放線菌T111發(fā)酵液理化性質及發(fā)酵產物對核盤菌抑菌機制初探畢業(yè)論文

1、 畢 業(yè) 論 文 題目：放線菌放線菌 t111 發(fā)酵液理化性質及發(fā)酵產物對核盤菌抑菌發(fā)酵液理化性質及發(fā)酵產物對核盤菌抑菌 機制初探機制初探 學 院 植 物 保 護 專業(yè)班級 06 植檢 1 班 屆 次 2010 學生姓名 學 號 指導教師 二 o 一 年 六 月 十 日 目目 錄錄 中文中文摘要摘要 .4 4 英文摘要英文摘要 .4 4 1 1 前言前言 .5 5 1.1 生防菌應用的種類.6 1.2 拮抗放線菌的主要作用機制.7 1.3 本研究的目的及意義.8 2 材料與方法.8 2.1 材料.8 2.2 拮抗放線菌發(fā)酵液抑菌活性測定方法.9 2.3 t111 發(fā)酵液的理化性質.9 2.4

2、放線菌 t111 發(fā)酵產物對核盤菌的抑菌機制研究.10 3 3 結果與分析結果與分析 .1111 3.1 t111 發(fā)酵液的理化性質.11 3.1.1 發(fā)酵液抗菌譜.11 3.1.2 貯存穩(wěn)定性.12 3.1.3 熱穩(wěn)定性.13 3.1.4 酸堿穩(wěn)定性.13 3.1.5 紫外光穩(wěn)定性.14 3.2 t111 發(fā)酵產物對核盤菌的抑菌機制結果.15 3.2.1 t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌絲生長的影響結果.15 3.2.2 t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌絲形態(tài)的影響結果.15 3.2.3 t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌核形成及單重的影響結果.16 3.2.4 t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌核萌發(fā)的影響結

3、果.17 3.2.5 t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌絲體細胞膜滲透勢的影響結果.18 4 4 討論討論 .1919 5 5 參考文獻參考文獻 .2020 6 6 致謝致謝 .2121 catalogue chinese abstract.4 english abstract .4 1 introduction.5 1.1 the category of antagonism fungus .6 1.2 the antagonistic mechanisms of streptomyces.7 1.3 purpose and significance of the study.8 2 materi

4、al and methods.8 2.1 material.8 2.2 antifungal abilities of fermentation conditions.9 2.3 physical and chemical properties of t111 strain.9 2.4 antagonistic mechanisms to sclerotinia sclerotiorum of t111 .10 3 results and analyse .11 3.1 physical and chemical properties of t111 strain.11 3.1.1 inhib

5、ition spectrum of fermentation extracts of t11.11 3.1.2 effects of storage time on the activity of fermentation extracts.12 3.1.3 effects of temperatures on the activity of fermentation extracts.13 3.1.4 effects of ph on the activity of fermentation extracts .13 3.1.5 effects of uv irradiation time

6、on the activity of fermentation extracts.14 3.2 the result of antagonistic mechanisms to sclerotinia sclerotiorum .15 3.2.1 inhibition toxicities on mycelium growth of s. sclerotiorum .15 3.2.2 effect of fermentation broth of t111 on sclerotium mycelium shape.15 3.2.3 effect of antifungal substance

7、of t111 on sclerotium formation time and single weight.16 3.2.4 effect of antifungal substance of t111 on sclerotium bourgeon .17 3.2.5 effect of antifungal substance of t111 on membrane osmotic potential18 4 discussion .19 5 reference.20 6 thanks.21 放線菌放線菌 t111t111 發(fā)酵液理化性質及發(fā)酵產物對核盤菌抑菌機制初發(fā)酵液理化性質及發(fā)酵產物

8、對核盤菌抑菌機制初 探探 摘要：為明確放線菌 t111 的理化性質，研究了其抗菌譜，及貯存時間、溫度、酸堿條件、紫 外光照射等對其發(fā)酵液穩(wěn)定性的影響。結果表明，t111 發(fā)酵液對黃瓜菌核、黃瓜蔓枯、棉花 紅腐病菌等有較高的抑制活性；貯存穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性良好，4貯存 60d 抑菌活性為對照的 88.3%，80處理 60min 抑菌活性為對照的 90.9%；對 ph 值較敏感，在 ph 57 時活性較高； 對紫外線穩(wěn)定，紫外光照射 12h，其活性基本不受影響。初步研究了 t111 發(fā)酵產物對核盤菌 的抑菌機制，采用菌絲生長速率法測定了其對黃瓜菌核病菌sclerotinia sclerotiorum

9、菌絲 生長的毒力，及其對菌絲形態(tài)、菌核形成、菌核萌發(fā)和菌體細胞膜透性的影響。結果表明， t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌絲生長的 ec50值為 12.5g/ml，低于對照藥劑乙霉威及嘧霉胺；經 發(fā)酵產物處理后，菌絲形態(tài)出現(xiàn)黃化、畸形等現(xiàn)象，但尚未發(fā)現(xiàn)細胞質外滲；菌核形成的時間 有所延長，數(shù)量有所減少，且重量略有降低；在發(fā)酵產物濃度為 250g/ml 時不能完全抑制菌 核萌發(fā)；對菌體細胞膜滲透勢的影響不大。 關鍵詞：黃色鏈霉菌；黃瓜菌核病菌；發(fā)酵液；理化特性；抑菌機制 characterizations of t111 fermentation extract and antagonistic me

10、chanism to sclerotinia sclerotiorum abstract: the physical and chemical properties of the fermentation extract were studied by using agar-well diffusion method. the results showed that the fermentation extracts had high inhibitory activities on sclerotinia sclerotiorum, ascochyta citrullina and fusa

11、rium moniliforme var. intermedium. and it was well-stored and thermalstable, 88.3% of the initial activities remained after stored 60d at 4, 90.9% of the initial activities remained after heating at 80 for 60min. the fermentation extract was sensitive to the changes of ph, only in the ph range of 5-

12、7 was stable; the antifungal activities were almost not destroyed when it was under uv irradiation for 12h. to ascertain the antagonistic mechanisms of the antifungal substance to s. sclerotiorum, the inhibition activities on mycelium growth against s. sclerotiorum were determined by mycelium growth

13、 rate method in lab. and its effect on this pathogens biology characteristics, such as mycelium shape, sclerotium formation, sclerotium germination and membrane osmotic potential were also studied. the results showed that its ec50 value was 12.5g/ml, which was lower than diethofencarb and pyrimethan

14、il. after treated with the antifungal substance, the mycelia became etiolation and malformation, but had not yet found in the cytoplasm extravasation. this antifungal substance could delay the formation of sclerotium, the sclerotium numbers decreased contrasted that of the water control, and the wei

15、ght reduced slightly. at the concentration of 250g/ml of this antifungal substance, it could not restrain the sclerotium germination completely. and it had no significant effect on the membrane osmotic potential. key words: streptomyces flavus; sclerotinia sclerotiorum（lib.）de bary; fermentation ext

16、ract; physical and chemical properties; antagonistic mechanisms. 1 1、前、前 言言 植物土傳病害，其病原菌一般為多寄主微生物，通常侵染植物根部，引起植 物根部乃至全株性病害。土傳病害的發(fā)生和流行通常屬于積年流行病害，年度間 波動不大。在防治方面，化學防治和抗病育種目前只對部分病害有效，對大多數(shù) 病害防效不甚理想1。黃瓜菌核病就是近幾年來嚴重為害溫室黃瓜產量的一種重 要土傳病害，該菌以菌核的狀態(tài)在自然條件下可以長期存活，防治非常困難。目 前生產上主要依靠化學防治，但由于抗藥性的發(fā)生，使得菌核病菌對多種殺菌劑 存在著較高的抗性。目

17、前正在尋找一種簡單、有效、安全的植物病害防治方法， 即生物防治。 生物防治是指通過除人以外的一種或多種生物來降低病原微生物數(shù)量或減弱 病原菌的致病能力，從而減少病原微生物所致病害的發(fā)生2。它是通過植物、病 原物、生防菌、植物表面及其周圍微生物群落和自然環(huán)境等因素的互作關系，來 達到促生防病的作用3。 拮抗微生物具有不易使病原菌產生抗性、對環(huán)境安全、生產工藝相對簡單以 及不少微生物同時具有促進作物生長等優(yōu)點而受到人們的關注和重視4。利用拮 抗微生物產生的抗菌物質進行生物防治已成為研究的熱點，已開發(fā)的有滅瘟素、 放線菌酮、井岡霉素、多抗霉素、農抗 120 等。近年來，隨著研究的深入和生防 要求的提

18、高，人們開始將更多的注意力轉移到一些新型抗菌物質上，如新型抗生 素、抗真菌蛋白等，因而需要不斷地發(fā)掘和利用新的拮抗微生物資源。 1.1 生防菌應用的種類 生防菌的種類繁多，生產上廣泛應用的有真菌、細菌、放線菌等。真菌主要 有木霉菌、毛殼菌、酵母菌、淡紫擬青霉菌、厚壁孢子輪枝菌及菌根真菌等；細 菌主要有芽孢桿菌、假單胞桿菌等促進植物生長菌（pgpr） 、放射性土壤農桿菌和 巴氏桿菌等；放線菌主要有鏈霉菌及其變種。 對生防真菌研究最廣泛的是木霉菌（t. richoderma） ，常見的木霉菌有哈茨 木霉、綠色木霉、鉤狀木霉、長枝木霉、康氏木霉和綠粘帚霉等。它廣泛存在于 土壤及植物表面，經?？蓮闹参?/p>

19、病殘體、種子、球莖表面分離到。如文成敬等5 將油菜菌核作為誘餌埋入土壤中 2 個月后從菌核表面和內部分離到 52 株木霉，分 別為黃綠木霉、鉤狀木霉、哈茨木霉、康化木霉、擬康化木霉。 目前國際上用于防治土傳病害的拮抗細菌常見的有以下屬：產堿菌屬6、無 定形孢囊菌屬、節(jié)桿菌屬、固氮菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、黃 桿菌屬、哈夫尼菌屬、小單孢菌屬、假單孢菌屬、巴斯德氏芽菌屬、根瘤菌屬、 沙雷氏菌屬和黃單胞菌屬7。已開發(fā)為生防農藥的生防細菌主要有芽孢桿菌屬、 鏈霉菌屬、假單胞菌屬和土壤桿菌屬等。目前國內外8應用芽孢桿菌防治植物病 害非常廣泛，據(jù)報道，芽孢桿菌對馬鈴薯環(huán)腐病菌9、梨灰霉病菌1

20、0、油菜菌核 病菌11、水稻白葉枯病菌12、稻瘟病菌13和小麥赤霉病菌14等具有潛在的生防 利用價值。張學君等15表明芽孢桿菌對棉花枯萎病菌、立枯病菌、黃萎病菌、炭 疽病菌、棉鈴疫霉病菌和棉葉斑病菌均有強烈的抑菌作用。魏春妹等16制得的生 防制劑青枯散，不僅對青枯病菌的拮抗率為 83.5%，而且能促進番茄、花生、黃瓜、 煙草、油菜等作物生長。目前用于生防細菌的種類有：枯草芽孢桿菌（b. subtilis） 、多粘芽孢桿菌（b. polvmvxa） 、蠟狀芽孢桿菌（b. cereus） 、巨大芽 孢桿菌（b. megaterium）和短小芽孢桿菌（b. pumilis）等17。 放線菌由于菌落呈

21、放射狀而得名。從 cohn（1872）發(fā)現(xiàn)放線菌至今，已經報 道了 69 個屬，1687 個種18。應用于生物防治的放線菌主要是鏈霉菌屬 （streptomyces） ，其次有諾卡菌屬（nocardia） 、游動放線菌（actinoplanes） 、 小單孢菌屬（micromonospora）等19。據(jù)統(tǒng)計，已發(fā)現(xiàn)的抗生素，61.7%是放線菌 產生的。而目前廣泛應用的許多重要農用抗生素是從 鏈霉菌屬中分離得到的放 線菌所產生的。 如井岡霉素用于防治水稻紋枯病，在蔬菜上應用防治苗期立枯病 和白絹?。淮豪酌顾赜糜诜乐吸S瓜的炭疽病、細菌性角斑病、枯萎病，番茄葉霉 ?。晦r抗 120 主要用于防治蔬菜、

22、果樹、花卉等作物的白粉病，對瓜果的炭疽病、 番茄疫病也有一定防效；多抗霉素防治瓜類、番茄白粉病、灰霉病，絲核菌引起 的葉菜和其他蔬菜的糜爛、猝倒病，以及黃瓜霜霉病和番茄晚疫??；農用鏈霉素 主要用于防治黃瓜角斑病等細菌性病害。 1.2 拮抗放線菌的主要作用機制 放線菌一般通過兩種途徑對靶標致病菌發(fā)揮生防作用：它能夠在寄主體外通 過抗生作用、競爭作用、捕食和重寄生作用降低病原菌的致病性、侵染效率以及 接種體密度，導致病原菌群體密度以及致病性下降，人們利用它的這一特性開發(fā) 一些活體菌制劑。放線菌也可以在寄主植物組織內，誘發(fā)其產生抗性或對寄主產 生抑菌物質（主要是抗生素） ，影響病原菌的繁殖、生長，最

23、后導致靶標致病菌死 亡，在這方面對其產生的抗生素研究較多。 1 1.2.1.2.1 抗生作用抗生作用 抗生的發(fā)生主要依賴于生防菌抗生素的產生，一般單株生防放線菌可以合成 多種抗生素?？股氐淖饔脵C理主要是：（1）抑制微生物細胞代謝的某些環(huán)節(jié)或 代謝中的某些酶系統(tǒng)，微生物重要代謝環(huán)節(jié)被抑制，生長發(fā)育出現(xiàn)障礙，甚至死 亡。 （2）廣譜抗生素的抗菌機制：某些抗生素能抑制微生物共同的代謝途徑，如 蛋白質和核酸的合成，則可抑制許多不同種類微生物的生長。 （3）除了干擾代謝 作用外，有時也可影響病原菌的形態(tài)結構。 1.2.21.2.2 競爭作用競爭作用 生防放線菌對土壤或植物根際中碳源的競爭利用，可以阻止

24、病原菌的生長， 從而阻止了病原菌對植物的侵染。競爭方式為（1）空間競爭：由于能夠產生抗生 素，放線菌能夠抑制許多植物病原菌，但它們的應用價值還在于它們在植物根圍 的定殖能力以及是否對有益菌有抑制作用等；（2）營養(yǎng)競爭：鐵離子（fe3+）利 用度是土壤環(huán)境對微生物生長的一個限制因子，鏈霉菌能夠分泌嗜鐵素 （siderophore） ，鰲合鐵離子，從而更多地利用鐵離子，限制了病原微生物對鐵 離子的需求，從而達到抑制病原菌的目的。 1.2.31.2.3 重寄生作用重寄生作用 由水解酶介導的重寄生是生防菌的作用機制之一。放線菌可以分泌多種胞外 水解酶，主要包括：幾丁質酶、葡聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、半

25、纖維素酶、酯 酶、脂肪酶和核酸酶等。植物病原高等真菌的細胞壁是以幾丁質為骨架，以 - 1，3-葡聚糖為主要填充物組成的。處于生長過程中的菌絲尖端幾丁質多呈裸露狀 態(tài)，易被水解酶攻擊而導致細胞破裂，生長受阻或者細胞死亡，阻止病害的發(fā)生 發(fā)展。 1.2.41.2.4 促進植物生長促進植物生長 benson 于 1993 年報道植物根際的鏈霉菌具有固氮作用，可與植物形成共生關 系，促進植物生長。近年來，我國也開展了弗蘭克氏菌共生固氮放線菌的研究， 該菌能夠誘導大范圍放線菌根瘤植物產生根瘤，并促進植物對 fe 等元素的吸收。 1.3 本研究的目的及意義 本實驗室以黃瓜菌核病菌為指示菌，篩選到一株對其有

26、強拮抗活性的放線菌 株t111。本文在此基礎上測定了其拮抗譜、貯存穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、 紫外光穩(wěn)定性等理化性質，然后進一步研究了其發(fā)酵產物對核盤菌的抑菌機制， 為進一步分析抗菌物質結構和開發(fā)利用提供依據(jù)。 2 2 材料與方法材料與方法 2.1 材料 2.1.1 供試菌株 拮抗放線菌：t111，分離于泰安市郊保護地黃瓜根際土壤中，本實驗室保存。 指示菌：黃瓜菌核病菌（sclerotinia sclerotiorum） 、黃瓜蔓枯病菌 （ascochyta citrullina） 、棉花紅腐病菌（fusarium moniliforme var. intermedium） 、黃瓜枯萎病菌

27、（fusarium oxysporium） 、棉花黑斑病菌 （xanthomonas campestris pv. malvacearum） 、番茄葉霉病菌（cladosporium flulvum） 、棉花炭疽病菌（colletotrichum gossypii southw） 、番茄灰霉病菌 （botrytis cinerea） 、黃瓜猝倒病菌（pythium spp.） 、蘋果腐爛病菌 （cytospora mandshurica） 、水稻紋枯病菌（rhizoctonia solani khn） ，均為 本實驗室分離鑒定保存。 2.1.22.1.2 供試培養(yǎng)基供試培養(yǎng)基 高氏一號液體培養(yǎng)

28、基：可溶性淀粉 20g，kno3 1g，nacl 0.5g，k2hpo43h2o 0.5g，mgso47h2o 0.5g，feso47h2o 0.01g，去離子水 1000ml；用于放線菌 t111 發(fā)酵液的培養(yǎng)。 pda 培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）20g，葡萄糖 20g，瓊脂 17g，去離子水 1000ml；用于指示菌黃瓜菌核病菌的培養(yǎng)及拮抗活性的測定。 2.1.32.1.3 主要儀器與試劑主要儀器與試劑 2.1.3.12.1.3.1 儀器儀器 cr22 高速冷凍離心機（日本日立公司） ；生化培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠） ； ga110 萬分之一電子天平（德國制造） ；ldzx-40bi 自動電

29、熱壓力蒸汽滅菌器（上 海申安醫(yī)療器械廠） ；紫外燈（長沙市鑫輝特種光源電器廠） ；光學顯微鏡 （olympus 公司） ；xl80 漩渦振蕩器（上海第一醫(yī)學院儀器廠） ；swcjld 超 凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司） ；wd700 微波爐（順德格蘭仕電 器廠） ；thz82 空氣浴搖床（江蘇太倉） ；ddsj-308a 型電導率儀（上海精密科學 儀器有限公司雷磁儀器廠） 。 2.1.3.22.1.3.2 化學及生化試劑化學及生化試劑 瓊脂粉（上海山浦化工有限公司） ；葡萄糖（分析純，上海伯奧生物試劑有限 公司） ；酵母浸膏（天津市英博生化試劑有限公司） ；氯化鈉（天津市凱通化學

30、試 劑有限公司） ；胰蛋白胨（北京奧博星生物技術有限責任公司） ；硫酸鏈霉素（山 東瑞陽制藥有限公司） ；95.5乙霉威原藥（江蘇蘇化集團新沂農藥廠） ；95腐 霉利原藥(日本住友化學工業(yè)株式會社)。 2.2 拮抗放線菌發(fā)酵液抑菌活性測定方法 2.2.12.2.1 平板對峙法平板對峙法 在 pda 平板上以原點為中心劃垂直的十字，沿一條線接生防菌，另一條線兩端 與中心等距離（20mm）處接供試病原菌菌餅。25培養(yǎng) 48h 后觀察抑菌帶大小判 斷抑菌活性大?。ǚ街羞_，2005） 。 2.2.22.2.2 生長速率法生長速率法 將培養(yǎng)好的發(fā)酵液于 4 10000r/min 離心 15min 除去菌

31、體，取 2ml 上清與 18ml pda 培養(yǎng)基（內含 50mg/l 硫酸鏈霉素）混勻后倒平板，平板冷卻后在中央接 種黃瓜菌核病菌菌餅，以不加上清的 pda 平板做對照，25培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h，測 量菌落直徑，計算抑菌率，根據(jù)抑菌率大小判斷抑菌活性強弱。 100(%) 對照菌落直徑 處理菌落直徑對照菌落直徑 抑菌率 2.2.32.2.3 瓊脂孔擴散對峙法瓊脂孔擴散對峙法 將黃瓜菌核病菌菌餅（8 mm）接種于 pda 平板中央，在菌餅周圍 2 cm 處 均勻打 3 個孔（8 mm） ，將待測物注入孔內，每孔約 60 l，25下培養(yǎng) 48 h，測量抑菌圈半徑，以抑菌圈半徑大小評價抑菌效果大小。

32、2.3 t111 發(fā)酵液的理化性質 2.3.12.3.1 抗菌譜抗菌譜 用平板打孔法分別測定發(fā)酵上清液對黃瓜菌核病菌（sclerotinia sclerotiorum） 、黃瓜蔓枯病菌（ascochyta citrullina） 、棉花紅腐病菌 （fusarium moniliforme var. intermedium） 、黃瓜枯萎病菌（fusarium oxysporium） 、棉花黑斑病菌（xanthomonas campestris pv. malvacearum） 、番 茄葉霉病菌（cladosporium flulvum） 、棉花炭疽病菌（colletotrichum gossyp

33、ii southw） 、番茄灰霉病菌（botrytis cinerea） 、黃瓜猝倒病菌 （pythium spp.） 、蘋果腐爛病菌（cytospora mandshurica） 、水稻紋枯病菌 （rhizoctonia solani khn）的抑菌作用，以不含抗菌發(fā)酵液的液體培養(yǎng)液作對 照。 2.3.22.3.2 抗菌效果的穩(wěn)定性抗菌效果的穩(wěn)定性 取發(fā)酵上清液 50ml，平均分為兩份，分別裝入無菌的密 封三角瓶中，分別在 4冰箱和室溫條件下保存，在保存 3、7、15、30、60d 時測 定抑菌活性。 2.3.32.3.3 熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性 將發(fā)酵液于 50、60、70、80、90 和 10

34、0下分別處理 60min，以 黃瓜菌核病菌作為指示菌，未經熱處理的發(fā)酵液作對照，平板打孔法測定活性。 2.3.42.3.4 phph 穩(wěn)定性穩(wěn)定性 將 t111 發(fā)酵液 100ml 分別用 1mol/l hcl 和 1mol/l naoh 處理至 ph 值 4、5、6、7、8、9、10，分別靜置 2h，然后將 ph 調回發(fā)酵液的自然 ph 值 （經 ph 計測定原發(fā)酵液 ph 為 6.5） ，未經酸堿處理的發(fā)酵液作對照，平板打孔法 測定活性。 2.3.52.3.5 紫外光穩(wěn)定性紫外光穩(wěn)定性 將發(fā)酵上清液置于無菌培養(yǎng)皿中，然后將盛滿發(fā)酵液的培養(yǎng) 皿放在據(jù) 20w 紫外燈 10cm 處紫外照射，在

35、照射 1、3、5、7、9、12h 后，平板打 孔法測活。以未經紫外光照射的粗提液為對照。每個處理重復 3 次。 2.4 放線菌 t111 發(fā)酵產物對核盤菌的抑菌機制研究 2.4.12.4.1 t111t111 發(fā)酵產物的制備發(fā)酵產物的制備 得到上清液后，用等體積的乙酸乙酯萃取 3 次，萃取液經無水硫酸鈉脫水后， 27、150rmin-1旋轉蒸發(fā)，得到黃色固體粗提物，后續(xù)試驗用去離子水定量溶 解。 2.4.22.4.2 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌絲生長的影響發(fā)酵產物對核盤菌菌絲生長的影響 采用菌絲生長速率法。在預備試驗的基礎上，無菌條件下選擇放線菌 t111 發(fā) 酵液對核盤菌菌絲生長抑

36、制率在 1090范圍內的 5 個系列濃度，制成含藥培 養(yǎng)基，將菌餅倒置接種于含藥平板中央（平板中加入硫酸鏈霉素抑制細菌的生長） , 每處理設 3 次重復，置于 25下培養(yǎng) 48h，十字交叉法測量菌落直徑，計算抑 制率。所得數(shù)據(jù)用 dps 統(tǒng)計軟件求出毒力回歸方程及 ec50值和 ec90。 2.4.32.4.3 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌絲形態(tài)的影響發(fā)酵產物對核盤菌菌絲形態(tài)的影響 在 2.6.1 試驗的基礎上，觀察經不同濃度發(fā)酵液處理后的菌絲形態(tài)，并挑取 經 ec90濃度發(fā)酵液處理的菌絲，制成玻片，在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。 2.4.42.4.4 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌核

37、形成及單重的影響發(fā)酵產物對核盤菌菌核形成及單重的影響 在 2.6.1 試驗的基礎上觀察各濃度的發(fā)酵液對菌核形成的影響。同時選擇放 線菌 t111 發(fā)酵液的 ec50和 ec90 濃度進行皿內抑制培養(yǎng)處理，至各培養(yǎng)皿菌絲不 再快速生長、產生黑褐色菌核為止，記錄菌核形成的時間、菌核數(shù)量，并稱量菌 核單重。 2.4.52.4.5 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌核萌發(fā)的影響發(fā)酵產物對核盤菌菌核萌發(fā)的影響 將黃瓜菌核病菌接種到 pda 培養(yǎng)基上，25培養(yǎng) 15d，待菌核開始變褐時收集 大小一致的菌核，置于鋪有滅菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，滴加少量滅菌水保濕培養(yǎng)， 至菌核完全變褐成熟，菌絲全部死亡。 在上

38、述試驗基礎上，根據(jù)發(fā)酵液 ec50濃度設計并配制系列濃度，將表面無菌 絲的成熟菌核置于含有系列濃度發(fā)酵液的 pda 平板上。25恒溫培養(yǎng)，統(tǒng)計菌核 萌發(fā)率，測出抑制萌發(fā)的最低濃度。試驗重復 3 次，每重復測定 10 個菌核。 2.4.62.4.6 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌絲體細胞膜滲透勢的影響發(fā)酵產物對核盤菌菌絲體細胞膜滲透勢的影響 將黃瓜菌核病菌置于 pda 平板上，25下培養(yǎng) 5d，在菌落邊緣制取直徑為 4mm 的菌餅分別接入 pd 培養(yǎng)液中，120r/min 振蕩培養(yǎng) 2d 后取菌絲備用。新鮮菌 絲用重蒸水沖洗，真空抽濾后稱取菌絲鮮重 0.2g 放入錐形瓶中，分別加入由 25

39、ml 重蒸水稀釋的系列濃度發(fā)酵液中。25下恒溫水浴中振蕩（120r/min） ，分別測定 在 0、5、15、30、60、120、150min 時的電導率。以不加入發(fā)酵液但含有相同濃 度硫酸銨的 tris-hcl 緩沖液為對照，對照藥劑腐霉利以不加入腐霉利原藥的其他 助劑為對照。 3 3 結果與分析結果與分析 3.1 t111 發(fā)酵液的理化性質 3.1.13.1.1 t111t111 發(fā)酵液的抗菌譜發(fā)酵液的抗菌譜 從表 1 中可以看出，在被測的 11 種供試病原真菌中，t111 對黃瓜菌核、黃瓜 蔓枯、棉花紅腐病菌抑制效果最好，菌絲抑制率均在 70%以上；對黃瓜枯萎、棉花 黑斑、棉花炭疽、番茄葉

40、霉、番茄灰霉病菌抑菌率在 50%以上；而對水稻紋枯病菌 抑制率低于 30%。數(shù)據(jù)表明，t111 菌株發(fā)酵液抗菌活性范圍較廣，且對部分植物 病原真菌有很好的抑菌效果。 表表 1 1 t111t111 發(fā)酵液抗菌譜測定結果發(fā)酵液抗菌譜測定結果 tabletable 1 1 inhibitioninhibition spectrumspectrum ofof fermentationfermentation extractsextracts ofof t111t111 病原菌 pathogenic fungus 抑制率 inhibitory rate 病原菌 pathogenic fungus 抑制

41、率 inhibitory rate 黃瓜菌核病菌 s. sclerotiorum + 棉花炭疽病菌 c. gossypii southw + 黃瓜蔓枯病菌 a .citrullina + 蘋果腐爛病菌 c. mandshurica + 黃瓜猝倒病菌 p. spp. + 番茄葉霉病菌 c. flulvum + 黃瓜枯萎病菌 f. oxysporium + 番茄灰霉病菌 b. cinerea + 棉花黑斑病菌 x. campestris pv. malvacearum + 水稻紋枯病菌 r. solani khn - 棉花紅腐病菌 f. moniliforme var. intermedium +

42、 注：+：抑制率 70100%；+：抑制率 5070%；+：抑制率 3050%；-：抑制率30%。 note: +: inhibitory rate 70-100%; +: inhibitory rate 50-70%; +: inhibitory rate 30-50%; -: inhibitory rate30%. 3.1.2 貯存穩(wěn)定性貯存穩(wěn)定性 0 10 20 30 40 50 60 70 80 037153060 貯存時間 storage time（d） 抑制率 inhibitory rate （%） 4 常溫 圖圖 1 1 不同貯存時間對不同貯存時間對 t111t111 發(fā)酵液活性

43、的影響發(fā)酵液活性的影響 fig.1fig.1 effectseffects ofof differentdifferent storagestorage timetime onon thethe activityactivity ofof fermentationfermentation extractsextracts ofof t111t111 由圖 1 可知，總體上，t111 發(fā)酵液貯存穩(wěn)定性良好，4條件下貯存 60d，活 性為剛剛發(fā)酵完的粗提液的 88.3%，常溫下貯存 60d 活性為剛剛發(fā)酵完的粗提液的 73.9%。4條件下貯存更有利于維持較高的抑菌活性。 3.1.33.1.3 熱穩(wěn)

44、定性熱穩(wěn)定性 0 10 20 30 40 50 60 70 80 5060708090100ck 溫度 temprature（） 抑制率 inhibitory rate（%） 圖圖 2 2 不同溫度處理對發(fā)酵液活性的影響不同溫度處理對發(fā)酵液活性的影響 fig.fig. 2 2 effectseffects ofof differentdifferent temperaturestemperatures onon thethe activityactivity ofof fermentationfermentation extractsextracts ofof t111t111 圖 2 顯示，

45、t111 發(fā)酵液具有較強的熱穩(wěn)定性。5080各處理 60min，抑菌活 性均維持在對照的 90%以上；80處理 60min 抑菌活性為對照的 90.9%，100處 理 60min，活性為對照的 80.3%。 3.1.43.1.4 酸堿穩(wěn)定性酸堿穩(wěn)定性 0 10 20 30 40 50 60 70 80 45678910 ph 抑制率 inhibitory rate （%） 圖圖 3 3 不同不同 phph 處理對處理對 t111t111 發(fā)酵液活性的影響發(fā)酵液活性的影響 fig.3fig.3 effectseffects ofof differentdifferent phph onon th

46、ethe activityactivity ofof fermentationfermentation extractsextracts ofof t111t111 由圖 3 可知，在堿性條件下，t111 活性很低，ph 大于 10 基本沒有活性，說 明 t111 對堿敏感；ph 57 活性較高，說明 t111 適于弱酸性和中性環(huán)境，最適 ph 為 6.0。所以在對 t111 菌株處理時，要注意控制 ph 值，盡量控制在弱酸性和中性， 以減少抗生素活性的損失。 3.1.53.1.5 紫外光穩(wěn)定性紫外光穩(wěn)定性 0 10 20 30 40 50 60 70 80 01357912 照射時間 irr

47、adiation time（h） 抑制率 inhibitory rate （%） 圖圖 4 4 不同紫外光照射時間對不同紫外光照射時間對 t111t111 發(fā)酵液活性的影響發(fā)酵液活性的影響 fig.4fig.4 effectseffects ofof differentdifferent uvuv irradiationirradiation timetime onon thethe activityactivity ofof fermentationfermentation extractsextracts ofof t111t111 在紫外光下連續(xù)照射 12h 后，t111 發(fā)酵液活性基本

48、保持不變，抑菌活性仍能 達到對照活性的 82.1%，表明 t111 具有良好的紫外穩(wěn)定性（圖 4） 。 3.2 放線菌 t111 發(fā)酵產物對核盤菌的抑菌機制結果 3.2.13.2.1 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌絲生長的影響發(fā)酵產物對核盤菌菌絲生長的影響結果結果 表 2 為放線菌 t111 發(fā)酵產物對黃瓜菌核病菌菌絲生長抑制作用的毒力測定結 果。結果顯示，放線菌 t111 發(fā)酵產物對黃瓜菌核病菌的 ec50值為 12.5g/ml，不 及對照藥劑乙霉威和嘧霉胺（ec50值分別為 4.15g/ml 和 0.72g/ml） 。 表表 2 2 放線菌放線菌 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌

49、絲生長的抑制作用發(fā)酵產物對核盤菌菌絲生長的抑制作用 tabletable 2 2 inhibitioninhibition toxicitiestoxicities onon myceliummycelium growthgrowth ofof s.s. sclerotiorumsclerotiorum byby antagonisticantagonistic activityactivity ofof fermentationfermentation brothbroth 處理 treatment 毒力回歸方程 toxicity regresssion equation ec50（g/ml

50、） (95%cl） ec90（g/ml ） (95%cl） 發(fā)酵液 fermentation broth y=3.227+1.821x12.51（7.3319.87）65.35（36.04152.6） 乙霉威 diethofencarb y=3.827+1.966x4.15（3.335.27）23.86（13.7352.43） 嘧霉胺 pyrimethanil y=5.240+1.691x0.72(0.5350.923)4.13(2.8407.507) 3.2.23.2.2 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌絲形態(tài)的影響發(fā)酵產物對核盤菌菌絲形態(tài)的影響結果結果 a. ck 10g/ml 45g

51、/ml b. ck 45g/ml 圖圖 5 5 t111t111 發(fā)酵產物處理對菌絲形態(tài)的影響（發(fā)酵產物處理對菌絲形態(tài)的影響（a.a.肉眼觀察肉眼觀察 b.b.顯微鏡觀察）顯微鏡觀察） fig.5fig.5 effecteffect ofof fermentationfermentation brothbroth ofof t111t111 onon sclerotiumsclerotium myceliummycelium shapeshape ofof s s. . sclerotiorumsclerotiorum（a.a. visualvisual observationobservat

52、ion b.b. microscopicmicroscopic observationobservation） 經放線菌 t111 發(fā)酵產物處理后，菌絲生長緩慢，并出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，發(fā)酵液濃 度越高，黃化越嚴重。4d 后菌絲生長出現(xiàn)停滯現(xiàn)象，而 7d 后又開始擴展，但擴展 無規(guī)律，菌絲生長密集（見圖 5a） 。菌絲的微觀形態(tài)也發(fā)生了明顯變化（圖 5b） ， 清水對照菌絲細長平直；而經發(fā)酵液處理后菌絲形態(tài)發(fā)生畸形，菌絲開始增粗， 分枝增多并有膨脹現(xiàn)象，菌絲節(jié)間明顯變短，在隔膜處縊縮，節(jié)中間膨大，呈念 珠狀。 3.2.33.2.3 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌核形成及單重的影響發(fā)酵產物對核盤菌

53、菌核形成及單重的影響結果結果 經放線菌 t111 發(fā)酵產物處理，25培養(yǎng) 7d 后，菌絲仍然繼續(xù)擴展，但擴展 無規(guī)律，出現(xiàn)畸形現(xiàn)象，無菌核出現(xiàn)。而清水對照開始在培養(yǎng)皿邊緣出現(xiàn)菌核。 培養(yǎng) 15d 以后，發(fā)酵產物處理的菌絲開始在生長緩慢的菌絲邊緣處出現(xiàn)菌核（圖 6） 。從菌核平均單重及數(shù)量來看，經發(fā)酵液處理后，菌核單重降低，數(shù)量有所減 少。對照藥劑乙霉威和嘧霉胺在 ec50濃度處理后，菌核數(shù)量和平均單重都明顯減 小，在 ec90濃度處理后，菌核數(shù)目進一步減少，但菌核單重有所增加（圖 7，8） 。 0 2 4 6 8 10 12 14 16 發(fā)酵液 fermentation broth 乙霉威 d

54、iethofencarb 嘧霉胺 pyrimethanil 清水對照 ck 處理 treatment 菌核形成時間（d） sclerotium formation time ec50 ec90 圖圖 6 6 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌核形成時間的影響發(fā)酵產物對核盤菌菌核形成時間的影響 fig.fig. 6 6 effecteffect ofof antifungalantifungal substancesubstance ofof t111t111 onon sclerotiumsclerotium formationformation timetime ofof s s. . s

55、clerotiorumsclerotiorum 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 發(fā)酵液 fermentation broth 乙霉威 diethofencarb 嘧霉胺 pyrimethanil 清水對照 ck 處理 treatment 菌核單重（mg） sclerotium weight ec50 ec90 圖圖 7 7 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌核單重的影響發(fā)酵產物對核盤菌菌核單重的影響 fig.fig. 7 7 effecteffect ofof antifungalantifungal substancesubstance ofof t111t11

56、1 onon singlesingle sclerotiumsclerotium weightweight ofof s.s. sclerotiorumsclerotiorum 0 2 4 6 8 10 12 14 發(fā)酵液 fermentation broth 乙霉威 diethofencarb 嘧霉胺 pyrimethanil 清水對照 ck 處理 treatment 菌核數(shù)（個） sclerotium number ec50 ec90 圖圖 8 8 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌核形成數(shù)量的影響發(fā)酵產物對核盤菌菌核形成數(shù)量的影響 fig.fig. 8 8 effecteffect o

57、fof antifungalantifungal substancesubstance ofof t111t111 onon sclerotiumsclerotium numbernumber ofof s.s. sclerotiorumsclerotiorum 3.2.43.2.4 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌核萌發(fā)的影響發(fā)酵產物對核盤菌菌核萌發(fā)的影響結果結果 經放線菌 t111 發(fā)酵產物 250g/ml 的濃度（ec50濃度的 20 倍）處理后，菌核 的萌發(fā)與清水對照相比雖然延遲了 3d，且萌發(fā)率有所降低，但并不能被完全抑制。 對照藥劑乙霉威和嘧霉胺在約相當于其 ec50濃度的 2

58、0 倍時（分別為 80g/ml 和 15g/ml）也不能完全抑制菌核的萌發(fā)。 3.2.53.2.5 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌絲體細胞膜滲透勢的影響發(fā)酵產物對核盤菌菌絲體細胞膜滲透勢的影響結果結果 黃瓜菌核病菌菌絲體在經放線菌 t111 發(fā)酵產物處理后，隨時間的延長及發(fā)酵 產物濃度的提高，其電導率并未顯著升高，在處理 150min 后，仍與未處理時（即 0 分鐘時）無顯著差異。而對照藥劑嘧霉胺可以使電導率在 5min 內迅速提高，且 隨時間的延長，電導率不斷增大（圖 9 a，b） 。這表明二者的在此方面的抑菌作用 機制有顯著不同。 0 10 20 30 40 50 60 70 80

59、05153060 120 150 時間 time/min 電導率 conductivity （us/cm） ck 發(fā)酵液6.25g/ml 發(fā)酵液12.5g/ml 發(fā)酵液25g/ml a 0 5 10 15 20 25 30 020406080100120140時間（分鐘） time（min） 電導率(s/cm) electrical conductivity(s/cm) 0.1g/ml0.5g/ml2.5g/mlck b 圖圖 9 9 t111t111 發(fā)酵產物對核盤菌菌絲細胞膜透性的影響發(fā)酵產物對核盤菌菌絲細胞膜透性的影響 注：注：a a 發(fā)酵產物處理發(fā)酵產物處理 b b 嘧霉胺處理嘧霉胺處

60、理 fig.fig. 9 9 effecteffect ofof antifungalantifungal substancesubstance ofof t111t111 onon membranemembrane osmoticosmotic potentialpotential ofof s s. . sclerotiorumsclerotiorum note:note: a,a, antifungalantifungal proteinprotein ofof bacillasbacillas pumiluspumilus strainstrain bsh-4bsh-4 b,b, py