纖維細胞在大鼠多柔比星慢性腎損害模型腎纖維化過程中作用以及雷帕霉素對其影響

1、安徽醫(yī)科大學碩士學位論文纖維細胞在大鼠多柔比星慢性腎損害模型腎纖維化過程中的作用以及雷帕霉素對其影響中文摘要背景與目的 腎纖維化是各種病因所致的慢性腎損傷走向終末期腎臟病(Endstage renal disease, ESRD)的共同途徑，以腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化為主要病理特征，目前研究證實其發(fā)生和發(fā)展與成纖維細胞和肌成纖維細胞關(guān)系密切，而作為這兩種細胞的循環(huán)前體細胞的纖維細胞(fibrocyte)近來成為研究焦點。阻斷纖維細胞趨化、遷移及轉(zhuǎn)分化可能能有效地延緩腎纖維化進展。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）是一種新型、強效免疫抑制劑，具有較強的抗炎、抗病毒、抗細胞增殖以及血管保

2、護作用。研究表明 RAPA 在多個動物腎病模型中具有明顯的抗腎纖維化作用。本實驗以大鼠多柔比星腎損害模型為研究對象，觀察纖維細胞的組織定位以及 CCR7、CD45 的動態(tài)變化，進而探討纖維細胞在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中可能的作用，同時觀察 RAPA 干預治療對纖維細胞相關(guān)因子的影響，來進一步探討其抗腎纖維化作用的可能機制。方法 通過兩次給予大鼠尾靜脈注射多柔比星制備多柔比星腎損害大鼠模型。雄性 SD 大鼠 62 只隨機分為：正常對照組(A 組，n=20)、模型組(B 組,n=32)、RAPA治療組(C 組,n=10)。實驗開始第 1、2 周第 1 天，B、C 組分別重復給予多柔比星（4 mg/kg

3、）尾靜脈注射，對照組給予等量生理鹽水，自首次注射多柔比星之日起，于第 2 周末給予 C 組大鼠 RAPA1.5 mg/(kgd)灌胃；A、B 組同時給予等量溶媒。分別于首次注射多柔比星后的第 4、7、10、13 周末收集 A、B 組的血、尿及腎組織標本，第 7 周末收集 C 組的血、尿及腎組織標本。全自動生化儀測定血清甘油三脂、總膽固醇和白蛋白；BCA 法檢測 24 h 尿蛋白排泄率；Masson 染色，光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)學變化，并使用腎小球硬化指數(shù)（glomerulosclerosisindex，GSI）和腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)（tubulointerstitial index,TII）評估

4、腎臟損害程度；免疫組化觀察纖維細胞并對其進行組織定位，同時檢測 CD45、CCR7 蛋6安徽醫(yī)科大學碩士學位論文白表達。結(jié)果1.各組大鼠血甘油三酯、總膽固醇及血清白蛋白水平變化 B 組與 A 組相比第 7周末，血甘油三酯水平升高(2.571.19 vs 0.760.11,P0.01）、血總膽固醇水平升高（ 6.791.47 vs 1.290.27,P 0.01）顯著升高，血清白蛋白水平明顯降低（21.412.11vs 34.640.96, P0.01）。2.各組大鼠 24 h 尿蛋白排泄率的變化B 組與 A 組相比第 7 周末，24 h 尿蛋白排出率明顯增加（568102 vs 216,P0.

5、01），且隨實驗時間呈逐漸上升趨勢；C 組低于同時相 B 組(P0.01)。3.各組大鼠腎臟病理形態(tài)學改變光鏡下觀察，B 組腎小球系膜基質(zhì)明顯增多，腎小管多灶性萎縮和擴張，管腔內(nèi)可見蛋白管型，并隨時間延長逐漸加重。GSI及 TII 隨時間延長逐漸升高（P0.05）。與 B 組相比較，C 組腎小球的硬化和小管間質(zhì)纖維化均明顯減輕(P0.01）。4.纖維細胞的觀察B組第7周末大鼠腎組織的連續(xù)切片上檢測到腎間質(zhì)中出現(xiàn)CD45、型膠原雙陽性細胞，呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形態(tài)，多分布于腎皮質(zhì)和皮髓交界區(qū)的血管周圍，腎小球周圍和腎小管間質(zhì)中也有少量出現(xiàn)。5.各組大鼠 CD45 蛋白表達的變化 免疫組化觀察到

6、，B 組腎間質(zhì)中 CD45 陽性細胞第 4 周末出現(xiàn)，第 7 周末數(shù)量達到頂點，后逐漸減少（P0.01）。與 B 組相比，C 組中相同時相 CD45 陽性細胞數(shù)量顯著降低（P0.01）。6.各組大鼠 CCR7 蛋白表達的變化 免疫組化觀察到，B 組腎間質(zhì)中 CCR7 陽性細胞在第 4 周末出現(xiàn)，在第 7 周數(shù)量達到頂點，后逐漸減少（P0.01）。與 B 組相比，C 組中相同時相 CCR7 陽性細胞數(shù)量顯著降低（P0.01）。結(jié)論纖維細胞可能參與腎纖維化過程，早中期發(fā)揮作用，其由外周血遷移到組織可能與 CCL21/CCR7 信號傳遞通路有關(guān)。RAPA 在大鼠慢性腎纖維化進展中具有一定的腎保護作用

7、，可能與降低 CCR7 蛋白的表達來抑制循環(huán)中纖維細胞向局部腎組織遷移相關(guān)。關(guān)鍵詞多柔比星腎纖維化纖維細胞CCR7雷帕霉素7安徽醫(yī)科大學碩士學位論文the Roles of Fibrocytes in the Progressive Renal FibrosisInduced by Adriamycin and Effects of Rapamycin on Themin this Model of RatsBackground and objectiveRenal fibrosis is the common pathway of chronickidney diseases（CKD） ru

8、nning to end-stage renal disease (ESRD) resulting fromvarious reasons.Glomerular sclerosis and tubulointerstitial fibrosis are known asclassical changes of renal fibrosis. Unfortunately, the intimate mechanisms leading tothe development and progression of renal injury are not yet fully known. Previo

9、usstudies were reptored that some types of cells ,such as myofibroblast and fibroblast,have the key roles in the development and procession of renal fibrosis,wheras thespecial type of the peripheral blood cells, fibrocyte, is shown as a precursor ofmyofibroblast and fibroblast. It may be effective t

10、o ameliorate the process of renalfibrosis by blocking the migration, transformation of fibrocyte. It is the reason whysome studies are focus on fibrocyte, recently. Rapamycin(RAPA) is a new, potentimmunosuppressive agent. it possesses a variety of pharmacological functions,including anti-inflammatio

11、n, anti-virus,anti-proliferation and protecting vascular.Some researches have shown that RAPA has significant protective positive effects onrenal fibrosis in various animal models of chronic renal disease. Our study was toinvestigate the effect of fibrocytes and chemokine recepter 7(CCR 7) in the pr

12、ocess ofrenal fibrosis induced by adriamycin in rats. Moreover, to observe the effect of RAPAon some cytokines relating with fibrocyte to explore the potential protectivemechanism in renal fibrosis.MethodsSixty-two Male Sprague-Dawley( SD) rats 8 weeks old were divided tothree groups randomly, norma

13、l control group (group A, n=20) ,model group (groupB，n=32) and RAPA treatment group(group C, n=10). Group B and C were injectedwith 4 mg/ kg of adriamycin via tail vein on the first day of the 1st and 2nd wkrespectively,while group A received 0. 9 % sodium chloride solution injection of equal8安徽醫(yī)科大學

14、碩士學位論文volume at the same time. Group C received RAPA treatment 1.5 mg/(kgd) orally inthe 2 nd wk after the first adriamycin injection. The changes of 24 h urine protein andrenal pathological were evaluated in the end of 7 wk after the first administration ofadriamycin. In group B, the urine and seru

15、m samples were measured at the end of 4wk，7 wk，10 wk and 13 wk after the first administration of adriamycin to observebiochemical changes, including serum total cholesterol(TC), serum triglyceride(TG),serum albumin(ALb) and 24 h urine protein excretion rate, while the renal tissue of ratswas obtaine

16、d to evaluate renal histological and ultrastructural changes byglomerulosclerosis index(GSI) and tubulointerstitial index(TII), and analyze theexpression of CD45 and CCR7 by immunohistochemistry. The samples, which werementioned above, were measured in the end of 7 wk after the first administration

17、ofadriamycin in group C.Results1. Levels of TG, TC and ALbComparing with group A, there were increasinglevels of TC(6.791.47 vs 1.290.27, P0.01) and TG(2.571.19 vs 0.760.11, P0.01) , wherea s Alb (21.412.11 vs 34.640.96, P0.01）decreased significantly in theend of 7 wk in group B.2.24 h urine protein

18、 excretion rateComparing with group A, there wereincreasing levels of 24 h urine protein excretion rate (568102 vs 216，P0.01 ) ingroup B, and they rose further as the disease-process progressed(P0.01). 24 hurinary protein excretion rate in group C was decreased significantly compared with itin group

19、 B in crossponding time (P0.01).3.Renal pathologic morphologyThe proliferation of the mesangial cells, theaccumulation of the extracellular matrix and atrophyin or extension of renal tubules ingroup B were more remarkable than that in groupA, while these changes weresignicantly ameliorated by theatm

20、ent with RAPA（P0.01).4.FibrocyteIn group B ,we observed the serial sections of renal tissue byimmunohistochemistry and found that in renal cortical interstitium, there were some9安徽醫(yī)科大學碩士學位論文cells which expressed CD45 and collagen I simultaneously.5.The expression of CD45 In group B, interstitial inf

21、iltrate of CD45+ cells appearedin the end of 4 wk, reached a maximum in the end of 7 wk （P0.01）and graduallydecreased afterward（P0.05）.The number of CD45+ cells was lower in group C than ingroup B in crossponding time（P0.01）.6.The expression of CCR7In group B, interstitial infiltrate of CCR7+ cellsa

22、ppeared in the end of 4 wk, reached a maximum in the end of 7 wk （P0.01）andgradually decreased afterward（P99.99%）系華北制藥集團產(chǎn)品，國藥準字(95)X-148，批號 050501，用前溶于 1%的羧甲基纖維素鈉溶液中，濃度 0.5 mg/ml。2.1.3 試劑尿蛋白測定試劑盒和考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，12安徽醫(yī)科大學碩士學位論文兔抗大鼠型膠原多克隆抗體 (sc-59772 ) 以及小鼠抗大鼠 CD45單 克 隆 抗 體（sc-53047）購自美國Sant

23、a Cruz公司，兔抗大鼠CCR7多克隆抗體(bs-1305R)購自北 京 博 奧 森 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司 ； SP 試 劑 盒 (SP-9000) ， 多 聚 賴 氨 酸（ Poly-L-LysineSolution ， ZLI-9005 ）， DAB 試 劑 盒 （ ZLI-9032 ）， AEC 試 劑 盒（ZLI-9036）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，內(nèi)源性生物素阻斷試劑盒（IHC Biotin Block Kit，BLK-0001/0002）購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，復合消化液（AR0022）購自武漢博士德生物工程有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。2.1.4

24、儀器與設(shè)備FA1104型電子天平：上海精密科學儀器公司產(chǎn)品。TDL-16C臺式高速離心機：上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品。7150型全自動生化分析儀：日本日立公司產(chǎn)品。CL-7300型全自動生化分析儀：日本島津公司產(chǎn)品。722光柵分光光度計：上海分析儀器廠產(chǎn)品。756紫外分光廣度計：上海分析儀器廠產(chǎn)品。微波爐：格蘭仕，800W，2450MHZ。電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械五廠產(chǎn)品。Vanox多功能顯微鏡：日本Olympus公司產(chǎn)品。LEICA CM1800切片機：美國徠卡公司產(chǎn)品?？烧{(diào)式微量移液器：Gilson公司產(chǎn)品。-80C低溫冰箱：日本三洋公司產(chǎn)品。代謝籠：蘇州新區(qū)楓橋?qū)嶒瀯游锘\具廠產(chǎn)品。2.2

25、 方法2.2.1 建立大鼠多柔比星誘導蛋白尿慢性腎損害模型參照Ando et al.1 采用2次尾靜脈注射多柔比星方法，模型組大鼠尾靜脈注射多柔比星4 mg/kg（臨用前以生理鹽水配備為濃度 0.8 g/L），1周后重復。對照組給予等量生理鹽水尾靜脈注射。2.2.2 動物分組及處理62只雄性SD大鼠隨機分為：正常對照組(A組，n=20)、模型組(B組，n=32)、RAPA治療組(C組，n=10)。用藥方案：第一次注射多柔比星2周后，RAPA配制成13安徽醫(yī)科大學碩士學位論文0.5 mg/ml溶液，以1.5 mg/(kgd)灌胃給藥。對照組與模型組相應(yīng)時間點給予等量溶媒。所有大鼠在整個實驗期間均

26、給予標準飲食喂養(yǎng)，自由飲水。2.2.3 標本收集大鼠處死前 1 天放入代謝籠（蘇州新區(qū)楓橋?qū)嶒瀯游锘\具廠產(chǎn)品）中準確收集24 h 尿液，離心分裝后保存于-80C 冰箱中待尿白蛋白測定。實驗開始后分別在 4、7、10、13 周末在對照組隨機選取 4-5 只，模型組隨機選取 8 只處死。RAPA 治療組于實驗開始的第 7 周末全部處死。大鼠空腹 16 h 后，稱取體重，在戊巴比妥(3%濃度，劑量 0.l ml/l00 g 體重)腹腔注射麻醉下行腹主動脈插管收集血標本，肝素抗凝后，4 離心 15 min,1500 rpm,取血漿保存在-20 待測血總膽固醇、甘油三酯和血清白蛋白等相關(guān)生化指標。通過腹

27、主動脈插管注入 4 預冷生理鹽水反復灌洗腎臟，至整個腎臟顏色變蒼白后游離，置于冰上，取 8 mm3 大小腎組織置于 4%多聚甲醛溶液中固定，酒精梯度脫水，石蠟包埋，制成厚度為 2 m 切片，進行Masson 三色染色。另外使用多聚賴氨酸處理切片，制作 4 m 組織切片待免疫組化檢測 CD45 和 CCR7 蛋白表達。另制作 3 m 組織切片待免疫組化檢測型膠原、CD45 雙陽性纖維細胞。2.2.4 血生化指標測定總膽固醇、甘油三酯和血清白蛋白采用全自動生化分析儀（日本島津 CL-7300型）測定。2.2.524 h 尿蛋白排泄率的測定2.2.5.1 酶標板操作1 標準曲線的繪制：取一塊酶標板，

28、按照下表加入試劑2 根據(jù)樣品數(shù)量，按 50 體積 BCA 試劑 A 加 1 體積 BCA 試劑 B（即 501）配制適量 BCA 工作液，充分混勻；3 各孔加入 200 L 的 BCA 工作液；14孔號01234567蛋白標準溶液（L）01248121620去離子水（L）2019181612840對應(yīng)蛋白含量（g）00.51.02.04.06.08.010.0安徽醫(yī)科大學碩士學位論文4 把酶標板放在振蕩器上震蕩 30 秒，37C 放置 30 分鐘，然后在 562 nm 下比色測定。以蛋白含量（g）橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線；5 稀釋待測樣品至合適濃度，使樣品稀釋液總體積為 20 L，

29、加入 BCA 工作液 200L，充分混勻，37C 放置 30 分鐘后，以標準曲線 0 號管作為參比，在 562 nm波長下比色，記錄吸光值；6 根據(jù)所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應(yīng)的蛋白含量（g），除以樣品稀釋液總體積（20 L），乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品實際濃度（單位g/ L）。2.2.5.2 分光光度計測定1 標準曲線的繪制各管按照下表加入試劑2 根據(jù)樣品數(shù)量，按 50 體積 BCA 試劑 A 加 1 體積 BCA 試劑 B（即 501）配制適量 BCA 工作液，充分混勻；3 各孔加入 1000 L 的 BCA 工作液；4 各管充分混勻，37C 放置 30 分鐘，然后在 562

30、nm 下比色測定。以蛋白含量（g）橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線；5 稀釋待測樣品至合適濃度，使樣品稀釋液總體積為 100 L，加入 BCA 工作液 1000L，充分混勻，37C 放置 30 分鐘后，以標準曲線 0 號管作為參比，在 562 nm波長下比色，記錄吸光值；6 根據(jù)所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應(yīng)的蛋白含量（g），除以樣品稀釋液總體積（100 L），乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品實際濃度（單位g/ L）。2.2.6 腎組織病理形態(tài)學分析2.2.6.1組織的取材、固定、脫水、透明、包埋以及切片的制作1 取材和固定取材后腎組織經(jīng)固定 24 小時（4%福爾馬林灌注取材的后固定

31、6-8 小時）之后，流水沖洗 24 小時，置于 70%80%乙醇溶液中，可長期保存。15孔號01234567蛋白標準溶液（L）051020406080100去離子水（L）1009590806040200對應(yīng)蛋白含量（g）02.55.010.020.030.040.050.0安徽醫(yī)科大學碩士學位論文2 脫水，透明和包埋 70%乙醇 1 h 80%乙醇 1 h 90%乙醇 1 h 95%乙醇 40 min 95%乙醇 40 min 無水乙醇 30 min 無水乙醇 30 min 二甲苯 20 min 二甲苯 30 min 石蠟 1 h 石蠟 1 h 石蠟 1 h 放置于室溫保存3 切片制作 用于免

32、疫組化染色的組織切片，其載玻片事先使用多聚賴氨酸處理 將保存在室溫下的蠟塊放置于-20C 冰箱中冷凍 5-10 min 取出冰凍后的蠟塊，使用 LEICA CM1800 切片機（美國徠卡公司產(chǎn)品）制作石蠟切片（Masson 染色切片為 2 m；檢測 CD45 和 CCR7 蛋白表達的免疫組化切片為 4 m；用于檢測纖維細胞的切片為 3 m）2.2.6.2Masson 三色染色1Masson 三色染色法步驟 4C 冰箱中取出切片室溫下復溫 30 min 二甲苯脫蠟 10 min 二甲苯脫蠟 10 min 無水乙醇 4 min 95%乙醇 4 min 80%乙醇 4 min 75%乙醇 4 min

33、16安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 雙蒸水沖洗 4 min 滴加 100 L 的 Masson 復合染液染色 5min 后，雙蒸水沖掉染液 滴加 100 L 的磷鉬酸染色 5 min 后，甩干 直接滴加 50 L 的苯胺藍染色 5 mn 后，雙蒸水稍沖 滴加 100 L 的分化液分化 30 s 95%乙醇 15 s 無水乙醇 15 s 放置于 60C 烤箱中直接烤干 二甲苯透明 15 s 后室溫下晾干 中性樹膠封片2 染色結(jié)果膠原纖維、粘液為藍色；肌肉、彈力纖維呈紅色；纖維素呈紫紅色；紅血球呈橘紅色；細胞核呈藍褐色。3 腎臟病理變化結(jié)果的判定腎小球硬化程度的評估：Masson染色參照Raij等12的

34、方法評估腎小球硬化程度，每張切片在顯微鏡200倍下連續(xù)觀察40個腎小球，根據(jù)腎小球硬化灶所占腎小球比例分為5個等級：0級：基本正常；1級：腎小球硬化面積 125：2級：硬化面積 2650：3級：硬化面積5175；4級：硬化面積達到76100。用公式計算出GSI表示腎小球硬化程度，每張切片GSI計算公式為：(1N1+2N2+3N3+4N4)每張切片腎小球總數(shù)100，式中N1代表1級損害腎小球個數(shù)，N2為2級損害腎小球個數(shù)，以此類推。腎小管間質(zhì)損傷程度的評估：Masson染色后在顯微鏡200倍下分別在左上、左下、右上、右下、中間各取兩個視野，每張切片共10個視野，依據(jù)小管擴張、小管細胞空泡變性、小

35、管萎縮、紅細胞管型、蛋白管型、間質(zhì)細胞浸潤、間質(zhì)水腫、間質(zhì)纖維化8項指標作TII評分13。2.2.7 腎組織中纖維細胞的檢測選取前后連續(xù)切片（A、B），A片以CD45（1：50）為一抗，AEC顯色；B片以型膠原（1：200）為一抗，DAB顯色。具體步驟如下：17安徽醫(yī)科大學碩士學位論文A 片的免疫組化染色（SP 法）13 m 厚的石蠟切片放置于 60C 烤箱中 20 min。2 常規(guī)脫蠟至水，自來水沖洗，雙蒸水沖洗。3 PBS（pH 7.2）漂洗 5 min3 次。40.01M 枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）在微波爐中（格蘭仕，800W，2450MHZ）加熱至沸騰后，將切片完全浸入枸櫞酸緩沖液中

36、，再放入微波爐中，使用中高火加熱12 min。5 取出后放置于室溫下逐漸冷卻至室溫后取出玻片，PBS 沖洗 5 min3 次。6 滴加復合消化酶增加抗原暴露 37C 30 min。7 PBS 沖洗 5 min3 次。8 給予 3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶 37C 15 min。9 PBS 沖洗 5 min3 次。10 給予內(nèi)源性生物素阻斷劑封閉內(nèi)源性生物素，滴加試劑 A（avidin Solution ）37C 15 min；PBS 沖洗 5 min3 次；滴加試劑 B（d-Biotin Solution）37C 15 min；PBS 沖洗 5 min3 次。11 加正常山羊血清 37C

37、25 min，封閉菲特異性抗原。12 輕輕甩去山羊血清。13 分別滴加小鼠抗大鼠 CD45 單克隆抗體（1200），陰性對照以無一抗的 PBS液替代，37C 30 min 后放入 4C 冰箱中過夜（12-18 h）。14 從 4C 冰箱中取出切片，37C 下復溫 30 min。15 PBS 沖洗 5 min4 次。16 滴加生物素化山羊抗兔 IgG（1200），37C 30 min。17 PBS 沖洗 5 min4 次。18 滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37C 30 min。19 PBS 沖洗 5 min4 次。20 室溫下滴加 AEC 顯色液，光學顯微鏡下控制顯色時間，水洗終止。21 放

38、置于 60C 烤箱中烘干。22 水性封片劑封片。B片的免疫組化染色（SP法）18安徽醫(yī)科大學碩士學位論文13 m 厚的石蠟切片放置于 60C 烤箱中 20 min。2 常規(guī)脫蠟至水，自來水沖洗，雙蒸水沖洗。3 PBS（pH 7.2）漂洗 5 min3 次。40.01M 枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）在微波爐中（格蘭仕，800W，2450MHZ）加熱至沸騰后，將切片完全浸入枸櫞酸緩沖液中，再放入微波爐中，使用中高火加熱12 min。5 取出后放置于室溫下逐漸冷卻至室溫后取出玻片，PBS 沖洗 5 min3 次。6 滴加復合消化酶增加抗原暴露 37C 30 min。7 PBS 沖洗 5 min3 次

39、。8 給予 3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶 37C 15 min。9 PBS 沖洗 5 min3 次。10 給予內(nèi)源性生物素阻斷劑封閉內(nèi)源性生物素，滴加試劑 A（avidin Solution ）37C 15 min；PBS 沖洗 5 min3 次；滴加試劑 B（d-Biotin Solution）37C 15 min；PBS 沖洗 5 min3 次。11 加正常山羊血清 37C 25 min，封閉菲特異性抗原。12 輕輕甩去山羊血清。13 分別滴加兔抗大鼠型膠原多克隆抗體（1200），陰性對照以無一抗的 PBS液替代，37C 30 min 后放入 4C 冰箱中過夜（12-16 h）。14

40、從 4C 冰箱中取出切片，37C 下復溫 30 min。15 PBS 沖洗 5 min4 次。16 滴加生物素化山羊抗兔 IgG（1200），37C 30 min。17 PBS 沖洗 5 min4 次。18 滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37C 30 min。19 PBS 沖洗 5 min4 次。20 室溫下滴加 DAB 顯色液，光學顯微鏡下控制顯色時間，水洗終止，蘇木素復染（1-2min），鹽酸酒精分化(2-5s)，氨水返藍（30s）。21 無水乙醇 4 min。22 95%乙醇 4 min。23 80%乙醇 4 min。19安徽醫(yī)科大學碩士學位論文24 75%乙醇 4 min。25 二甲

41、苯透明 10 min2 次。26 室溫下晾干后中性樹膠封片。纖維細胞的判定：A 片上細胞胞漿呈紅色染色為陽性；B 片上胞漿呈棕黃色染色為陽性。采集前后兩張組織切片圖像，利用 photoshop 重疊兩組圖像觀察是否有胞漿中同時存在兩種染色的細胞存在，若有，表明該細胞同時表達兩種蛋白即可鑒定該細胞為纖維細胞。為控制結(jié)果的準確性，實驗中必須使用連續(xù)切片，且切片的厚度、圖像分析所選擇的色光均需相同。2.2.8 免疫組化染色觀察腎組織中 CD45 和 CCR7 蛋白表達2.2.8.1 腎組織中CD45蛋白表達的測定SP 法14 m 厚的石蠟切片放置于 60C 烤箱中 20 min。2 常規(guī)脫蠟至水，自來水沖洗，雙蒸水沖洗。3 PBS（pH 7.2）漂洗 5 min3 次。40.01M 枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）在微波爐中（格蘭仕，800W，2450MHZ）加熱至沸騰后，將切片完全浸入枸櫞酸緩沖