包涵體蛋白的分離純化

1、包涵體蛋白的分離純化趙玲 0743085096包涵體是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，尤其在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)，形成的由膜包裹的高密度、 不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時(shí)為高折射區(qū)，與胞質(zhì)中其他成分有明顯區(qū)別。包涵體形成是比較復(fù) 雜的，與胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)生成速率有關(guān)，新生成的多肽濃度較高，無充足的時(shí)間進(jìn)行折疊，從而形成非結(jié)晶、 無定形的蛋白質(zhì)的聚集體；此外，包涵體的形成還被認(rèn)為與宿主菌的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、溫度、 pH 值、離子強(qiáng)度等因素有關(guān)。細(xì)胞中的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)常以可融性或分子復(fù)合物的形式存在，功能性的蛋 白質(zhì)總是折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)型。包涵體內(nèi)的蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體，不具有生物學(xué)活

2、性，因此要 獲得具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)必須將包涵體溶解，釋放出其中的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)的復(fù)性。包涵體的 主要成分就是表達(dá)產(chǎn)物，其可占據(jù)集體蛋白的 40%95%, 此外，還含有宿主菌的外膜蛋白、 RNA 聚合酶、 RNA 、DNA 、脂類及糖類物質(zhì)，所以分離包涵體后，還要采用適當(dāng)?shù)姆椒ǎㄈ缟V法）進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的 純化。1. 包涵體的形成重組蛋白不論在原核細(xì)胞還是真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí) , 都可形成包涵體。通常所說的包涵體是指重組蛋白在大 腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)形成的無活性蛋白聚集體,一般含有 50% 以上重組蛋白 ,其余為核糖體組分、 RNA 聚合酶 ,外膜蛋白等雜蛋白 ,以及質(zhì)粒 DNA 、RNA

3、片斷、脂質(zhì)、肽聚糖、脂多糖等成分 。由于包涵體在相 差 顯 微 鏡 下 為 黑 色 斑 點(diǎn) , 所 以 也 稱 為 折 射 體。包涵體形成的原因主要有以下幾點(diǎn) : 蛋 白合成速度太快 ,以致于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊。 蛋白折疊的動(dòng)力學(xué)模型表明:蛋白質(zhì)天然構(gòu)象形成的速率取決于肽鏈的合成速率、折疊速率和聚集速率幾個(gè)因素。中間體正確折疊是分子內(nèi)的一級(jí)反應(yīng),而中間體的聚集是發(fā)生在分子間的二級(jí)或高級(jí)反應(yīng),因此 ,折疊中間體的濃度對聚集反應(yīng)影響非常大; 重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白 ,由于缺少真核生物的翻譯后修飾系統(tǒng)（如糖基化等 ） ,致使中間體大量積累 ,容易形成包涵體；培養(yǎng)條件不佳和重組蛋白所處的環(huán)境

4、也可導(dǎo)致包涵體形成，如發(fā)酵溫度高，胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)等；二硫鍵在蛋白折疊中有重要作用，而大腸桿菌胞內(nèi)的還原環(huán)境不利于二硫鍵的形成；包涵體不溶可能由于分子間無活性的3 2片層含量高于天然結(jié)構(gòu)或鹽沉淀蛋白。包涵體蛋白雖然不具有天然結(jié)構(gòu)、沒有活性 ,但在基因工程中生產(chǎn)重組蛋白,包涵體的形成有一定優(yōu)勢 ,主要表現(xiàn)在 : 重組蛋白高水平表達(dá) ,有時(shí)候可達(dá)細(xì)胞總蛋白的30%; 包涵體密度高 （約 1. 3mg/m l） 12 ,重組蛋白相對較純 , 很容易與細(xì)胞成分分離 ,可減少后續(xù)純化步驟 ; 包涵體結(jié)構(gòu)致密 , 因而在一定程度上避免了大腸桿菌蛋白酶 的降解；易于毒性蛋白和膜蛋白表達(dá)；包涵體的形成

5、降低了重組蛋白在胞質(zhì)中的濃度，有利于目的基因的進(jìn)一步表達(dá)?；谶@些特點(diǎn),重組蛋白的包涵體表達(dá)已在商業(yè)化生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。2. 包涵體的洗滌純化表達(dá)重組蛋白的宿主細(xì)胞通常在低溫條件下用高壓勻漿或超聲進(jìn)行破碎，或者用機(jī)械、化學(xué)與酶相結(jié)合的方法破 碎。破碎大腸桿菌有效的方法是溶菌酶（1mg/m I）結(jié)合超聲波進(jìn)行處理 。需要的注 意的是控制超聲功率和時(shí)間，超聲不足不能完全釋放重組蛋白，而超聲時(shí)間太長或功率太大，會(huì)使蛋白炭化。由于包涵體具有很高的密度 ，細(xì)胞破碎液通過低速離心（或者梯度低速離心 ）、過濾、即可除去可溶性蛋白和部分細(xì)胞碎片，達(dá)到收集包涵體目的。包涵體中除目的蛋白外，還有少量脂類、 核酸

6、、多糖和其它雜蛋白等 ，這些成分會(huì)影響目的蛋白的純化和復(fù)性，因此在包涵體蛋白去折疊前應(yīng)先洗滌包涵體。常用EDTA、低濃度變性劑（如尿素、鹽酸胍）、弱去污劑（如 Triton X2100、辛烷基葡糖苷、脫氧膽酸鹽）、 還原劑（如二硫蘇糖醇 DTT、3 2巰基乙醇）等。伴隨著細(xì)胞破碎而釋放的膜蛋白必須除去，例如大腸桿菌外膜蛋白 OmpT（37kDa 在 8 moI/L 尿素中仍具有蛋白水解酶活性 ，如果洗滌不充分 ，則有可能在包涵體 的溶解和復(fù)性過程中降解重組蛋白質(zhì)，而且洗滌得到較純的包涵體可簡化后續(xù)色譜純化的步驟。因此包涵體的洗滌非常重要，不可忽視。包涵體蛋白分離純化步驟復(fù)雜繁多，為了避免繁瑣的

7、操作 ， Gu 等用凝膠過濾方法實(shí)現(xiàn)了對原核表達(dá)的ScFV52P 包涵體蛋白的分離和洗滌。也可采用原位溶解 （ in situ soIubiIization） 包涵體的處理方法，即用化學(xué)試劑或酶直接從發(fā)酵液里的細(xì)胞中溶解釋放包涵體蛋白。將發(fā)酵液中的包涵體蛋白質(zhì)原位溶解后，可以用超濾 19， 20 、雙水相萃取 選擇性萃取 ，或擴(kuò)張床色譜等選擇性捕集，或在高電場下使目的蛋白吸附在磁性微球上 方法 ，可以除去細(xì)胞碎片和宿主細(xì)胞蛋白，使得目的蛋白得到部分純化。但這種原位溶解的方式并不常見 ,它會(huì)使發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)都釋放出來,不僅影響包涵體蛋白的后續(xù)純化和復(fù)性 ,也對目的蛋白的表達(dá)水平

8、提出了更高的要求。3. 包涵體的溶解與去折疊溶解包涵體目前最常用的方法是用變性劑如尿素 (68 mol/L )或鹽酸胍(46 mol/L )溶解，它們對蛋 白質(zhì)的氫鍵有較強(qiáng)的可逆性變性作用 ,可破壞蛋白質(zhì)疊。尿素具有不電離、成本低、可直接進(jìn)行SDS2PAGE 檢測以及溶解的包涵體蛋白可選用多種色譜法純化等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，但尿素容易析出 ，作用時(shí)間較長或溫度較高時(shí)會(huì)對蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)修飾。 鹽酸胍溶解包涵體能力較尿素強(qiáng) ，作用快而不修飾蛋白 ，但成本高，酸性條件下易沉淀 ，還干擾離子交換色譜等。 一般來說 ，用低濃度變性劑溶解包涵體得到的可溶性蛋白純 度比高濃度變性劑溶解的高 ，是因?yàn)樽冃詣舛雀?/p>

9、時(shí)胞質(zhì)顆粒蛋白也被釋放出來。包涵體溶解還可添加去污劑 、還原劑 、螯合劑等 ，或在極端 pH 、高溫條件下進(jìn)行。各 種 去 污 劑 如 SDS， CTAB，Tween 20， NP40，TritionX2100， Sarkosyl( 月桂酰 2N2 甲基氨基乙酸鈉 )等常被用來溶解包涵體是因?yàn)?其作用比鹽酸胍和尿素更溫和，溶解的蛋白質(zhì)具有更多的有序結(jié)構(gòu)，可能已經(jīng)具有生物活性 ，避免了復(fù)性中的錯(cuò)誤折疊。但是使用去污劑作為溶解劑可能會(huì)干擾后續(xù)純化步驟。對于含有半胱氨酸的重組蛋白質(zhì) ，分離到的包涵體中常含有一些鏈間和鏈內(nèi)非活性的二硫鍵，因此還原劑的使用非常重要。 常用的還原劑有DTT、DTE、GSH、3 2巰基乙醇，還原劑可以過量，