第六章人工種子的研制

1、第六章 人工種子的研制 第一節(jié) 人工種子概述 一、人工種子的概念及發(fā)展Murashige（1978）首次提出人工種子（artificial seed）的概念。最初人工種子是指人工種皮（膠囊）包裹單個發(fā)育良好的體細胞胚胎（即具有發(fā)育成完整植株的能力），適量的人工胚乳及其它成分，使之像種子一樣，可以在田間播種萌發(fā)。Kitto等（1981）首次用聚氧乙烯包裹胡蘿卜胚狀體制成人工種子。自Bapat等（1987）首次報道桑樹對腋芽包裹、貯藏和萌發(fā)以來，人工包裹的繁殖體不一定局限于體細胞胚胎，可以是頂芽、腋芽、帶有頂芽或腋芽的微切段、小鱗莖、原球莖、不定芽、花粉胚、小植株等，也可以是未完全分化的擬分生組織

2、、細胞團或愈傷組織等，人工種子的概念已較為寬泛，如以腋芽為材料的作物有煙草、花葉芋、蕹菜、桑樹、姜、香蕉、甘薯等。Kamada（1985）就將用人工種膜膠囊包裹能發(fā)育成植株的一個培養(yǎng)物、組織塊或器官都稱為人工種子。以芽等類體胚材料制成的人工種子變異程度低、萌芽率及成苗高，尤其是對于一些木本植物難以獲得數(shù)量多、質(zhì)量高的體細胞胚胎，因而具有更大的優(yōu)越性。人工種子又稱為合成種子（synthetic seed）、人造種子（man-made seed）、無性種子或體細胞種子（asexual seed或somatic seed）等。 從人工種子的包裹方法、包裹內(nèi)容及播種方法角度，人工種子分為廣義和狹義兩種

3、。.狹義的人工種子是指將組織培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體包裹在含有養(yǎng)分和有保護功能的物質(zhì)中，能在一定條件下發(fā)芽成苗的顆粒體。廣義的人工種子研制包括以下幾種情況：（1）經(jīng)或不經(jīng)干燥處理，不經(jīng)包裹成球狀結(jié)構(gòu)而直接播種的體細胞胚。Gray（1987）報道將鴨茅的體細胞胚干燥，使其水分含量為13%，可播種萌發(fā)。（2）用聚氧乙烯等多聚物將多個體細胞胚胎包裹成的餅狀物。如Kitto和Janick（1982）用聚氧乙烯包裹胡蘿卜胚性懸浮物（包含細胞、細胞團、愈傷組織塊及成熟胚狀體），有3%包裹的干燥體細胞胚存活。（3）將體細胞胚胎混在膠中，用流質(zhì)播種法直接播種。如Baker（1985）將胡蘿卜體細胞胚與蔗糖、激素及流

4、體膠混合播種。（4）用凝膠包裹頂芽、腋芽或小球（體）莖制成球形人工種子。Redenbaugh等（1986）用海藻酸鈉水凝膠法包裹苜蓿單個體細胞胚，播種于溫室，成株率可達20%。 典型的人工種子由人工種皮、人工胚乳和胚狀體（或芽）三部分組成（圖6.1）。最外層為人工種皮，要求質(zhì)地柔軟，能保護內(nèi)部的體細胞胚胎，使人工種子能經(jīng)得起生產(chǎn)、貯存、運輸和種植過程中的機械碰撞，并且不能對胚胎有毒害作用。中間為人工胚乳，人工胚乳應(yīng)含有營養(yǎng)物質(zhì)、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（加植物激素），以及其他發(fā)芽和植物初期生長所需的成分，人工胚乳應(yīng)能控制營養(yǎng)成分逐漸釋放。還可在人工胚乳中加入一些促進生長的微生物、農(nóng)藥、抗生素等，使體細胞胚

5、胎能在不滅菌的土壤中萌發(fā)和健康生長。最內(nèi)側(cè)為體細胞胚或芽，體細胞胚應(yīng)發(fā)育正常，表型一致。人工種子應(yīng)易于播種，使種植者容易接受等。 圖6.1 人工種子及其萌發(fā)。左圖為人工種子示意圖（Redenbaugh，1990），中圖為用海藻糖包裹胚狀體制成的芹菜人工種子，右圖為水稻人工種子的發(fā)芽 二、人工種子的研制的意義二、人工種子的研制的意義（一）繁殖產(chǎn)生人工種子速度快、數(shù)量多、效率高。例如用液體培養(yǎng)基方法在1升培養(yǎng)基中可產(chǎn)生10萬個體細胞胚胎，而在一個體積為12升的發(fā)酵罐中，20多天內(nèi)生產(chǎn)的胡蘿卜體細胞胚可制成1000萬粒人工種子。與微繁殖一樣，它不受季節(jié)氣候和空間的限制，可全年進行，具有占空間小，快速

6、、高效等優(yōu)點。（二）與微繁殖一樣，人工種子屬無性繁殖，不存在基因型和表現(xiàn)型的分離，非常適于固定和繁殖雜種（尤其是需三系配套生產(chǎn)的雜種一代）及雄性不育系、優(yōu)良單株、突變體及遺傳工程篩選出的優(yōu)良基因型等。另外，對一些珍稀名貴品種或經(jīng)濟價值較高的品種、不能產(chǎn)生種子、種子發(fā)育不全、或自然條件萌發(fā)率極低的植物，以及存在較長的幼年期（或童期）的木本樹種等也具有重要的應(yīng)用前景。（三）人工種子內(nèi)可以加入農(nóng)藥、菌肥或有益微生物及激素等，改善和調(diào)節(jié)植物的抗逆能力和生長發(fā)育。（四）利用體細胞胚胎發(fā)生途徑可進行基因轉(zhuǎn)移，因此人工種子可作為遺傳工程的受體或向生產(chǎn)實踐應(yīng)用的橋梁。（五）與試管快繁相比，人工種子操作方便，便

7、于運輸、貯存及機械化作業(yè)，節(jié)省勞動力和生產(chǎn)成本。這對快繁苗木及人工造林等方面具有很大的應(yīng)用優(yōu)勢。 第二節(jié)第二節(jié) 人工種子生產(chǎn)的程序和技術(shù)人工種子生產(chǎn)的程序和技術(shù)一、人工種子生產(chǎn)的程序和技術(shù) 人工種子生產(chǎn)的程序和技術(shù)如圖6.2。其關(guān)鍵技術(shù)包括植物大規(guī)模體細胞胚胎發(fā)生、體細胞胚胎生長發(fā)育的同步化、體細胞胚胎的成熟、單個體細胞胚胎的分離、體細胞胚的包裹及人工胚乳研制、人工種子的貯藏和轉(zhuǎn)換等幾個重要環(huán)節(jié)。 圖6.2 人工種子生產(chǎn)的程序和技術(shù) （一）大規(guī)模體細胞胚胎發(fā)生 體細胞胚胎可從器官外植體、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細胞、原生質(zhì)體及花粉等產(chǎn)生。主要針對大規(guī)模體細胞胚胎發(fā)生的各種條件進行研究，如外植體選擇，

8、在培養(yǎng)基中附加植物激素（種類、濃度和組合）、氮源（種類和濃度）、氨基酸、椰子汁、活性炭等物質(zhì)，培養(yǎng)步驟（一步法或兩步法）和培養(yǎng)方法（液體或固體培養(yǎng)）等。目前，能夠進行大規(guī)模體細胞胚胎發(fā)生的植物種類有限。人工種子主要使用二倍體體胚，單細胞的花粉胚會存在遺傳分離和不育等問題。胚狀體發(fā)生若采用兩步法，即經(jīng)愈傷組織培養(yǎng)后間接體細胞胞胚胎發(fā)生途徑，容易產(chǎn)生體細胞無性系變異。不經(jīng)愈傷組織培養(yǎng)階段，直接從外植體上誘導(dǎo)體細胞胚胎，又不能利用發(fā)酵罐進行大規(guī)模體細胞胚胎發(fā)生，產(chǎn)生的數(shù)量有限。另外，在體細胞胚胎發(fā)育過程中，還會出現(xiàn)胚狀體的早熟或提早萌發(fā)，或形成次生胚，或形成畸形胚或發(fā)育不完全胚等問題。因此通對培養(yǎng)基

9、成分和體外培養(yǎng)條件的控制，探索大規(guī)模體細胞胚胎發(fā)生的最適培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法仍然是一個主要的問題。 圖6.3 大規(guī)模胡蘿卜體細胞胚胎發(fā)生。左圖為對細胞懸浮培養(yǎng)所用的旋轉(zhuǎn)-過濾生物反應(yīng)器；中圖為部分生長在反應(yīng)器內(nèi)的胡蘿卜體細胞胚胎群體；右圖為整齊一致的胡蘿卜體細胞胚胎 圖6.4 芹菜下胚軸培養(yǎng)產(chǎn)生大量體細胞胚（左）及包埋后的人工種子（右） （二）體細胞胚胎生長發(fā)育的同步化（二）體細胞胚胎生長發(fā)育的同步化 在培養(yǎng)中胚狀體的發(fā)生往往是不同步的，常常在同一外值體上可以觀采到不同發(fā)育時期的大大小小的胚狀體。胚狀體發(fā)生的不同步性，為人工種子的研究帶來麻煩。體細胞胚胎生長發(fā)育的同步化有以下幾種：（1）

10、在細胞培養(yǎng)中加入細胞分裂和DNA合成的選擇抑制劑如五氨基尿嘧啶等，或采用低溫處理和營養(yǎng)物質(zhì)饑餓法等措施抑制細胞分裂，然后除去抑制劑或抑制條件，細胞可進行同步分裂，從而達到體細胞胚胎發(fā)生的同步化。另一方面，在細胞培養(yǎng)液中通入乙烯或氮氣可提高分裂細胞所占的比例。（2）利用一定孔徑的篩網(wǎng)過濾分選或儀器分選，或Ficoll溶液中密度梯度離心選擇胚性細胞團，然后轉(zhuǎn)移到胚胎發(fā)育培養(yǎng)基上進行同步發(fā)育。（3）利用不同發(fā)育階段的體細胞胚胎對滲透壓的不同要求，通過調(diào)節(jié)滲透壓來控制體細胞胚胎同步發(fā)育到某一階段。 （三）體細胞胚胎的成熟（三）體細胞胚胎的成熟植物體細胞胚胎發(fā)育經(jīng)歷類似于合子胚發(fā)育過程。植物體細胞胚或花

11、粉胚發(fā)育過程也可明顯分為幼胚和成熟胚，只有成熟胚才能在成苗培養(yǎng)基上形成完整小植株。解剖學(xué)觀察表明，幼胚發(fā)育開始即有明顯的極性，它們僅具有器官分化的潛力，但還沒有器官原基。從幼胚轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒炫叩闹匾獦?biāo)志是器官分化的逐步完成。頂芽和真葉的形成是十分重要的。在草本植物中從幼胚發(fā)育為成熟胚的過程很快，所需營養(yǎng)條件也無明顯差異，而在木本植物中由幼胚至成熟胚的過程要更換幾次相同的或不相同的培養(yǎng)基，才能使整株誘導(dǎo)率有所提高。采用4低溫處理對有些植物的體細胞胚胎成熟具有明顯的促進作用。除利用解剖觀察外，人們現(xiàn)在通過生化和分子標(biāo)記來同工酶電泳譜帶鑒定篩選成熟胚。人工種子研制中獲得高質(zhì)量的體細胞胚胎是十分重要的，這

12、不僅是指體細胞胚要發(fā)育正常同步、成熟整齊一致，也要遺傳穩(wěn)定，成株率高，避免采用畸形胚及發(fā)生體細胞無性系變異。高質(zhì)量的體細胞胚胎通常發(fā)育完全，具有明顯的胚根和胚芽雙極性結(jié)構(gòu)，生長健壯，下胚軸不膨大，無愈傷組織化，發(fā)育同步性程度高，經(jīng)分選后大小基本一致，播種后能及時萌發(fā)出苗，根與芽幾乎同時生長，萌發(fā)及成苗整齊、正常、無畸形，具有一定抗逆性，成活力高等。如利用腋芽作為包裹材料時，應(yīng)注意芽之間的異質(zhì)性，應(yīng)選擇發(fā)育良好的成熟的可萌動的芽，除去休眠芽及發(fā)育不良的芽。 （四）單個體細胞胚胎的分離 在單個體細胞胚胎包裹這前，可利用機械切割或在2%蔗糖溶液中浮力不同分級篩選1.0 mm長度或以上的單個體細胞胚。

13、 （五）體細胞胚的包裹及人工胚乳研制（五）體細胞胚的包裹及人工胚乳研制 1. 膠囊和膠囊膜制備膠囊和膠囊膜制備材料人工種子研制所用的包裹材料（有時也稱為人工種皮或內(nèi)種皮）要求質(zhì)地柔軟，能保護內(nèi)部的體細胞胚胎并且不能對胚胎有毒害作用，另外要求通氣效果好，能形成膠囊，抗壓性好，不粘連，適于貯藏、運輸和播種。常用的包裹材料有藻酸鹽、藻酸鹽-明膠、瓊脂糖、瓊脂等，但由于藻酸鹽膠凝性好、使用方便、無毒性和價格低廉，目前以藻酸鹽應(yīng)用較多。Redenbaugh等（1986）采用海藻酸鈉作包裹材料，制成苜蓿人工種子，離體成株率達86%，播種于溫室，成株率可達20%。雖然海藻酸鈉應(yīng)用較廣，但以海藻酸鈉單一材料包

14、埋體細胞胚及類體胚材料也存在不少缺點，如保水性差、水溶性成分及助劑易滲漏、易干燥失水、干燥后不能吸水回脹、易粘連、機械強度差，從而影響到人工種子的貯藏、運輸、播種和萌芽。許光學(xué)等（1990）采用纖維素衍生物與海海藻酸鈉制成復(fù)合改性的包埋基質(zhì)，可提高包裹材料的透氣性。黃紹興等（1995）用木薯淀粉與海海藻酸鈉制成復(fù)合包埋基質(zhì)，可改善海海藻酸鈉的吸水性。Timber等（1995，1996）在海海藻酸鈉中加入多糖、樹膠、高嶺土等可減慢凝膠脫水的速度。日本麒麟啤酒公司與美國植物遺傳工司（PGI）聯(lián)合研制成一種新的包埋膠膠衣，可在一定條件下自行裂開，順利萌發(fā)。由于單一包裹材料存在的缺陷，因此許多研究者對

15、膠囊膜材料（外種皮）進行了試驗，但只有Elvax 4260效果較好。Ling-Fong Tay（1993）年用殼聚糖作為外種皮制作油菜人工種子。除涂復(fù)外膜外，許多研究者還采用組合包埋法、流體播種法、液膠包埋法、瓊脂或鋁膠囊等包埋法等新的方法。許光學(xué)等（1990）篩選聚合物材料對人工種子進行包埋。George等（1995）用硅膠包埋谷子體細胞胚，萌發(fā)率達82%，在4條件下貯藏14天可自行裂開萌發(fā)。 膠囊和膠囊膜制備方法 膠囊制備法有點滴膠體絡(luò)合法（gel complexation via a dropping procedure）和鑄模法（molding）。下面以Redenbaugh等（1986

16、，1990）用2%海藻酸鈉對苜蓿的體細胞包裹介紹一下用點滴膠體絡(luò)合法進行的膠囊制備法方法。首先將體細胞胚放入2海藻酸鈉點滴中，然后將海藻酸鈉包裹的體細胞胚圓滴滴入適量的二價或三價的金屬鹽（如100 mM硝酸鈣），通過離子交換反應(yīng)，表面的絡(luò)合作用立即開始，點滴在1530分鐘內(nèi)可形成膠囊，但不同絡(luò)合時間對多少膠囊凝固及膠囊的硬度有影響。膠囊的大小可以通過改變滴出藻酸鹽點滴的吸管或漏斗出口內(nèi)徑來控制，制作直徑約5 mm的膠囊，可選用內(nèi)徑為4.0 mm毫米的吸管口（圖6.5）。膠囊膜制備時，首先將0.1 g葡萄糖和0.2 ml甘油放入2 ml氫氧化鈣溶液，再加入4 g藻酸鈣膠囊，攪拌一分鐘，這樣可改變

17、藻酸鹽膠囊表面特性，形成弱親水性的表面。另外，配制Elvax 4260聚合溶液（先制備好50 ml環(huán)乙烷，其中含有10的Elvax 4260。將5 g硬脂酸、10 g鯨蠟醇、25 g鯨蠟替代物在40的條件下混合在一起，然后將配制的溶液與含有Elvax 4260的295 ml石油醚和155 ml二氯甲烷混合在一起，制成Elvax 4260聚合溶液），將膠囊小心地浸入熱的Elvax 4260聚合溶液中1至6次，每次浸10秒鐘，每次浸入之前，要將膠囊用流動的暖風(fēng)吹干，干了后再浸第二下。這樣Elvax 4260聚合溶液凝結(jié)在藻酸鹽膠囊的周圍，形成一層疏水外皮。最后用石油醚清洗膠囊，然后吹干即可。 圖6

18、.5 用漏斗分離器生產(chǎn)藻酸鈣包裹體 2. 人工胚乳的研制人工胚乳的研制 人工胚乳對人工種子提高成苗率至關(guān)重要。研究表明，即使無胚乳植物苜蓿體細胞胚的包裹材料中不加任何東西，成苗率也為零。大量元素、碳水化合物如淀粉、粗制藻酸鹽和蔗糖等用來研究作為人工胚乳的材料。目前采用兩條技術(shù)途徑來研究人工胚乳，一條是在凝膠囊中加入碳水化合物，另一條是微型包裹養(yǎng)分，使其在人工種子內(nèi)有控制地釋放。Redenbaugh（1990）研究表明，在苜蓿人工種子包裹材料中加入1/2 SH成分，以小麥淀粉或粗制藻酸鹽作為碳源可提高成苗率。另外，也研究了利用溶劑蒸發(fā)法和絡(luò)合凝聚法對蔗糖進行包裹成微膠囊，風(fēng)干后放入藻酸鹽膠囊內(nèi)或表面的方法，但效果并不理想。黃紹興等（1995）利用木薯淀粉與1.5%海藻酸鈉（1/2MS培養(yǎng)基配制）混合制作胚乳。在人工胚乳中加入赤霉素可能有利于人工種子的萌發(fā)，加氯化鈣有利于供氧，加活性炭有利于營養(yǎng)固定的緩釋等。為了能在有菌土壤中播種，人工胚乳還可加入防腐劑、抗生素、農(nóng)藥、有益細菌等。 （六）人工種子的貯藏 人工種子的貯藏是人工種子應(yīng)用農(nóng)林生產(chǎn)的一個十分重要的問題，也是難題之一。目前對人工種子的貯藏的方法有低溫法、干燥法（或干化處理法）、抑制劑法、液體石蠟法及