高效液相色譜分析技術(shù)-原理(陳桂良)

1、高效液相色譜分析技術(shù) 上海市食品藥品檢驗(yàn)所 色譜技術(shù)叢書傅若農(nóng)主編 化學(xué)工業(yè)出版社. 北京.2000 高效液相色譜分析技術(shù) 1. 1. 簡介簡介 2. 2. 基本概念、定義和色譜理論基本概念、定義和色譜理論 3. 3. 色譜柱和色譜模式色譜柱和色譜模式 4. 4. 儀器儀器 5. 5. 方法開發(fā)方法開發(fā) 6. 6. 方法驗(yàn)證方法驗(yàn)證 7. 7. 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 每時(shí)每刻的挑戰(zhàn)：混合物的分離分析每時(shí)每刻的挑戰(zhàn)：混合物的分離分析 提取提取 蒸餾蒸餾 離心離心 過濾過濾 常用的分離方式常用的分離方式 色譜色譜 1906年，年，Tswett 發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象 碳酸鈣碳酸鈣 石油醚石油

2、醚 石油醚石油醚 色帶色帶 A 樣品樣品 固定相固定相 檢測器檢測器 B tA tB 洗脫液洗脫液 色譜法的分類色譜法的分類 色譜法色譜法 液相色譜法液相色譜法（LC） 氣相色譜法氣相色譜法（GC） 超臨界流體色譜法超臨界流體色譜法（SFC） 高效液相色譜法高效液相色譜法 （HPLC） 高效毛細(xì)管電泳法高效毛細(xì)管電泳法（HPCE） 平板色譜法平板色譜法 柱色譜法柱色譜法 液液 相相 色色 譜譜 法法 經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜法 紙色譜法紙色譜法 薄層色譜法薄層色譜法（TLC） 色譜學(xué)發(fā)展歷史色譜學(xué)發(fā)展歷史 1906年，年，Tweet發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象。 1941年，年，Mar

3、tin和和Synge發(fā)明了利用物質(zhì)發(fā)明了利用物質(zhì) 在兩種不相混溶的溶劑中因分配系數(shù)的不在兩種不相混溶的溶劑中因分配系數(shù)的不 同而達(dá)到分離的同而達(dá)到分離的“分配色譜法分配色譜法”，1952年年 獲獲Nobel獎。同時(shí)提出以氣體為流動相。獎。同時(shí)提出以氣體為流動相。 1938年，蘇聯(lián)人發(fā)明了薄層色譜法，薄層年，蘇聯(lián)人發(fā)明了薄層色譜法，薄層 色譜法首次用作酊劑中成分的分離。色譜法首次用作酊劑中成分的分離。 1944年，年，Consden、Gordon與與Martin發(fā)明發(fā)明 了紙色譜法，以紙代替吸附劑的了紙色譜法，以紙代替吸附劑的“紙色譜紙色譜 法法”。 1956年，年，Stahl系統(tǒng)研究了硅膠的規(guī)

4、格、性系統(tǒng)研究了硅膠的規(guī)格、性 能及薄層厚度對薄層色譜的影響后，薄層能及薄層厚度對薄層色譜的影響后，薄層 法在各個(gè)方面才逐漸得到發(fā)展。法在各個(gè)方面才逐漸得到發(fā)展。 1952年，年，James和和Martin，氣相色譜法，氣相色譜法 發(fā)明了以氣體為流動相的發(fā)明了以氣體為流動相的“氣相色譜法氣相色譜法”。 1957年，年，Golay，開口毛細(xì)管（，開口毛細(xì)管（open- tubular column）一次可分離幾百個(gè)樣品。）一次可分離幾百個(gè)樣品。 1959年，年，Perflodin，空間排阻色譜法，空間排阻色譜法 分離生物大分子。分離生物大分子。 1964年，年，Giddings（American

5、） 高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC） 條件：（條件：（1）高壓泵的出現(xiàn)）高壓泵的出現(xiàn) （2）高靈敏度的檢測器）高靈敏度的檢測器 70年代商品化，年代商品化，8090年代發(fā)展年代發(fā)展 21世紀(jì)，聯(lián)用技術(shù)世紀(jì)，聯(lián)用技術(shù) UPLC 等等 HPLC與GC 基本概念及理論基礎(chǔ)（如保留值、塔板理論、速率理論、 容量因子、分離度等是一致的 進(jìn)樣方式的不同；流動相的不同；由于液體的粘度較氣 體大兩個(gè)數(shù)量級，使被測組分在液體流動相中的擴(kuò)散系 數(shù)比在氣體流動相中約小45個(gè)數(shù)量級；由于流動相的化 學(xué)成分可進(jìn)行廣泛選擇，并可配置成二元或多元體系， 滿足梯度洗脫的需要，因而提高了高效液相色譜的分辨 率（柱效能

6、）；高效液相色譜采用510Lm細(xì)顆粒固定相， 使流體相在色譜柱上滲透性大大縮小，流動阻力增大， 必須借助高壓泵輸送流動相；高效液相色譜是在液相中 進(jìn)行，對被測組分的檢測，通常采用靈敏的分光光度檢 測器，例如，紫外光度檢測器、示差折光檢測器、熒光 光度檢測器等；高效液相色譜同樣具有高靈敏度、高效 能和高速度的特點(diǎn)。 2005年版中國藥典二部 有223個(gè)品種采用HPLC方法取代傳統(tǒng)的容量法 或紫外法或生物檢定法。例如鹽酸小檗堿片與 膠囊含量測定原采用滴定法，多種生物堿均可 參與滴定反應(yīng)，本版藥典修訂為HPLC法，可準(zhǔn) 確測定小檗堿的含量；醋酸潑尼松片含量測定 原采用紫外法，難以區(qū)分結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)，

7、修 訂為HPLC方法大大提高了方法的專屬性。氯霉 素、羅紅霉素、克拉霉素與慶大霉素等多種抗 生素原含量測定方法采用微生物檢定法，本版 藥典（二部）改用HPLC法，3種氨基糖苷類采 用蒸發(fā)光散射檢測器。 正文中近30種復(fù)方制劑，其中18種已采用HPLC 方法。HPLC方法不僅提高了方法的專屬性，并 且簡化了實(shí)驗(yàn)過程。例如復(fù)方磺胺甲噁唑制劑 由磺胺甲噁唑與甲氧芐啶組成，原采用計(jì)算分 光光度法，現(xiàn)修訂為HPLC法；雙唑泰栓由甲硝 唑、克霉唑與醋酸氯己定組成的復(fù)方制劑，原 含量測定方法為滴定法、UV法與滴定法和UV組 合三個(gè)方法分別測定，方法繁瑣且干擾因素多， 現(xiàn)修訂為HPLC方法，在一個(gè)色譜條件下能

8、有效 分離三個(gè)組分；異福酰胺片（膠囊），采用等 度HPLC方法能有效分離三種組分及降解產(chǎn)物醌 式利福平，保證方法的準(zhǔn)確性。 2005年版中國藥典一部中采用HPLC作為 含量測定方法的有479個(gè)品種，涉及518 項(xiàng)；二部中采用HPLC作為含量測定方法 的有848個(gè)品種。 藥物分析雜志 HPLC論文數(shù)：85% 基本概念、定義和色譜理論 當(dāng)流動相中所有組分維持不變時(shí)達(dá)到分 離，這個(gè)過程稱為等度洗脫（isocratic elution）。如果流動相中一種或多種溶劑 的組成隨時(shí)間連續(xù)變化時(shí)，稱為梯度洗 脫（gradient elution） 兩個(gè)相鄰洗脫峰的分離程度和質(zhì)量可以 用保留因子（k，或容量因子

9、）、選擇 因子（）和理論板數(shù)（N）來表達(dá) 容量因子 ：0.4k2030 k 25為佳，過大則耗時(shí)太長 0 0 t tt k R 溶質(zhì)在流動相中的量 溶質(zhì)在固定相中的量 k 選擇因子（）1.1為好 )1( )2( )1( )2( k k t t R R Rt = 3.0 min. faster moving less retained Rt = 5.2 min. slower moving more retained 0 1 2 3 4 5 6 7 Time (minutes) Absorbance Approximation of peak area by triangulation Area

10、 = base x height 2 base height Peak APeak B HPLC色譜圖 分離度 兩個(gè)相鄰流出峰間的分離程度用分離度R 來評價(jià)。其中W1和W2為峰寬，t1和t2為 保留時(shí)間，單位相同。 R值越大，分離越好。R值為1.00時(shí)，如 果每個(gè)峰都符合高斯分布，被測物純度 大約為97.7。事實(shí)上，峰純度要達(dá)到 99.8以上，分離度至少應(yīng)為1.5。 )/()(2 2112 wwttR 分離效率 分離效率用理論板數(shù)N來描述 tr為保留時(shí)間，wB為基線處峰寬，w1/2為 半峰高處峰寬。 柱效與色譜柱填充顆粒的大小成反比。 因此分離效率按以下順序排列： E為柱效，下標(biāo)為顆粒大小 2

11、 2/1 2 )/(54. 5)/(16wtwtN rBr 1053 EEE 線速度：溶劑在柱中移動的速度線速度：溶劑在柱中移動的速度 mm/sec L柱長 t0 死時(shí)間 H(m) 柱內(nèi)徑 流量 線速度 5 mm 1.0 mL/min 1 mm/sec 2 mm 0.2 mL/min 1 mm/sec 1 mm 50 L/min 1 mm/sec 由1 mm/sec 最佳線速度可計(jì)算出適合各種柱徑的 最佳流量。 0 t L u 氣相層析速率理論 Van Deemter方程式 式中 H理論塔板高度 u載氣線速度 A多徑項(xiàng)或渦流擴(kuò)散項(xiàng)，表示由于柱的填充不均勻而引起峰的展 寬 B/u縱向擴(kuò)散項(xiàng)或分子

12、擴(kuò)散項(xiàng)，表示由于樣品前后存在濃度梯度而 使運(yùn)動著的分子產(chǎn)生縱向擴(kuò)散 Cu傳質(zhì)阻力項(xiàng)，表示樣品在流動相和固定相中移動受到阻力，造 成峰的擴(kuò)張 Van Deemter方程式可說明填充均勻程度、載體粒度、載氣種類、載氣 流速、柱溫、固定相液膜厚度等因素對柱效、峰擴(kuò)張的影響。 CuuBAH/ 液相層析速率理論 Giddings方程式 式中 H理論塔板高度 u流動相線速度 A渦流擴(kuò)散項(xiàng) B/u縱向擴(kuò)散項(xiàng) Cmu、Csmu、Csu傳質(zhì)阻力項(xiàng)，分為三項(xiàng) Csu固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)，主要是液液分配層析中組分在固定液中的傳質(zhì) 阻力 Cmu流動的流動相中的傳質(zhì)阻力項(xiàng)，流動相流經(jīng)固定相時(shí)，靠近固定 相的流動相的流速較慢

13、，引起峰的增寬 Csmu滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力項(xiàng)，由于固定相是多孔的，某部分流 動相會滯留在固定相的局部位置，影響傳質(zhì)速度 uCuCuCuBAH ssmm / 其他 理論板數(shù)、相鄰峰的分離度、多次進(jìn)樣 的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差百分?jǐn)?shù)以及拖尾因子 （色譜峰形偏離對稱高斯峰的程度）作 為系統(tǒng)適用性參數(shù)。 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) N=5.54*(tR/W1/2)2 =5.54*(1.065*60*tR/A/H)2 R=2(t2-t1)/(W1+W2) (1.5) T=T/2d (Ch.P 0.951.05; USP 2.5) RSD15,000psi) ） 快速進(jìn)樣器 快速檢測器 系統(tǒng)體積的優(yōu)化等 小顆粒填料 羅紅霉素HPLC色譜圖 范德米特(van Deemeter)曲線 UPLCTM與HPLC：速度比較