基因工程綜合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)大綱

1、7,1基因工程綜合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)大綱基因工程（跨課程）綜合實(shí)驗(yàn)講義基因工程 ? 發(fā)酵工藝原理 ? 生物技術(shù)藥物藥劑與藥動學(xué)廣東藥學(xué)院 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院2006年6月非正式出版物，請勿外傳）目錄一、實(shí)驗(yàn)安排日程表 .二、目的和意義 .三、課程介紹和課堂討論7四、實(shí)驗(yàn)實(shí)施828五、實(shí)驗(yàn)考核六、附錄 附錄一：講義 附錄二：知識競賽規(guī)則及試題、實(shí)驗(yàn)安排日程表上午下午晚上課程介紹和課堂討論（黃、 邵）預(yù)備試劑（董、段）-二二放大培養(yǎng)（董、段）、動物 操作練習(xí)（袁、楊）質(zhì)粒提取（董、段）電泳、裝柱（董、段）過柱純化（董、段）四電泳檢測、小結(jié)（董、段）動物操作練習(xí)（袁、楊）五何瘤昆明小鼠模型的建立（袁、楊）

2、、 六第周日一一一細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)講解（沈、吳）轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)（沈、吳）-二二加血清（沈、吳）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)講解 （沈、吳）-三細(xì)胞換液、MTTMTT法原理講 解（沈、吳）流式細(xì)胞技術(shù)講解 （沈、吳）四MTTMTT 法和 AnnAnn exinexin V/PIV/PI 法的細(xì)胞接種（沈、吳）流式細(xì)胞技術(shù)檢測TCRTCR V V 37.17.1的表達(dá)（盧）五MTTMTT法檢測淋巴細(xì)胞的殺 腫瘤細(xì)胞能力（沈、吳）流式細(xì)胞技術(shù)檢測腫 瘤細(xì)胞的凋亡（沈、吳）六用經(jīng)基因工程藥物處理的PBLCPBLC處理動物膜型（袁、 楊）第二日-*蛋白類基因工程藥物發(fā)酵 原理講解（趙）實(shí)驗(yàn)預(yù)備（趙）_二起始菌濃度及誘導(dǎo)時(shí)刻對蛋白

3、產(chǎn)物量的阻礙（趙）-*培養(yǎng)溫度對菌體生長及蛋白產(chǎn)物量的阻礙（趙）四起始pHpH值對蛋白產(chǎn)物量的阻礙（趙）五發(fā)酵過程還原糖含量的變化及補(bǔ)糖對發(fā)酵的阻礙（趙）、 六核酸藥物TCRTCR V V P 7.17.1在荷 瘤昆明小鼠體內(nèi)的分布（示 教）（袁、楊）日二、目的和意義基因工程技術(shù)是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、制藥學(xué)以及有關(guān)專業(yè)最重要的課程之 一，專門是關(guān)于生物制藥專業(yè)的學(xué)生來講，基因工程技術(shù)是他們學(xué)習(xí)的核 心內(nèi)容之一，在本科時(shí)期培養(yǎng)他們對這門課程的愛好，使他們把握基因工 程差不多的操作技能和方法，熟悉基因工程的操作流程，并對他們的動手 能力和科學(xué)思維進(jìn)行錘煉，關(guān)于他們今后的工作和進(jìn)一步的學(xué)習(xí)具有專門 重要的

4、意義。本院是一個院所合一的單位，為了發(fā)揮以科研促教學(xué)的優(yōu)勢, 同時(shí)為了使學(xué)生對基因工程在制藥專業(yè)上的應(yīng)用有一個更加全面的認(rèn)識， 我們選取了自己一部分的科研工作用于學(xué)生的基因工程綜合性實(shí)驗(yàn)，其中 涵蓋了核酸類基因工程藥物和蛋白多肽類基因工程藥物的關(guān)鍵技術(shù)。此次 綜合實(shí)驗(yàn)按照從上游到下游的順序分為數(shù)個單元，要緊包括分子生物學(xué)技 術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)、藥劑與藥代動力學(xué)技術(shù)以及蛋白發(fā) 酵技術(shù)等。三、課程介紹及課堂討論第一部分：基因工程介紹一、 基因工程技術(shù)概述 基因工程制藥：利用基因工程的手段生產(chǎn)藥物。70 年代基因工程產(chǎn)生， 1977年顯現(xiàn)第一個重組的生長激素抑制因子， 1982年基因重

5、組產(chǎn)品人胰島素在美國咨詢世， 自20世紀(jì) 80年代以來， 僅美國、日本開發(fā)的生物新技術(shù)新藥物便達(dá) 200多種，大差不多上重組蛋 白質(zhì)藥物和重組 DNA 藥物。美國是現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)源地，也是應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)研制新型藥物 的第一個國家，多種新型藥物首創(chuàng)于美國。現(xiàn)有的近1300多家生物制藥技術(shù)公司，資本總額已超過 400 億美元。基因工程藥物大體分為：蛋白類藥物（酶、細(xì)胞因子、激素、單抗等） 核酸類藥物（基因治療）基因工程制藥的特點(diǎn)：方便、快捷、可工業(yè)化生產(chǎn)二、 基因工程制藥的流程1、核酸類基因工程制藥的流程獲得目的基因T插入載體T導(dǎo)入表達(dá)宿主T誘導(dǎo)表達(dá)T提取純化目的 蛋白7檢測活性7動物實(shí)驗(yàn)7臨

6、床試驗(yàn)。2、蛋白多肽類基因工程制藥的流程獲得目的基因T插入載體T擴(kuò)增后提取純化質(zhì)粒T導(dǎo)入特定細(xì)胞T檢 測活性T動物實(shí)驗(yàn)T臨床實(shí)驗(yàn)。3、兩者異同點(diǎn) 測活：方法不一樣，但目的一樣。 工藝：核酸藥的制備一樣來講較簡單， 給藥方式：核酸藥的給藥方式較復(fù)雜三、 基因工程技術(shù)中一些關(guān)鍵的技術(shù)核酸提取和純化、逆轉(zhuǎn)錄、PCR、重組載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染、誘導(dǎo) 表達(dá)、蛋白提取和純化四、 基因工程技術(shù)需要注意的一些咨詢題1、目的基因的獵取C1C1 10X10X 未轉(zhuǎn)仲丁PULPUL醫(yī)-7402-7402C5C5 lOXlOX Vp7Vp7 ,PBLh,PBLh；-74O2-74O22、載體的選擇原則3、表達(dá)系統(tǒng)的

7、選用原則4、活性檢測的方式方法五、與此次實(shí)驗(yàn)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容介紹結(jié)合科研工作介紹起初的選題背景和研究思路腫瘤一直是困擾人類的一類重大疾病，對它的治療一直是大夫和科學(xué) 家們重點(diǎn)研究的目標(biāo)之一。研究發(fā)覺，機(jī)體內(nèi)發(fā)揮要緊抗腫瘤作用的細(xì)胞 是淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞通過體液免疫和細(xì)胞免疫兩種方式發(fā)揮抗腫瘤作用， 一樣認(rèn)為其中細(xì)胞免疫發(fā)揮著要緊的抗腫瘤作用。目前查找腫瘤特異抗原 的工作進(jìn)展不是專門順利，給腫瘤的診斷治療和研究其發(fā)病機(jī)理帶來了 專門大的困難。我們“TCR負(fù)責(zé)識不抗原這一理論基礎(chǔ)動身，應(yīng)用基因優(yōu) 勢取用方法，利用不同的腫瘤細(xì)胞刺激 T細(xì)胞，檢測TCR家族的表達(dá)譜變 化，從而初步確定特異性識不不同腫瘤

8、抗原的 TCR分子家族，在我們的研究中發(fā)覺，腫瘤患者的TCR V P基因表達(dá)均有不同程度的 減弱，即優(yōu)勢表達(dá)一個或少數(shù)幾個 TCR V P亞家族，同時(shí)其它TCR V P 亞家族明顯減少或完全缺如，即有受體偏移現(xiàn)象。如圖：我們將與肝癌識不有關(guān)的可變區(qū)屬于 VP 7家族的TCR基因轉(zhuǎn)入淋巴 細(xì)胞，然后將該種淋巴細(xì)胞同肝癌細(xì)胞共孵育，發(fā)覺該 TCR分子不僅具有 識不肝癌細(xì)胞的作用，還有激活 T細(xì)胞并增強(qiáng)其殺傷能力的功能，如圖：A對比組 B單純PBMC組C TCR轉(zhuǎn)基因組J.片A,乍#n-, F -.crT 20XTCR基因轉(zhuǎn)染組L體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也顯示轉(zhuǎn)染了該TCR分子的淋巴細(xì)胞能夠有效殺傷接種于 SCID

9、小鼠體內(nèi)的人肝癌細(xì)胞。如圖：J.f 廠 腫瘤組織大體照片TCR基因轉(zhuǎn)染組HE染色，CA染色，20 XHE染色和免疫組化顯示淋巴細(xì)胞浸潤此次實(shí)驗(yàn)所要操作的具體內(nèi)容介紹結(jié)合大伙兒往常的基礎(chǔ)，此次綜合性實(shí)驗(yàn)要緊包括以下要緊內(nèi)容：（1）核酸類基因工程藥物部分提取和純化攜帶V P 7.1家族TCR基因的重組質(zhì)粒；將純化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人淋巴細(xì)胞，然后利用流式細(xì)胞儀檢測所轉(zhuǎn)基因的 表達(dá)情形；分不利用流式細(xì)胞儀和 MTT 法檢測轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的體外 殺傷情形；構(gòu)建荷人肝癌細(xì)胞瘤昆明小鼠模型（考慮到學(xué)生人數(shù)較多和飼養(yǎng)條件 的限制，用昆明小鼠代替 SCID 鼠）；將轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞注射至荷瘤小鼠體內(nèi)的癌旁組織

10、，并檢測其在荷瘤 小鼠體內(nèi)的分布；利用免疫組化檢測所轉(zhuǎn) TCR 基因在小鼠體內(nèi)的分布（因時(shí)刻所限，將 往常所做結(jié)果利用多媒體形式向?qū)W生展現(xiàn)、講解） 。（2）蛋白多肽類基因工程藥物部分 考慮到往常學(xué)生差不多進(jìn)行過基因擴(kuò)增、重組、轉(zhuǎn)化和克隆等有關(guān)實(shí) 驗(yàn)，此次就以摸索發(fā)酵條件為要緊內(nèi)容，包括：起始菌濃度及誘導(dǎo)時(shí)刻對表達(dá)產(chǎn)物的阻礙； 培養(yǎng)溫度對表達(dá)產(chǎn)物的阻礙； 起始誘導(dǎo) pH 值對表達(dá)產(chǎn)物的阻礙； 通氣量對表達(dá)產(chǎn)物的阻礙； 還原糖含量和補(bǔ)糖對表達(dá)產(chǎn)物的阻礙。3、闡明此次實(shí)驗(yàn)所要達(dá)到的目的，關(guān)心學(xué)生明白得基因工程技術(shù)在制 藥上應(yīng)用的。第二部分：課堂提咨詢與討論 第三部分：學(xué)生復(fù)述自己對基因工程制藥技術(shù)的

11、明白得 小結(jié)四、實(shí)驗(yàn)實(shí)施在實(shí)驗(yàn)實(shí)施的過程中，每個實(shí)驗(yàn)單元由一位主講教師總體負(fù)責(zé)，每個單元的實(shí)驗(yàn)課開始前第一由主講教師對實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、操作要點(diǎn)等 進(jìn)行詳細(xì)的講解，點(diǎn)明需要專門注意的地點(diǎn)，并承上啟下地點(diǎn)明此次實(shí)驗(yàn) 在整個綜合實(shí)驗(yàn)中的位置，如此的集體授課保證了學(xué)生知識的統(tǒng)一性。在 實(shí)驗(yàn)的具體實(shí)施過程中，學(xué)生分組進(jìn)行操作，每個組由一位帶教老師具體 負(fù)責(zé)，針對學(xué)生實(shí)驗(yàn)過程中顯現(xiàn)的各種咨詢題進(jìn)行及時(shí)的糾正和指導(dǎo)，回 答學(xué)生的提咨詢，并負(fù)責(zé)組織學(xué)生對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行討論，如此不僅能夠保 證學(xué)生能夠得到及時(shí)、正確的指導(dǎo)，同時(shí)也加深了學(xué)生們對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的明 白得和把握，關(guān)于提升他們的操作技能、錘煉他們分析咨詢題

12、解決咨詢題 的能力都專門有關(guān)心。在實(shí)驗(yàn)過程中，除了保證實(shí)驗(yàn)整體流程的完整性和一致性，我們還在 不同小組間安排了一些差異化的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。例如，在重組蛋白發(fā)酵條件優(yōu) 化實(shí)驗(yàn)中，我們安排不同的小組分不對構(gòu)建在不同載體上的兩個重組蛋白 進(jìn)行發(fā)酵條件的摸索，這無形中在學(xué)生們中間形成了一種競爭，每個小組 都爭取把自己的結(jié)果做得更好，更能講明咨詢題，如此就需要整個組的成 員相互協(xié)作、共同努力，通過如此的實(shí)驗(yàn)，學(xué)生的團(tuán)隊(duì)精神得到了培養(yǎng)。 不僅如此，我們還將每個組細(xì)分為五對搭檔，將要優(yōu)化的幾個發(fā)酵條件， 如，起始誘導(dǎo) OD 濃度、誘導(dǎo)時(shí)刻、誘導(dǎo)溫度、還原糖含量、通氧狀況等 分不交由每組不同的搭檔組合輪番負(fù)責(zé)，其他

13、同學(xué)為他們做一些輔助工作， 這又更進(jìn)一步地培養(yǎng)了學(xué)生的相互合作精神。通過如此的實(shí)驗(yàn)，我們期望 學(xué)生不僅能學(xué)到專業(yè)知識也能夠?qū)W到團(tuán)隊(duì)合作精神，這關(guān)于他們今后的工 作和學(xué)習(xí)差不多上專門有好處的。實(shí)驗(yàn)講義見附錄一。五、實(shí)驗(yàn)考核在大實(shí)驗(yàn)終止之后，為了檢驗(yàn)學(xué)生對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的把握情形，我們組織 學(xué)生開展了一次知識競賽，競賽要考察的內(nèi)容確實(shí)是一些關(guān)于基因工程的 重要的基礎(chǔ)知識和試驗(yàn)操作中需要注意的一些重要環(huán)節(jié)。通過這種生動爽 朗的形式，有力地激發(fā)了學(xué)生們的學(xué)習(xí)愛好，同時(shí)使他們的知識和技能在 不知不覺中得到了進(jìn)一步的鞏固和提升。另外，為了錘煉學(xué)生的寫作能力，并使他們對這次的綜合性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 進(jìn)一步的總結(jié)和提煉，我

14、們要求學(xué)生按照學(xué)術(shù)論文的格式撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告， 全文包括摘要、前言、材料與方法、結(jié)果與討論等幾部分。我們從科學(xué)期 刊中選取例文給學(xué)生們詳細(xì)講解了撰寫科技論文時(shí)要注意的一些咨詢題。 通過如此的模擬訓(xùn)練，我們期望能夠使學(xué)生更多地了解關(guān)于科研工作的一 些東西，次外，如此的寫作經(jīng)歷關(guān)于學(xué)生今后畢業(yè)論文的寫作以及進(jìn)一步 的學(xué)習(xí)與深造也是專門好的錘煉。知識競賽的內(nèi)容見附錄二。學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告范例見附錄三。六、附錄附錄一：實(shí)驗(yàn)講義（一）質(zhì)粒PCDNA3.1-TCRV （3 7.1的提取和純化 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模豪脤游黾夹g(shù)分離質(zhì)粒 DNA 實(shí)驗(yàn)原理：通過堿裂解制備的質(zhì)粒 DNA ，還含有基因組 DNA、RNA 以及蛋白質(zhì)的

15、污染，純度不是專門高，不能滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。常見對 質(zhì)粒DNA進(jìn)一步純化的方法包括酚/氯仿、CsCL密度梯度離心、離子交換 層析等。在 PH8.0 條件下，質(zhì)粒 DNA 帶負(fù)電荷，且電荷數(shù)目與基因組 DN A、 RNA 等存在一定的差異，因此，可利用該性質(zhì)，通過離子交換層析， 將其分開。所用試劑：LB培養(yǎng)基（300ml）:稱取胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g, NaCl 10g, 置于500ml三角瓶中，加H2O至300ml，用NaOH調(diào)pH至7.0,于121C 滅菌20min，冷卻后備用臨用前按1:500倍體積加入卡拉霉素溶液（10mg/ ml）質(zhì)粒提取試劑:300ml 溶液 I: 50mM

16、 葡萄糖、 25mMTris-HCl ， pH8.0, 10mMEDTA 100ml 溶液 II : 0.2M NaOH, 1%SDS新奇配置）100ml 溶液 III : 5M 乙酸鉀 60ml、冰乙酸 11.5ml、水 28.5mlDEAE-se pharose 層析試劑：300ml Buffer A：0.1M Tris-HCl, pH8.0200ml Buffer B：0.1M Tris-HCl , pH8.0, 1M NaCl DEAE-Sepharose FF 每組 20ml 填料純水50ml 2M NaCl 溶液實(shí)驗(yàn)流程圖操作步驟放大培養(yǎng)1離心收菌洗滌沉淀1重懸沉淀堿裂解菌體1中和

17、、復(fù)性沉淀質(zhì)粒洗滌沉淀溶解沉淀3ml菌種接種于300ml LB卡那抗性培養(yǎng)基中,37 C, 250rpm，培養(yǎng)3hr;將振蕩培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4 C,6000rpm，離心10min，棄上清；以5ml溶液I重懸沉淀，然后于6000rpm離心10min，棄上清，再依次重復(fù)兩次；加入5ml溶液I重懸沉淀，室溫放置 10min ;加入10ml溶液II后，迅速顛倒離心管4 6次;加入7.5ml溶液III，輕柔但完全顛倒離心管 4 6次，冰浴 10min ;然后于 12000g，離心 10min，小心轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中；加入2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，顛倒混勻，室 溫放置5-10min , 1200

18、0g離心10min，棄上清;加入70%乙醇，12000g離心10min，棄上清, 室溫干燥5 10min ;以 10ml 0.1M Tris-HCI （ pH8.0 ,并含 20 卩 g/ml 的RNase A）溶解沉淀，37C,保溫2 hr后電 泳檢測；實(shí)驗(yàn)流程圖操作步驟DEAE- Sep haroseFF層析檢測濃度和純度以 0.1M Tris-HCI （pH8.0）平穩(wěn)，上樣 5ml,沖 平，以 0.1M Tris-HCI （ pH 8.0）, 1M NaCI 線性 洗脫。設(shè)置8-10個柱床體積，收集各吸取峰；瓊脂糖電泳檢測各洗脫峰，確定質(zhì)粒所在洗脫 峰；測定所得質(zhì)粒 260、280吸取

19、值，運(yùn)算濃度和 純度。（二）淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后淋巴細(xì)胞殺腫瘤活性的檢測 和TCR V P 7.1基因表達(dá)的檢測全班62人分為6組，十到十一人一組一）細(xì)胞培養(yǎng)（人 PBLC，腫瘤細(xì)胞BEL-7402）1、 利用淋巴細(xì)胞分離液從外周血中分離 PBLC，置于50ml培養(yǎng)瓶中， 用完全培養(yǎng)基（1640培養(yǎng)基含10%FBS, IL-2）培養(yǎng)（老師已關(guān)心完成）。2、腫瘤細(xì)胞BEL-7402按密度接種于50ml培養(yǎng)瓶中，用全培養(yǎng)基（1 640培養(yǎng)基含10%FBS）培養(yǎng)（老師已關(guān)心完成）。老師為每一組提供 PBL C和腫瘤細(xì)胞BEL-7402各一瓶，由每組中選擇2位同學(xué)負(fù)責(zé)培養(yǎng)，每組指 定一名老師負(fù)責(zé)培訓(xùn)

20、指導(dǎo)，要求負(fù)責(zé)同學(xué)學(xué)會無菌操作技術(shù)、細(xì)胞換液、細(xì)胞消化傳代及細(xì)胞凍存技術(shù)，所培養(yǎng)細(xì)胞以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用。實(shí)驗(yàn)室共 有無菌操作臺三臺，每兩組指定使用一臺（以后有關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)都用此 臺），負(fù)責(zé)操作臺的衛(wèi)生及愛護(hù)。電泳檢測細(xì)胞膜融合，從皆中，免受 固的復(fù)合物, 通過與細(xì)二）用含TCR V P 7.1基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人 PBLC實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.將PCDNA3.1-TCRV （3 7.1轉(zhuǎn)染至人淋巴細(xì)胞2.了解脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理，把握差不多技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理：轉(zhuǎn)染是用于將克隆獲得的外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞的一系列技術(shù)的 通用名稱。通常將轉(zhuǎn)染技術(shù)分為生化方法轉(zhuǎn)染（包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、DEAE （二乙

21、基氨基）葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染等）和物理方法轉(zhuǎn)染 （包括電穿孔及生物粒子作用）。脂質(zhì)體作為一種可供選擇的基因載體，具有無毒、無免疫原性、可生 物降解的特點(diǎn)。脂質(zhì)體是由磷脂雙層構(gòu)成的具有水相內(nèi)核的脂質(zhì)微囊。因 為脂質(zhì)護(hù)磷脂雙層結(jié)構(gòu)隸與細(xì)胞 而將外源*DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，而質(zhì)粒 核酸酶降解。當(dāng)陽離子脂質(zhì)體與則d diD DNA 這種復(fù)合i了當(dāng)力在培養(yǎng)細(xì)胞中，胞膜溶合,將外源基因腦質(zhì)誹護(hù)細(xì)吞遂后和細(xì)JBEitJBEit合實(shí)驗(yàn)材料：人P BLC兩瓶（1x106個/ml）,重組質(zhì)粒P CDNA3.1-TCRVP 7.1，1640培養(yǎng)基、胎牛血清、白介素 2溶液（IL-2 ）、青霉素、鏈霉素， 轉(zhuǎn)染試劑Lipfe

22、ctamin2000，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板1個滅菌10ml離心管5個，滅 菌玻璃滴管、滅菌槍頭（1000ul、200ul和10ul）,無菌轉(zhuǎn)染用塑料管1支，實(shí)驗(yàn)步驟：1.將培養(yǎng)的人淋巴細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 10mL離心管中，離心使細(xì)胞沉淀（1600rpm, 5min）。加入無血清1640培養(yǎng)液1ml，重懸細(xì)胞。調(diào)劑淋巴細(xì)胞濃度：酒精棉球擦凈細(xì)胞計(jì)數(shù)板（正反兩面）及蓋玻片。將蓋玻片置于計(jì)數(shù) 板上。用滴管吸取一滴養(yǎng)淋巴細(xì)胞懸液，滴加于細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)池（蓋玻片 下）細(xì)胞胞膜類因此（io-3oaonmio-3oaonm）o顯微鏡下計(jì)四大格細(xì)胞數(shù)，運(yùn)算細(xì)胞濃度（如圖 3- 1） 細(xì)胞數(shù)=四大格總數(shù)X 104個/mL

23、4運(yùn)算細(xì)胞總數(shù)（細(xì)胞濃度X懸液體積）。加入含10%小牛血清的1640 培養(yǎng)液，將細(xì)胞數(shù)調(diào)劑至1X 106個/mL,滴管吹打平均。3.接種淋巴細(xì)胞：將調(diào)好濃度的細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)板孔中，每孔 2ml。細(xì)胞總數(shù)為2X 10 6個。共接種3孔。4.吸取重組質(zhì)粒 PCDNA3.1-TCRV （3 7.1 60卩L于1.5mLEP管中，力口 入無血清1640培養(yǎng)液690卩L,輕輕混勻。5.吸取脂質(zhì)體30 a L于轉(zhuǎn)染管中，加入無血清1640培養(yǎng)液720卩L , 混勻，室溫孵育5min。6.將第4步制得的質(zhì)粒溶液加入脂質(zhì)體溶液中。輕輕混勻，室溫孵育 25m in。7 .將脂質(zhì)體質(zhì)粒混合溶液加至接種有淋巴細(xì)胞

24、的6孔板中，500 a L/孔。8.加入IL-2 , 2.5 a L/孔，以堅(jiān)持淋巴細(xì)胞生長。將培養(yǎng)板放入二氧化 碳孵箱，培養(yǎng)過夜9. 培養(yǎng)過夜后，次日上午向各孔板內(nèi)加入胎牛血清，270 a L/孔，使培 養(yǎng)液中含有10%的胎牛血清，堅(jiān)持細(xì)胞正常生長。連續(xù)培養(yǎng)10.培養(yǎng)至次日，換液，將培養(yǎng)的人淋巴細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至10mL離心管 中，離心使細(xì)胞沉淀（1600rpm, 5min）。加入含10 %血清1640培養(yǎng)液， 重懸細(xì)胞。連續(xù)培養(yǎng)至檢測其它指標(biāo)。三）流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)基因后 VB7.1的表達(dá)實(shí)驗(yàn)原理：活細(xì)胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗 體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，再用熒光標(biāo)

25、記的第二抗體結(jié)合，按照所測定 的熒光強(qiáng)度和陽性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布。2gDPBSFCS 50ml4% NaN 3固定液：（終濃度 5%）50ml （終濃度 0.2%）DPBS葡萄糖甲醛NaN 30.2g （終濃度 0.02%） 離心機(jī)、熒光顯微鏡等。試劑和器材:1、各種特異性單克隆抗體。2、熒光標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。3、10% FCS RPMI1640;DPBS （X 10,貯存液）:NaCl 80gKCl 2g蒸餾水加至1000mlNa2 HPO4 11.5g臨用時(shí)用蒸餾水1 : 10稀釋KH 2 PO4洗滌液:900ml1000ml20g （終濃度2%）

26、10ml4、玻璃管、塑料管、操作步驟：轉(zhuǎn)基因后的外周血單個核細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)為106107個）J用10% FCS RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為 5X 106IX 107/ml取40卩l(xiāng)細(xì)胞懸液加入鼠源性的 VB7.1抗體（550卩l(xiāng)） 的小玻璃管或塑料離心管，J 4C 30min用洗滌液洗滌 2次，每次加洗滌液 2ml 左右lOOOrpmX 5minJ加入熒光標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體 （550 a I）的小玻璃管或塑料離心管，J 4C 30min用洗滌液洗滌 2 次，每次加洗滌液 2mI 左右lOOOrpmX 5minJ加適量固定液 （如為 FCM 制備標(biāo)本，一樣加入 1mI 固定液，如制片

27、后在熒光顯微鏡下觀看， 視細(xì)胞濃度加入100500 a I固定液）JFCM 檢測或制片后熒光顯微鏡下觀看（標(biāo)本在試管中可儲存 57天）注意事項(xiàng)：1.整個操作在4C下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的N aN3,上述實(shí)驗(yàn)條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。2.洗滌要充分， 以幸免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合， 現(xiàn)假陰性。3.加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白 Fc 受體，降低 和防止非特異性染色。4.細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。四）MTT檢測轉(zhuǎn)染TCR V P 7.1基因的淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作 用_ DMSO溶解甲月贊 _比色實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簷z測

28、轉(zhuǎn)染TCR V P 7.1識不殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。把握MTT法的原理與操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理：MTT （四甲基偶氮唑鹽）可被活細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶還 原為藍(lán)色的甲月贊結(jié)晶，顏色的深淺與活細(xì)胞數(shù)成正比，DMSO溶解結(jié)晶后，通過在酶標(biāo)儀上測定吸光度值，能夠比較活細(xì)胞的數(shù)量。_琥珀酸脫氫酶MTT實(shí)驗(yàn)材料：效應(yīng)細(xì)胞淋巴細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染TCR V P 7.1組）;靶細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞（BEL-7402）實(shí)驗(yàn)試劑：MTT （5mg/mL）;胰蛋白酶（0.5%）; DMSO實(shí)驗(yàn)步驟：1.胰酶消化培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞。1） 滴管吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液。加入無血清1640培養(yǎng)液1mL漂洗。 吸出培養(yǎng)液。2）加入胰蛋白酶1mL,

29、輕輕晃動培養(yǎng)瓶。使胰酶完全作用細(xì)胞單層。 鏡下觀看細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙增大，（約1min），消化已完成，迅速用滴管吸出胰酶，停止消化。3） 加入無血清1640培養(yǎng)液2ml,將細(xì)胞從瓶壁上吹打下來（專門是注 意吹打培養(yǎng)瓶的角落），成為單個細(xì)胞懸液。2.腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)運(yùn)算細(xì)胞總數(shù)（細(xì)胞濃度X懸液體積）。加入含10%小牛血清的1640 培養(yǎng)液，將細(xì)胞數(shù)調(diào)劑至1X 105個/mL ,滴管吹打平均。3.調(diào)劑淋巴細(xì)胞濃度（未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染組）用滴管將培養(yǎng)淋巴細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 10mL離心管；1600 rpm離心5 m in，使淋巴細(xì)胞沉淀；加入含血清1640 2 mL重懸細(xì)胞沉淀，并吹打平均； 計(jì)數(shù)，算出

30、淋巴細(xì)胞總數(shù)；用含血清 1640將淋巴細(xì)胞濃度調(diào)劑至2X 106 個 /mL。4.取出96孔板，在蓋上標(biāo)記好實(shí)驗(yàn)分組，按以下指導(dǎo)加入細(xì)胞懸液： 共6組，每組5孔，以便最后結(jié)果分析時(shí)求均值，幸免誤差。A :空白培養(yǎng)液組（MTT比色時(shí)作為空白對比，除去系統(tǒng)誤差）。 5.6.7.9.加入含血清1640培養(yǎng)液200卩LB :腫瘤細(xì)胞組（作為靶細(xì)胞對比組）。加入腫瘤細(xì)胞100卩L,含血清1640培養(yǎng)液100卩LC:未經(jīng)轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組加入未經(jīng)轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞100卩L,腫瘤細(xì)胞100卩LD :未經(jīng)轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞對比組加入未經(jīng)轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞100卩L,含血清1640培養(yǎng)液100卩LE:轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)染

31、淋巴細(xì)胞100卩L,腫瘤細(xì)胞100卩LF:轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞對比組加入轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞100卩L,含血清1640培養(yǎng)液100卩L37C, 5% CO2培養(yǎng)18小時(shí)吸去上清100卩L/孔加入MTT工作液，15L/孔連續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，倒去上清，加入 DMSO 150卩L/孔，混勻平板振蕩器振蕩30 min使結(jié)晶完全溶解10.酶標(biāo)儀490 nm處測定各孔吸光度值。11.運(yùn)算殺傷活性：效應(yīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組0D值-效應(yīng)細(xì)胞對比組 0D值殺傷活性（%） = （ 1- ）x 100 %靶細(xì)胞對比組0D值五）流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞凋亡：實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，目前早期識不仍有困難。這些細(xì)胞膜表面的改變之一是

32、磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外,使 PS 暴露在細(xì)胞膜外表面。 PS 是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常要緊存在于 細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被 破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Ann exin V是一種Ca+依靠的磷脂結(jié)合蛋白， 最初發(fā)覺是一種具有專門強(qiáng)的抗凝血特性的血管蛋白，Ann exin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充 當(dāng)一敏銳的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的 PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡 所專門的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差不是在凋亡 的初始時(shí)期細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期時(shí)期細(xì)

33、胞膜的完整性就 破壞了。因此，能夠建立一種用 Ann exin V結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的 指示并結(jié)合一種染料排除試驗(yàn)以檢測細(xì)胞膜的完整性的檢測方法。實(shí)驗(yàn)材料：人PBLC 瓶（1x106個/ml）,腫瘤細(xì)胞BEL-7402 一瓶（1 x105個/ml），1640培養(yǎng)基、胎牛血清、白介素 2溶液（IL-2 ）、青霉素、鏈 霉素，胰酶一瓶，滅菌PBS瓶，滅菌10ml離心管5個，滅菌玻璃滴管、 滅菌槍頭（1000ul、200ul和10ul）,50ml滅菌玻璃培養(yǎng)瓶一個，1000u l、2 00ul 微量移液器各一支,乳膠手套,消毒用 70%酒精棉球一瓶,金屬鑷一 把,封口膜,酒精燈一個,廢液缸一個

34、,細(xì)胞計(jì)數(shù)板一個。孵育緩沖液： 10mmol/L HEPES/NaOH, PH 7.4, 140mmol/L NaCl, 5 mmol/L CaCl2標(biāo)記液：將 FITC- Annexin V 和 PI 加入到孵育緩沖液中,終濃度均為 1ug/ml實(shí)驗(yàn)步驟：1、人PBLC的收集1 ）擺放好無菌操作臺,照紫外滅菌 30min。2）帶手套,用酒精擦手,打開酒精燈取人 PBLC 一瓶,用滴管轉(zhuǎn)移至 10ml離心管中，改緊管蓋，用封口膜將蓋口封緊。3）將離心管用天平配平后，1000rpm x10mi n，離心。4） 將離心管拿進(jìn)無菌操作臺棄上清,加入 1ml 完全培養(yǎng)基（加入 900 ul1640培養(yǎng)

35、基，100ul小牛血清，20ul IL-2，1ul鏈霉素和1ul青霉素），用 玻璃滴管吹打混勻備用，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度至 1x106個/ml。用孵育緩沖液洗滌1次，5001000r/min離心5min。用 100ul 的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育1015min。5001000r/min 離心 5min 沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗 1 次。加入熒光（SA-FLOUS）溶液4C下孵育20min,避光并不時(shí)振動。 流式細(xì)胞儀分析：2、腫瘤細(xì)胞 BEL-7402 的收集1）取腫瘤細(xì)胞 BEL-7402 一瓶，棄去培養(yǎng)基，用移液器吸取滅菌 PBS 2ml 加入培養(yǎng)瓶中，輕輕洗滌細(xì)胞一次，棄上清。2）向

36、瓶中加入1ml胰酶，蓋緊瓶蓋，室溫消化13分鐘，蓋緊蓋子 在顯微鏡下觀看細(xì)胞狀態(tài)。3）待細(xì)胞變圓成單個細(xì)胞后，豎起培養(yǎng)瓶，在操作臺上打開瓶蓋，倒 去胰酶液體。4）向瓶中加入 2ml 完全培養(yǎng)基， 用玻璃滴管吹打混勻備用， 細(xì)胞計(jì)數(shù)， 調(diào)細(xì)胞濃度至5x104個/ml3、PBLC 與腫瘤細(xì)胞混合接種將收集所得的 1ml PBLC 與 2ml 腫瘤細(xì)胞混合加入一新的培養(yǎng)瓶中。在加入2ml完全培養(yǎng)基（1800ul 1640培養(yǎng)基，200ul小牛血清，2ul鏈 霉素和 2ul 青霉素），用玻璃滴管吹打平均。蓋緊瓶蓋，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37C培養(yǎng)24小時(shí)4、Annexin V/PI 雙染色1）取培養(yǎng) 24

37、 小時(shí)后的細(xì)胞， 棄去培養(yǎng)基， 用滅菌 PBS 洗滌細(xì)胞一次， 加入胰酶消化后， 加入 1ml PBS 吹打細(xì)胞至單個細(xì)胞懸液， 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)， 用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1x106個/ml ,5001000rpm離心5min,棄去培養(yǎng)液。2）3）4）5）5、1） 流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用488nm,用一波長為515nm的通帶濾器檢 測 FITC 熒光,另一波長大于 560nm 的濾器檢測 PI。2） 結(jié)果判定：凋亡細(xì)胞對所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI 有抗染性, 壞死細(xì)胞則不能。 細(xì)胞膜有損害的細(xì)胞的 DNA 可被 PI 著染產(chǎn)生紅色熒光, 而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則可不能有紅色熒光產(chǎn)生。因此,在

38、細(xì)胞凋亡的 早期 PI 可不能著染而沒有紅色熒光信號。正?；罴?xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為( FITC-/PI- )；右上象限 是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為( FITC+/PI+ )；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯 現(xiàn)( FITC+/PI- )。三)基因工程藥物藥劑與藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)一)實(shí)驗(yàn)動物的識不、捕捉固定和標(biāo)記方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康模壕毩?xí)如何捉拿小鼠、判定小鼠性不，以及用苦味酸溶液標(biāo)記小鼠 的方法。實(shí)驗(yàn)動物：每人 1 只昆明小鼠，雌雄兼用實(shí)驗(yàn)器材和試劑：器材：鼠籠 15 個，一次性塑膠手套，乳膠手套，棉簽試 劑： 75酒精， 3的苦味酸溶液，鼠糧實(shí)驗(yàn)步驟：學(xué)習(xí)如何判定小鼠

39、性不成年鼠性不專門易區(qū)分，雄鼠的陰囊明顯；雌鼠可見陰道開口和 五對乳頭。仔鼠或幼鼠則要緊從外生殖器與肛門的距離判定，近者為雌性， 遠(yuǎn)者為雄性。練習(xí)抓取小鼠 先用右手抓住鼠尾并提起，放在實(shí)驗(yàn)臺上，在其向前爬行時(shí)，順勢用 左手的拇指和食指抓住其兩耳和頭頸部皮膚，然后把鼠體置于左手心中， 把后肢拉直，用左手的無名指及小指按住尾巴和后肢，前肢可用中指固定 (有時(shí)也能夠不固定前肢) ，即可進(jìn)行注射或其他實(shí)驗(yàn)操作。關(guān)于操作熟練 者，可采納左手一手抓住法，右手可不必放下注射器等工具。操作時(shí)應(yīng)小 心被小鼠抓咬。練習(xí)用苦味酸標(biāo)記小鼠用 3 的苦味酸溶液涂染小鼠背毛標(biāo)號。 用棉簽蘸取苦味酸溶液， 在小 鼠的不同部

40、位上涂染苦味酸黃色斑點(diǎn)來表示不同號碼。一樣適應(yīng)是：左前腿上為 1，左腰部為 2，左后腿為 3，頭部為 4，背部為 5，尾基部為 6，右 前腿為 7，右腰部為 8，右后腿為 9。染色的一樣原則是“先左后右，先上 后下”。單一顏色可標(biāo) 1-10 號，兩種顏色配合使用，一種顏色代表個位數(shù)， 一種代表十位數(shù)，可編到 100 號。二）實(shí)驗(yàn)動物的給藥途徑和方法 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)和把握通過灌胃、皮下注射、皮內(nèi)注射、肌肉注射、腹腔注 射、尾靜脈注射等途徑對實(shí)驗(yàn)動物（小鼠）進(jìn)行給藥的方法。實(shí)驗(yàn)動物：每人 1 只昆明小鼠，雌雄兼用 實(shí)驗(yàn)器材和試劑：器材：鼠籠，脫脂棉， 75酒精，廣口瓶（裝酒精棉球用） ，灌胃針，

41、小鼠固定器（輔助尾靜脈注射用） ，1mL 注射器，一次性塑膠手套，乳膠手 套。試 劑：生理鹽水，鼠糧實(shí)驗(yàn)步驟：在動物實(shí)驗(yàn)中，為了觀看藥物對機(jī)體功能、代謝及形狀引起的變 化，常常需要將藥物注入動物體內(nèi)。給藥的途徑和方法是多種多樣的。應(yīng) 按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)動物種類和藥物劑型等情形確定。皮下注射皮下注射比較簡單，一樣都取動物背部及后腿皮下。注射時(shí)用左手拇 指及食指輕輕捏起皮膚，右手持注射器將針頭刺入，固定后即可進(jìn)行注射。 關(guān)于小白鼠，注射時(shí)用左手拇指和食指抓住鼠的兩耳及頭皮，腹部朝上， 左手無名指及小拇指夾住鼠尾，右手持注射器在鼠腹部兩側(cè)作皮下注射。 要注意勿將藥液注入皮內(nèi)。使用注射器和吸取藥物時(shí)要

42、注意： 注射前要排除針筒及針頭內(nèi)的氣泡，調(diào)整藥液至準(zhǔn)確的位置； 注射器一樣要平拿，否則需用無名指及中指輕扶針?biāo)ǎ苑阑浠?進(jìn)入空氣。腹腔注射 對大小白鼠，一樣一個人即可進(jìn)行注射，注射時(shí)用左手大拇指及食指 抓住動物兩耳及頭部皮膚，腹部朝上，將其固定于手掌內(nèi)，必要時(shí)可用左 手無名指及小指夾住鼠尾，右手持連有 4 號針頭的注射器，將針頭從下腹 部朝頭的方向刺入腹腔，抽注射器，如無回血或尿液，表明針頭未刺入肝、 膀胱等臟器，即可進(jìn)行注射。進(jìn)行腹腔注射應(yīng)注意： 針頭刺入部位不宜太接近上腹部或太深，以免刺破內(nèi)臟； 針頭與腹腔的角度不宜太小，否則容易刺入皮下； 所用針頭不要太粗，以防藥液注射后從注射針孔流

43、出。注射后用棉 球按一下注射部位，也能夠用不帶鉤的小鑷子輕捏注射針孔。為幸免注射 后藥液從針孔流出，也能夠在注射時(shí)先把針頭在皮下向前推一小段距離， 然后再刺入腹腔。肌肉注射 肌內(nèi)注射的部位，要選擇肌肉豐滿或無大血管通過的肌肉，一樣采納 臀部。給大白鼠、小白鼠等小動物做肌肉注射時(shí)，用左手抓住鼠兩耳及頭 部皮膚，右手取注射器，將針頭刺入大腿外側(cè)肌肉，將藥液注入。靜脈注射用大號研缽扣住或用固定器固定小鼠， 露出尾巴。 先用粗玻璃試管盛 4 550C的溫水，把鼠尾浸于水中12 min，或用酒精棉擦拭鼠尾，使其尾 靜脈充血，現(xiàn)在可清晰看到 3 根暗紅色的尾靜脈。選擇其中較為明顯的一 條，在尾下1/4處（

44、約距尾尖23cm，因?yàn)槲采叶似け§o脈淺，易于刺入； 但不可離尾尖太近，防止尾巴碎斷）用左手三指捏住尾巴，右手取連有 4 號針頭的注射器，在左手捏住鼠尾處，使針頭與尾巴成一適宜的角度（小 于 30 度）刺入尾靜脈。針頭在尾靜脈內(nèi)平行推進(jìn)少許，左手的三指捏住尾 巴，并連針頭和鼠尾一起捏住，以防鼠活動時(shí)針頭脫出。先將針?biāo)ㄍ七M(jìn)少 許藥液，注意藥液注入靜脈時(shí)是否暢通。若注射部位皮下發(fā)白，而且推進(jìn) 藥液覺得阻力較大，講明針頭未刺入靜脈內(nèi)，應(yīng)換部位重刺。但要盡量做 到一次注射成功，因?yàn)橹卮虝黾幼⑸涞睦щy；另外，第二次重刺，也可能失去了尾靜脈注射的最佳位置。若進(jìn)針和注入藥液都專門暢通，表示針 頭確已刺入靜脈

45、，即可按規(guī)定劑量及速度（一樣每秒鐘注入0.050.1 ml為宜）推入藥液。要注意不能有氣泡進(jìn)入，否則將導(dǎo)致動物死亡。注射完 畢拔出針頭，趕忙用左手拇指按住注射部位，右手放下注射器，取一棉球 裹住注射部位并輕輕揉壓，使血液和藥液不流出。尾靜脈注射的要點(diǎn)是：注射前尾靜脈盡量充血；要用較細(xì)的針頭（通 常用 4 號）；針頭刺入后，務(wù)必使其與血管走行方向平行；當(dāng)針頭進(jìn)入順利 無阻時(shí)，要把針頭和鼠尾一起固定好，切勿晃動，以免出血造成血腫或溶 液溢出；注射部位盡量選用尾下 1/4 1/3 處；操作者要動作輕快而熟練， 爭取一次成功。大白鼠、小白鼠尾部血管分布有一定特點(diǎn)。尾靜脈注射常用鼠尾左右 兩側(cè)的兩根尾靜

46、脈，它們位置比較固定，易于注入。背側(cè)一根尾靜脈也可 做靜脈注射，但因其位置容易移動，不如左右兩側(cè)的尾靜脈易于注射。腹 側(cè)一根血管是尾動脈，一樣不采納此處進(jìn)行注射。灌胃 這是一種用處較多的給藥方法。有些藥物采納其他注射方法成效不行， 而用此法反而成效好；有些藥物（如臨床上的口服藥用于動物實(shí)驗(yàn)）不能 采取靜脈注射、肌肉注射等方法而必須采納此法。關(guān)于大小白鼠，用左手拇指和食指抓住鼠兩耳和頭部皮膚，其余三 指抓住背部皮膚，將鼠抓持在手掌內(nèi)（這種抓法不要抓得太緊，以免頸部 皮膚向后拉，勒住食管，灌胃針不易插直或容易損害食管；也不能抓得不 緊，否則鼠在受壓迫時(shí)容易掙脫掉而咬傷操作者的手指，一旦鼠掙脫，再

47、次抓取時(shí)會增加困難，也不易施行灌胃） 。也可用左手食指及拇指抓緊鼠右 耳的方法來幸免上述缺點(diǎn)。關(guān)于小白鼠，不必抓背部皮膚，只要將其抓持 在手掌內(nèi)，使其腹部向上，頭部向上有一定的傾斜度，固定好動物（同樣 抓得不可太緊或不緊） ，右手取注射器進(jìn)行灌胃。 灌胃需用的特制的灌胃針。 灌胃時(shí)，針頭沿著鼠右側(cè)嘴角通過食管進(jìn)入胃內(nèi)，然后把藥液灌入胃內(nèi)。 灌時(shí)若專門通暢，表示針頭已進(jìn)入胃內(nèi)；若不通暢，動物有嘔吐動作或強(qiáng) 烈掙扎，表示針頭未插入胃內(nèi)，要趕忙拔出并按上述方法重操作。靜脈或腹腔注射后，動物專門35 50 mg/kg體重，有的荷瘤露出尾巴， 用手揉擦或用 45 5 0C的溫水加溫鼠尾，也可用二甲苯等化

48、學(xué)藥物涂擦鼠尾， 使鼠靜脈充血后， 用剪刀剪去尾尖，尾靜脈血即可流出。用手輕輕從尾根部向尾尖部擠幾下， 能夠取到數(shù)滴血。灌胃的要點(diǎn)是：動物要固定好；進(jìn)針方向正確，一定要沿著右口角進(jìn) 針，再順著食管方向插入胃內(nèi)，絕不能進(jìn)針不順而強(qiáng)行向里插，否則會捅 破食管，甚至注入肺內(nèi)而造成動物死亡。三）實(shí)驗(yàn)動物的麻醉、血液采集和處死方法 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模壕毩?xí)用巴比妥鈉麻醉小鼠，從小鼠的眶靜脈竇、尾靜脈、心臟等 部位采血，采血后趕忙分離血清。實(shí)驗(yàn)動物：每人 1 只昆明小鼠，雌雄兼用 實(shí)驗(yàn)器材和試劑：器材：鼠籠，脫脂棉， 75酒精，廣口瓶（裝酒精棉球用） ， 1mL 注射 器，一次性塑膠手套， 乳膠手套， 1.5 mL

49、 離心管；離心機(jī)， 冰箱，天平（稱 量小鼠體重用），各量程移液器。試 劑：生理鹽水，肝素，巴比妥鈉 實(shí)驗(yàn)步驟：巴比妥鈉注射麻醉實(shí)驗(yàn)動物此藥麻醉時(shí)刻不專門長，一次給藥的有效麻醉時(shí)刻可堅(jiān)持 35h, 可滿足一樣實(shí)驗(yàn)要求。藥品價(jià)格比較廉價(jià)，給藥后對動物循環(huán)和呼吸系統(tǒng) 無明顯抑制作用。有時(shí)配成 1% 3%生理鹽水溶液，必要時(shí)可加溫溶解， 配好的藥液在常溫下 1 2個月可不能失效。 快就會進(jìn)入麻醉期。鼠類，靜脈或腹腔注射 小鼠的腹腔注射劑量達(dá)60 mg/kg體重。實(shí)驗(yàn)動物的取血 尾靜脈采血 用大號研缽扣住或用固定器固定小鼠，0.30.5 ml血。三根尾如果要間隔多次采取鼠尾靜脈血液，每次采血時(shí)，可把鼠尾

50、剪去專門 短一段；取血后， 先用棉球壓迫止血， 并趕忙用 6液體火棉膠涂于尾巴傷 口處，使傷口外結(jié)一層火棉膠薄膜，以愛護(hù)傷口。也可采納交替切割尾靜 脈的方法取血，即：每次采血時(shí)，用銳利的刀片在尾巴上切一小口，并切 破一段尾靜脈，靜脈血即由傷口流出，每次可取得 靜脈可交替切割，并由尾尖部向尾根部方向切割。切割后用棉球壓迫止血， 大約過 3d 傷口可結(jié)痂痊愈。這種方法在大鼠尾上進(jìn)行較好，能夠在較長時(shí) 刻內(nèi)間隔連續(xù)取血，進(jìn)行血常規(guī)等檢查。 眼眶動脈和靜脈 用左手抓住鼠，拇指和食指捏緊鼠頭部皮膚，使鼠眼球突出。右 手取無鉤小鑷，在鼠右側(cè)眼球根部將眼球摘出，并把鼠倒置，頭向下，這 時(shí)眼眶內(nèi)專門快流血，將

51、血滴入加有抗凝劑的玻璃器皿內(nèi)，等至不流為止。 此法由于在取血過程中動物心臟在持續(xù)跳動，取血量比斷頭法多，一樣可 取得 4 5鼠體重的血液量，是較好的一種取血方法。 心臟采血 將鼠仰臥固定于鼠固定板上，剪去心區(qū)部位的被毛，用碘酒、乙醇消 毒皮膚。在左側(cè) 3 4肋間，用左手食指摸到心搏，右手取連有 45 號針 頭的注射器，選擇心搏最強(qiáng)處穿刺。當(dāng)針頭正確刺到心時(shí)，鼠血由于心搏 力量自然進(jìn)入注射器，趕忙可進(jìn)行取血。3血清的分離與制備用肝素潤濕1.5 mL離心管，采血。將裝有血液的離心管置于37C 溫箱約1小時(shí)，使其充分凝固，然后置 4C過夜。以15000 rpm離心30分 鐘，吸取上部清亮的血清。將血

52、清分裝于滅菌離心管，貯存于 20C或7 0C或加0.1%疊氮鈉或0.01%硫柳汞后，貯存于4C冰箱。4處死 采納斷髓法。右手抓住鼠尾用力向后拉，同時(shí)左手拇指與食指用 力向下按住鼠頭，將背髓與腦髓拉斷，鼠便趕忙死亡。四）荷瘤昆明小鼠模型建立實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?建立荷人肝癌 BEL-7402 的昆明小鼠模型實(shí)驗(yàn)動物：每人 1 只昆明小鼠實(shí)驗(yàn)器材和試劑：1mL注射器；BEL-7402細(xì)胞，生理鹽水 實(shí)驗(yàn)步驟：收集BEL-7402細(xì)胞調(diào)細(xì)胞密度至1 X 107/mL,取0.3mL注射于注射于 昆明小鼠左前肢腋窩結(jié)合部皮下。連續(xù) 1 周觀看小鼠的成瘤情形。五）轉(zhuǎn)TCR V p 7.1人淋巴細(xì)胞在荷瘤昆明小鼠體內(nèi)

53、的分布實(shí)驗(yàn)?zāi)康模壕毩?xí)核酸類生物技術(shù)藥物 TCR Vp 7.1 脂質(zhì)體劑型的給藥方法。 實(shí)驗(yàn)分組： 10 人/組實(shí)驗(yàn)動物：每人1只昆明小鼠，每組10只（生理鹽水對比組5只， 實(shí)驗(yàn)組 5 只）實(shí)驗(yàn)器材和試劑：1mL注射器；轉(zhuǎn)染TCR V p 7.1基因的健康人外周 血淋巴細(xì)胞（PBMC）,生理鹽水實(shí)驗(yàn)步驟：本實(shí)驗(yàn)設(shè)二組 :對比組（5只）, 實(shí)驗(yàn)組（5只）。對比組注射 0.3mL 生理鹽水； 實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)輸經(jīng) TCR Vp 7.1 基因修飾的 PBMC:調(diào)整PBMC濃度為3X 107/mL,取0.3 mL經(jīng)尾靜脈或癌旁注射轉(zhuǎn)輸 給昆明小鼠，飼養(yǎng)28d后處死小鼠，剝離腫瘤，稱取瘤重，測量瘤體大小， 測定

54、TCR Vp 7.1 基因藥物在小鼠各器官的分布等。六）TCR V p 7.1在荷瘤昆明小鼠體內(nèi)的分布（示教）（四）基因工程蛋白藥物的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^本實(shí)驗(yàn)了解和把握基因工程蛋白藥物發(fā)酵的一樣過程、各種 因素對菌體生長和產(chǎn)物形成的阻礙、搖瓶發(fā)酵工藝確立的方法。實(shí)驗(yàn)原理： 發(fā)酵是利用微生物在有氧或無氧條件下的生命活動來制備其菌體 或代謝產(chǎn)物的過程。其本質(zhì)是一種生化反應(yīng)，與溫度、pH、溶解氧、基質(zhì)濃度等因素緊密有關(guān)。關(guān)于應(yīng)用基因工程技術(shù)改造的重組菌，在發(fā)酵表達(dá) 時(shí)，還要考察誘導(dǎo)條件包括誘導(dǎo)起始菌濃、誘導(dǎo)物濃度、誘導(dǎo)時(shí)刻等對目 的基因表達(dá)的阻礙。綜合地考察這些因素，才能達(dá)到低耗高產(chǎn)高質(zhì)的目的。

55、本實(shí)驗(yàn)所用的重組蛋白表達(dá)菌為 DH5 a,載體為pBV220,目的蛋 白為一相對分子質(zhì)量為2.8X 104。重組載體含有編碼溫度敏銳性阻遏蛋白 的ci857基因，在30-32C時(shí)產(chǎn)生的阻遏蛋白能阻止強(qiáng)啟動子 PRPL的轉(zhuǎn)錄 起始，細(xì)菌能夠正常生長繁育， 42攝氏度時(shí)該阻遏蛋白發(fā)生構(gòu)像變化而失 活，基因開始轉(zhuǎn)錄而表達(dá)，因此能夠調(diào)控溫度來誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。此外，培養(yǎng)基的起始 pH 值、溶解氧、基質(zhì)濃度、誘導(dǎo)起始菌濃、 誘導(dǎo)時(shí)刻等都會目的蛋白的產(chǎn)量產(chǎn)生阻礙。實(shí)驗(yàn)將逐一地確定動身酵的最 佳單因素條件。實(shí)驗(yàn)步驟：1. 菌種活化 將保藏的菌種從冰箱取出，冰上解凍。用接種環(huán)挑取少量菌體， 在Amp /LB

56、平板上三線法進(jìn)行劃板，置于30C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24h，長出 單克隆。2.預(yù)培養(yǎng)取平板上的單菌落接種于 5mL Amp/LB培養(yǎng)基中，30C, 200r/mi n搖菌培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)物作為搖瓶培養(yǎng)的種子，保藏于 4C備用。3.誘導(dǎo)起始菌濃度及誘導(dǎo)時(shí)刻對產(chǎn)物量的阻礙取三個250mL的三角瓶，裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基。按2%的接種量 接入預(yù)培養(yǎng)好的菌懸液，三個搖瓶于 30C, 220r/min搖床培養(yǎng)分不至0D 為0.4、0.6、0.8時(shí)，升溫至42C。每個搖瓶在誘導(dǎo)表達(dá) 2h, 4h, 6h, 8h 時(shí)，各取5mL樣品留作OD值及SDS PAGE分析目的蛋白量。按照目的 蛋白量來確實(shí)最適的誘導(dǎo)起始時(shí)刻

57、和誘導(dǎo)時(shí)刻。4.培養(yǎng)溫度對菌體生長及產(chǎn)物量的阻礙取三個 250mL 的三角瓶， 裝入 50mL 發(fā)酵培養(yǎng)基。 按 2%的接種量 接入預(yù)培養(yǎng)好的菌懸液，三個搖瓶分不于 25C、30C、35C進(jìn)行培養(yǎng)。關(guān) 于各個搖瓶，每 1 小時(shí)取 1.5mL 樣品測其 OD 值直到發(fā)酵終止，記錄下來。 當(dāng)達(dá)到最適的誘導(dǎo)起始 OD時(shí)，升高溫度至42C進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)刻 為第三步中所確定的最佳誘導(dǎo)時(shí)刻。注意，在誘導(dǎo)后取樣，每次取3mL，用于測 OD 和表達(dá)量。按所得數(shù)據(jù)繪制出菌體生長曲線和產(chǎn)物表達(dá)曲線。 按照此實(shí)驗(yàn)來初步確定最適生長溫度。5.起始 pH 值對產(chǎn)物量的阻礙取三個 250mL 的三角瓶， 裝入 50

58、mL 發(fā)酵培養(yǎng)基。 按 2%的接種量 接入預(yù)培養(yǎng)好的菌懸液，三個搖瓶分不調(diào) pH 值為 6.8、 7.2、 7.6。按照第三 步及第四步所確定的最適誘導(dǎo)起始時(shí)刻、誘導(dǎo)時(shí)刻、最適生長溫度進(jìn)行發(fā) 酵表達(dá)。誘導(dǎo)前每 2 小時(shí)取 1.5mL 樣品，誘導(dǎo)后每 2 小時(shí)取 3mL 樣品留作 OD值及SDS PAGE分析。按照產(chǎn)物量來確定最適的 pH值。6.搖床轉(zhuǎn)速對菌體生長及產(chǎn)物量的阻礙取三個 250mL 的三角瓶， 裝入 50mL 發(fā)酵培養(yǎng)基。 按 2%的接種量 接入預(yù)培養(yǎng)好的菌懸液， 三個搖瓶分不于 150rpm、 200rpm、 250rpm 轉(zhuǎn)速下 進(jìn)行培養(yǎng)。其它條件以第三至五步中所取得的最適條件

59、進(jìn)行。每隔 2 小時(shí) 取樣，誘導(dǎo)前取1.5mL,誘導(dǎo)后取3mL,留作OD值及SDS PAGE分析。7.發(fā)酵過程還原糖含量的變化及補(bǔ)糖對發(fā)酵的阻礙取三個 250mL 的三角瓶， 裝入 50mL 發(fā)酵培養(yǎng)基。 按 2%的接種量 接入預(yù)培養(yǎng)好的菌懸液，三個搖瓶分不于步驟三至六中所取得的最適條件 進(jìn)行培養(yǎng)。誘導(dǎo)時(shí)，在三個搖瓶中分不補(bǔ)入 0%、 2%、 4%的葡萄糖，進(jìn)行 培養(yǎng)。每隔1小時(shí)取一次樣，誘導(dǎo)前取1.5mL,誘導(dǎo)后取3mL,留作OD 值、還原糖及SDS PAGE分析。8.菌種的保藏10 分，本組沒10 分，10 分，答對使用的產(chǎn)量較高的菌種，取 600 微升的液體培養(yǎng)物，加入相同體積的40%的

60、甘油，混勻，置于-70 C進(jìn)行保藏。附錄二：知識競賽規(guī)則和試題（一）競賽規(guī)則： 必答題：每組的每個同學(xué)都要各自回答一道必答題，答對者加 答錯者不得分，但同組的同學(xué)能夠代為回答，代為回答者加 5 分； 人能夠回答的，能夠由其他組的同學(xué)代為回答，答對者加 5 分。搶答題：在主持人講完“請舉手”后方可舉手回答，答對者加 答錯者不得分，再由除該組外其他組的同學(xué)連續(xù)搶答，答對者加OD600）轉(zhuǎn)速和離心力） 由于溶液 I 中含有離子螯合劑錯者不得分，再由除上述兩組外的其他組同學(xué)連續(xù)搶答，如此三次還沒有 答對者則該題作廢，由老師公布答案。（二）競賽試題：必答題 第一組： 基因工程中常用到的載體按照功能要緊分