 溶液、強(qiáng)氧化劑(1mol/L H 2O 2溶液

14、對(duì)供試品進(jìn)行破壞,色譜圖見(jiàn)圖3,圖4,圖5。表明降解產(chǎn)物不影響測(cè)定。2112檢測(cè)限及定量限以信噪比為31時(shí)(S/N =31相應(yīng)注入儀器的量確定檢測(cè)限,以信噪比為101時(shí)(S/N =31相應(yīng)注入儀器的量確定定量限。結(jié)果,本方法檢測(cè)限及定量限分別為0.72ng 和2.17ng 。61Journal of Phar maceutical Practice Vol .252007No .3 圖3強(qiáng)酸(1m o l/L HC l 溶液 破壞后供試品的色譜圖圖4強(qiáng)酸(1m o l/L N aO H 溶液 破壞后供試品的色譜圖圖5強(qiáng)氧化劑(1mo l/L H 2O 2溶液破壞后供試品的色譜圖2113樣品測(cè)定

15、精密吸取樣品溶液1.0mL,置50mL 量瓶中,加乙醇至刻度,搖均,另精密吸取上述溶液1.0mL,置25mL 量瓶中,搖均,10L 注入液相色譜儀,記錄色譜圖,外標(biāo)法以峰面積代入回歸方程,計(jì)算魚(yú)藤酮的含量。測(cè)定了3批毛魚(yú)藤提取物樣品中魚(yú)藤酮含量分別是46.65、45.24、45.00g/L,如表2。表23批樣品中魚(yú)藤酮含量測(cè)定結(jié)果(n =3樣品編號(hào)含量(g/L RSD (%146.650.28245.240.25345.000.533討論毛魚(yú)藤植物中含有的魚(yú)藤酮類(lèi)化合物主要有魚(yú)藤酮、魚(yú)藤素、毛魚(yú)藤酮及其12羥基化合物(魚(yú)藤醇酮、灰豆素和毛魚(yú)藤醇酮和6,12脫氫化合物(脫氫魚(yú)藤酮、脫氫魚(yú)藤素和脫

16、氫毛魚(yú)藤酮,它們屬異黃酮類(lèi)化合物。魚(yú)藤酮類(lèi)化合物UV 吸收光譜有四種類(lèi)型,魚(yú)藤酮、魚(yú)藤素、毛魚(yú)藤酮和它們的脫氫氧化物分別在299、273、241nm 和281nm 處有吸收峰6。在本實(shí)驗(yàn)條件下比較不同檢測(cè)波長(zhǎng)處的魚(yú)藤酮色譜圖,可以看出魚(yú)藤酮在299nm 波長(zhǎng)處有最大的面積響應(yīng)值,因此,本實(shí)驗(yàn)選定檢測(cè)波長(zhǎng)為299n m ,同文獻(xiàn)報(bào)道一致6。在綜合分析了魚(yú)藤酮的物理和化學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上,對(duì)使用不同的溶劑作為流動(dòng)相進(jìn)行了反復(fù)的對(duì)比研究,發(fā)現(xiàn)采用C 18色譜柱,甲醇/水為流動(dòng)相組成的反相系統(tǒng),魚(yú)藤酮峰型的對(duì)稱性不佳且有拖尾。只有采用C 18色譜柱和乙腈011%磷酸溶液(4852,v/v,pH 2.6為流

17、動(dòng)相組成的反相系統(tǒng),峰型對(duì)稱,分離效果滿意。魚(yú)藤酮在酸、堿中較穩(wěn)定,但在強(qiáng)氧化劑(1mol/L H 2O 2溶液作用下不穩(wěn)定,有新物質(zhì)生成,在本實(shí)驗(yàn)條件下新物質(zhì)色譜峰的保留時(shí)間為12.197m in (圖5,同魚(yú)藤酮的分離度大于1.5,分離效果良好,該新物質(zhì)結(jié)構(gòu)確定,尚需進(jìn)一步研究。魚(yú)藤酮見(jiàn)光易分解,標(biāo)樣保存時(shí)注意密封、避光,進(jìn)樣時(shí)應(yīng)在暗室條件下進(jìn)行?？傊?本方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確性,并且操作簡(jiǎn)便、快速,是進(jìn)行毛魚(yú)藤中魚(yú)藤酮有效成分檢測(cè)的理想分析方法。參考文獻(xiàn):1Sae 2Yun A,Ovatlarnporn C,Itharat A ,et al 1Extracti on of r ote

18、 2none fr om D erris elliptica and D erris m alaccensis by p ressurized liq 2uid extracti on compared with macerati on J 1J Chr omat ogr A,2006;1125(2:172.2Huang J,L iu H,Gu W ,et al 1A delivery strategy for r otenone m i 2cr os pheres in an ani m al model of Parkins on s disease J 1B i oma 2terials,2006;27(6:937.3Phinney AL,Andringa G,Bol JG,et al .Enhanced sensitivity ofdopa m inergic neur ons t o r otenone 2induced t oxici