藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)課件

1、2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)系統(tǒng)得到的化合物，除了在化學(xué)上要求易于合成以外，還應(yīng)該關(guān)注溶解性、代謝穩(wěn)定性和安全性性質(zhì)，即設(shè)計(jì)的藥物應(yīng)具有優(yōu)良的ADME（吸收、分布、代謝、排泄等）特性，這些性質(zhì)與藥物和“類藥性”分子的要求一致。n類藥性（drug-like property）代表了理想化藥物所具有的特點(diǎn)，是藥物所表現(xiàn)出來(lái)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征在體內(nèi)的綜合反映(包括藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)和毒性)。簡(jiǎn)單來(lái)講就是和已知的藥物分子所具有的相似性。和已知的藥物分子所具有的相似性。n一般認(rèn)為化合物所表現(xiàn)出的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)應(yīng)與體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)具有良好

2、的相關(guān)性，并能夠滿足該化合物口服途徑，獲得理想的吸收、分布、代謝和排泄要求。此外還應(yīng)該具有易合成性和市場(chǎng)可接受性等特點(diǎn)。 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n排除法n模版法n直接性質(zhì)預(yù)測(cè)法2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n所謂的排除法就是參考已知的經(jīng)驗(yàn)，排除那些可能導(dǎo)致毒性、生物利用度低下或者其它不適宜作為藥物的性質(zhì)。 利平斯基規(guī)則利平斯基規(guī)則 已知不合適官能團(tuán)排除法已知不合適官能團(tuán)排除法 其它法則其它法則 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n利平斯基（Lipinsk）規(guī)則，又稱Ro5規(guī)則，是一個(gè)被廣泛認(rèn)知和

3、接受的類藥性過(guò)濾方法，也有人稱其為類藥性5規(guī)則。該規(guī)則是考慮到要使設(shè)計(jì)的化合物具有較好的生物利用度，藥物分子必須能夠穿透細(xì)胞膜，因此以分子是否具有良好的膜滲透性來(lái)作為過(guò)濾的條件。nRo5 規(guī)則認(rèn)為，一個(gè)化合物如果違背了下述規(guī)則中的任意兩條，就很難被生物體所吸收： 分子量小于500； 氫鍵給體 （OH或NH）小于或等于5； 氫鍵受體小于10； logP小于5。 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n某些具有潛在誘變性和致癌性的官能團(tuán)，如在第二章談到的毒性基團(tuán)，或者在代謝過(guò)程中不穩(wěn)定易產(chǎn)生毒性的基團(tuán)一般被認(rèn)為不具有類藥性，而應(yīng)該嚴(yán)格控制。n另外，具有活性官能團(tuán)的化合物，可

4、以與蛋白質(zhì)作用，在體外產(chǎn)生假陽(yáng)性或毒性，不再具有類藥性而應(yīng)該盡可能的避免。這種篩選方法不需要特殊的計(jì)算法則，只需要根據(jù)普通的醫(yī)藥化學(xué)知識(shí)和個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)確定。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n又很多相應(yīng)的規(guī)則，如：n藥物的物理性質(zhì)的類藥分子通用規(guī)則 分子量在160480之間，平均為357； logP 在-0.45.6之間，平均2.52； 摩爾折射率40130之間，平均97； 原子數(shù)在2070之間，平均48； 分子中必須同時(shí)具有以下幾種官能團(tuán)中一部分：苯環(huán)、雜環(huán)、脂肪胺（最好是叔胺）、羧基、酰胺、醇羥基、羧酸酯、酮基等。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021

5、-10-10n基于基于PSA的類藥性規(guī)則的類藥性規(guī)則 該規(guī)則考慮了分子的柔性，要得到具有大于20%40%的生物利用度，化合物分子必須滿足： PSA小于或等于140 2（或者氫鍵供體和氫鍵受體數(shù)小于或等于12），該條件與極化基團(tuán)滲透細(xì)胞膜的去溶劑化能有關(guān)； 可旋轉(zhuǎn)的化學(xué)鍵小于或等于10， nPSA（極化表面積極化原子的范德華表面積之和） 是與膜滲透相關(guān)的另一個(gè)參數(shù)，研究表明，口服吸收的PSA上限為1401502，穿透血腦屏障的PSA不超過(guò)90 2， 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n藥效團(tuán)類藥性法則藥效團(tuán)類藥性法則： 一個(gè)類藥性分子起碼有兩個(gè)以上的藥效點(diǎn)，但也不能多

6、于7個(gè)； 基本藥效點(diǎn)包括胺、氨基化合物、醇、酮、砜、磺胺、羧酸、氨基甲酸、胍、脒、脲和酯等，并且藥效點(diǎn)的雜原子間應(yīng)被一個(gè)以上的碳原子所分隔，否則只算做一個(gè)藥效點(diǎn)，同環(huán)的多個(gè)氨基只能算一個(gè)藥效點(diǎn)，吡咯、吲哚、噻唑等不算藥效團(tuán)； 具有一個(gè)以上的羧基的化合物是非類藥性分子，無(wú)環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物一般為非類藥性分子。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n與排除法相反，模版法是利用已知藥物結(jié)構(gòu)的有用特征對(duì)設(shè)計(jì)的化合物進(jìn)行評(píng)價(jià)，有很多相應(yīng)的方法，如優(yōu)先結(jié)構(gòu)法、人工智能分類法等。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n所謂的優(yōu)先結(jié)構(gòu)指的是可以和相應(yīng)受體和酶緊密結(jié)合

7、的特征結(jié)構(gòu)類型，優(yōu)先結(jié)構(gòu)可來(lái)源于已知藥物，也可以來(lái)自于天然產(chǎn)物，一般是緊密的雜環(huán)、多環(huán)體系，在指定的三維空間中可以誘導(dǎo)出不同的替代模式 n優(yōu)先結(jié)構(gòu)的內(nèi)涵已經(jīng)擴(kuò)展到藥物分子中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)片段，目前已經(jīng)有了商業(yè)化的片段庫(kù)，可以在數(shù)據(jù)庫(kù)中提取優(yōu)先的子結(jié)構(gòu)。n32個(gè)基本分子構(gòu)架就包括了所有分子的50%,其中最常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)是六元環(huán) 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n模版法雖可提供明確的指導(dǎo)，但并不能使涵蓋的所有分子具有類藥性。n模仿認(rèn)知機(jī)制的人工神經(jīng)智能網(wǎng)絡(luò)被用于藥物識(shí)別模式，通過(guò)檢驗(yàn)藥物可能的內(nèi)在特性（如原子類型、LogP、分子量等）來(lái)區(qū)分藥物和非藥物（不具有類藥性）。

8、2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n由于類藥性的概念非常模糊，而一個(gè)化合物能否成為一個(gè)藥物，與化合物的許多性質(zhì)相關(guān)聯(lián)，這些性質(zhì)中只有一部分是依賴于結(jié)構(gòu)的，因此基于化學(xué)結(jié)構(gòu)的類藥性預(yù)測(cè)當(dāng)然也存在著這樣或那樣的問(wèn)題。n先導(dǎo)化合物優(yōu)化中遇到的問(wèn)題和類藥性問(wèn)題實(shí)際上是相同的，即減少毒性、提高溶解性，增加生物利用度、改善血腦屏障穿透能力和增加代謝穩(wěn)定性等。 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n藥物作用的所有階段都與溶解性密切相關(guān)，但溶解性又是一種很復(fù)雜的現(xiàn)象，很難被準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。n溶解性與化合物的親脂性、和溶液之間形成的氫鍵數(shù)、分子內(nèi)的氫鍵數(shù)、官能團(tuán)

9、的離子化程度以及晶體的特征（特別是結(jié)晶形態(tài)和能量）等因素有關(guān)。 n有一種利用標(biāo)準(zhǔn)回歸統(tǒng)計(jì)的方法可以用于溶解度和其他物理性質(zhì)的計(jì)算，這種方法基于對(duì)整體分子的物理描述，包括溶劑可及表面積、Lennard-Jones作用能、氫鍵給體和受體數(shù)目、氨基和硝基的數(shù)目等進(jìn)行計(jì)算。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n即口服劑量中能到達(dá)血液循環(huán)部分的比例，它也與各種因素有關(guān)，包括藥物的溶解性、化學(xué)穩(wěn)定性和代謝穩(wěn)定性、膜滲透性等n膜的滲透率與極性表面區(qū)域和親脂性等因素有關(guān)，現(xiàn)在已經(jīng)有一些有效的預(yù)測(cè)膜滲透性的統(tǒng)計(jì)模型可以利用。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10

10、n與膜滲透相似，血腦屏障穿透率與藥物的親脂性系數(shù)（logP）、氫鍵數(shù)目、離子化程度、分子大小以及柔性等有關(guān)n有人提出一個(gè)簡(jiǎn)單的QSAR方程來(lái)用于計(jì)算藥物在腦中和血液中的比率：log（c腦/c血）= -0.0148PSA + 0.152ClogP + 0.1392021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n至今為止，雖然有許多軟件可以進(jìn)行預(yù)測(cè)代謝穩(wěn)定性，但仍沒(méi)有特別可靠的方法進(jìn)行預(yù)測(cè)，MetabolExpert 和META等程序可以預(yù)測(cè)化合物的代謝途徑，但是又難以說(shuō)明產(chǎn)生這些代謝的可能性有多少。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n化合物產(chǎn)生毒性的原因

11、很多，包括藥物與DNA或者蛋白質(zhì)作用，或干擾了酶系統(tǒng)等。n相應(yīng)的毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)如RTECS（含10萬(wàn)個(gè)以上的化合物數(shù)據(jù)）和TOXSYS（24萬(wàn)個(gè)化合物數(shù)據(jù)）可以參考n基于專家系統(tǒng)的計(jì)算也可預(yù)測(cè)化合物毒性，這些系統(tǒng)包含了那些具有潛在產(chǎn)生毒性的結(jié)構(gòu)片段，如基于規(guī)則的DEREK和HazardExpert、ToxAlert等以及基于系統(tǒng)的QSAR-TOPKAT和CASETOX等。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n類藥性規(guī)則定義不確切，難以適用于所有體系。n應(yīng)考慮類藥性規(guī)則的使用環(huán)境，而不能不加區(qū)別的使用，如一個(gè)長(zhǎng)時(shí)間服用的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物和一個(gè)僅需要短期使用快速奇效的靜脈注

12、射藥物就需要使用不同的規(guī)則加以判斷。n各種分類方法均沒(méi)有反映出已知藥物的特性，并妨礙新的結(jié)構(gòu)類型藥物的發(fā)現(xiàn)；n分類方法使用了已知的藥物相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，因而所得到的結(jié)果可信度依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)的完整性。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10n合理藥物設(shè)計(jì)-藥物設(shè)計(jì)的發(fā)展方向n計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的發(fā)展趨勢(shì)2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué) The Principle of Drug Design第六章基因技術(shù)及基因藥物的發(fā)展基因技術(shù)方法與基因有關(guān)的藥物設(shè)計(jì)2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n基因技術(shù)是一系列有關(guān)研究基因結(jié)構(gòu)和功能的方法之一，是一項(xiàng)將生物的某個(gè)基因通過(guò)

13、基因載體運(yùn)送到另一種生物的活性細(xì)胞中，并使之無(wú)性繁殖（稱之為“克隆”）和行使正常功能（稱之為“表達(dá)”），從而創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學(xué)技術(shù)，描述這些方法的術(shù)語(yǔ)包括“DNA重組技術(shù)”、“基因工程”、“基因拼接”等。一、什么是基因技術(shù)6-1 基因技術(shù)及基因藥物的發(fā)展2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)1利用基因工程技術(shù)可以獲得天然來(lái)源難以得到的生理活性物質(zhì)，并可提供足量的生物活性物質(zhì)以進(jìn)行結(jié)構(gòu)、功能、性質(zhì)等方面的研究，使之成為新藥，并避免由于免疫抗原性等原因而帶來(lái)的副作用。2.利用基因工程技術(shù)可以向生物環(huán)境中引入能編碼目的蛋白質(zhì)的基因，這種蛋白質(zhì)可再此環(huán)境中被大量的生產(chǎn)。例如使某些活性蛋

14、白、多肽基因在微生物、細(xì)胞以及動(dòng)物、植物反應(yīng)器中得到高效表達(dá)，使許多難以得到的生物活性物質(zhì)如胰島素、干擾素等批量生產(chǎn)?；蚣夹g(shù)的優(yōu)點(diǎn)2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)3利用基因工程技術(shù)可不斷發(fā)掘和開(kāi)發(fā)更多的新型生理活性物質(zhì)。例如紅細(xì)胞生長(zhǎng)素（EPO）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）等。4. 利用基因工程技術(shù)可以改造內(nèi)源性活性物質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)的特異位置進(jìn)行修飾，可以改變氨基酸的序列，在編碼基因中引入特異的突變體，從而改變其物理化學(xué)性質(zhì)，提高其生物活性、減少副作用如將組織纖溶酶原激活劑tPA分子重組縮小后，半衰期明顯延長(zhǎng)，注射一次即可溶栓。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)5通過(guò)基因重組技術(shù)

15、，能夠獲得新的化合物（包括自然界不存在的化合物），擴(kuò)大藥物來(lái)源，這正是制藥工業(yè)引進(jìn)基因工程的主要原因之一。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n1973年,美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院Prof.Coben及其研究小組把大腸桿菌質(zhì)粒DNA酶切后插入抗四環(huán)素基因,組成一個(gè)可在大腸桿菌種復(fù)制,并表達(dá)出具有抗四環(huán)素及大腸桿菌質(zhì)粒DNA雙抗遺傳表型的重組子第一次的基因重組2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n日新月異的生物技術(shù)不斷推動(dòng)著這場(chǎng)革命，生物工程藥物將成為21世紀(jì)藥業(yè)的支柱。n與生物制藥直接相關(guān)的最新領(lǐng)域包括；組合化學(xué)（combinatorial chemistry）、藥學(xué)基因（pharma

16、cogenomics）、蛋白組學(xué)（proteomics）、蛋白治療（gene therapy）、功能抗原學(xué)（functional antigenics）、生物信息學(xué)（bioinformatics）、高通量篩選（high-throughput screenign）和眾所周知的基因組學(xué)（genomics，包括后基因組學(xué)）等。 基因藥物是多學(xué)科共同發(fā)展的結(jié)晶2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)一一 基本知識(shí)基本知識(shí)二二 基因技術(shù)的一般介紹基因技術(shù)的一般介紹3 3重組蛋白的表達(dá)重組蛋白的表達(dá)6-2 基因技術(shù)方法2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)一、一、基基本本知知識(shí)識(shí)2021-10-10

17、藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n染色體上具有遺傳作用的是脫氧核糖核酸即DNA。DNA鏈由兩條堿基互補(bǔ)的脫氧核苷酸鏈反向平行旋轉(zhuǎn)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。每個(gè)脫氧核苷酸由一個(gè)堿基、一個(gè)脫氧核糖及一個(gè)磷酸分子組成。堿基的不同決定了脫氧核苷酸種類的不同。nDNA中的堿基種類有四種：腺嘌呤（A）、鳥(niǎo)嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）。 n基因是基因是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。 n基因是帶有遺傳性狀的DNA片段，每個(gè)基因具有自身的遺傳密碼?；驔Q定著蛋白質(zhì)的合成，有 “一個(gè)基因一個(gè)多肽鏈”的說(shuō)法。n基因決

18、定蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)決定代謝作用，代謝作用決定各種性基因決定蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)決定代謝作用，代謝作用決定各種性狀。狀。 、基因的化學(xué)本質(zhì)、基因的化學(xué)本質(zhì)2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)1 1、 核酸的分類和組成核酸的分類和組成n核酸分為兩大類核酸分為兩大類. .n脫氧核糖核酸（脫氧核糖核酸（DNADNA）Deoxyribonucleic AcidDeoxyribonucleic Acidn核糖核酸（核糖核酸（RNARNA）Ribonucleic AcidRibonucleic Acid。核酸的分類核酸的分類核酸核酸2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)nDNADNA分子含有生物物分子含有

19、生物物種的所有遺傳信息，種的所有遺傳信息，分子量一般都很大。分子量一般都很大。nDNADNA為雙鏈分子，其為雙鏈分子，其中大多數(shù)是鏈狀結(jié)中大多數(shù)是鏈狀結(jié)構(gòu)大分子，也有少構(gòu)大分子，也有少部分呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)。部分呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)。脫氧核糖核酸（脫氧核糖核酸（DNADNA）核酸核酸2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)核糖核酸（核糖核酸（RNARNA）nRNARNA的功能與特征的功能與特征nRNARNA主要是負(fù)責(zé)主要是負(fù)責(zé)DNADNA遺傳信息的遺傳信息的翻譯和表達(dá)翻譯和表達(dá)，分子量要比分子量要比DNADNA小得多。小得多。RNARNA為單鏈分子。為單鏈分子。nRNARNA的類別的類別n根據(jù)根據(jù)RNARNA

20、的功能，可以分為的功能，可以分為mRNAmRNA、tRNAtRNA和和rRNArRNA三種。三種。核酸核酸2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2 2、核酸的結(jié)構(gòu)、核酸的結(jié)構(gòu) 核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)n多聚核苷酸是由四種不同的核苷酸單元按特定的順多聚核苷酸是由四種不同的核苷酸單元按特定的順序組合而成的線性結(jié)構(gòu)聚合物，因此，它具有一定序組合而成的線性結(jié)構(gòu)聚合物，因此，它具有一定的核苷酸順序，即堿基順序。的核苷酸順序，即堿基順序。n核酸的堿基順序是核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。核酸的堿基順序是核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。nDNADNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式。的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式

21、。生物界物種的多樣性即寓于生物界物種的多樣性即寓于DNADNA分子中四種核苷酸千分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。變?nèi)f化的不同排列組合之中。n而而mRNA(mRNA(信息信息RNA)RNA)的堿基順序，則直接為蛋白質(zhì)的氨的堿基順序，則直接為蛋白質(zhì)的氨基酸編碼，并決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序?；峋幋a，并決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué) RNA RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)nRNARNA一級(jí)結(jié)構(gòu)研究最多的是一級(jí)結(jié)構(gòu)研究最多的是tRNAtRNA、rRNArRNA以及一些小分子的以及一些小分子的RNARNA。其中其中ntRNAtRNA分子具有以下特點(diǎn)：分子

22、具有以下特點(diǎn)：n分子量分子量2500025000左右，大約由左右，大約由70709090個(gè)核苷酸組成，沉降系數(shù)個(gè)核苷酸組成，沉降系數(shù)為為4 4S S左右。左右。n分子中含有較多的修飾成分。分子中含有較多的修飾成分。n3-3-末端都具有末端都具有CpCpAOHCpCpAOH的結(jié)構(gòu)。的結(jié)構(gòu)。核酸核酸2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)m mRNARNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)n真核細(xì)胞真核細(xì)胞mRNAmRNA的的3-3-末端有一段長(zhǎng)達(dá)末端有一段長(zhǎng)達(dá)200200個(gè)核苷個(gè)核苷酸左右的聚腺苷酸酸左右的聚腺苷酸( (polyA)polyA)，稱為稱為 “ “尾結(jié)構(gòu)尾結(jié)構(gòu)” ” ，5 -5 -末端

23、有一個(gè)甲基化的鳥(niǎo)苷酸，稱為末端有一個(gè)甲基化的鳥(niǎo)苷酸，稱為” ” 帽結(jié)帽結(jié)構(gòu)構(gòu)“ “ 。核酸核酸2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué) 核酸的高級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)核酸的高級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn) RNA RNAnRNARNA是單鏈分子，因此，在是單鏈分子，因此，在RNARNA分子中，分子中，并不遵守堿基種類的數(shù)量比例關(guān)系，即并不遵守堿基種類的數(shù)量比例關(guān)系，即分子中的嘌呤堿基總數(shù)不一定等于嘧啶分子中的嘌呤堿基總數(shù)不一定等于嘧啶堿基的總數(shù)。堿基的總數(shù)。nRNARNA分子中，部分區(qū)域也能形成雙螺旋結(jié)分子中，部分區(qū)域也能形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，不能形成雙螺旋的部分，則形成突構(gòu)，不能形成雙螺旋的部分，則形成突環(huán)。這種結(jié)構(gòu)可以形象地

24、稱為環(huán)。這種結(jié)構(gòu)可以形象地稱為“發(fā)夾型發(fā)夾型”結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。核酸核酸2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)tRNAtRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)的高級(jí)結(jié)構(gòu)1 1，tRNAtRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)ntRNAtRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)都呈的二級(jí)結(jié)構(gòu)都呈” ” 三葉草三葉草” ” 形狀，在結(jié)構(gòu)形狀，在結(jié)構(gòu)上具有某些共同之處，一上具有某些共同之處，一般可將其分為五臂四環(huán)：般可將其分為五臂四環(huán)：包括氨基酸接受區(qū)、反密包括氨基酸接受區(qū)、反密碼區(qū)、二氫尿嘧啶區(qū)、碼區(qū)、二氫尿嘧啶區(qū)、T T C C區(qū)和可變區(qū)區(qū)和可變區(qū)。除了氨。除了氨基酸接受區(qū)外，其余每個(gè)基酸接受區(qū)外，其余每個(gè)區(qū)均含有一個(gè)突環(huán)和一個(gè)區(qū)均含有一個(gè)突環(huán)和一個(gè)臂。

25、臂。 核酸核酸2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)( (1)1)氨基酸接受區(qū)氨基酸接受區(qū)包含有包含有tRNAtRNA的的3-3-末末端和端和5-5-末端，末端， 3- 3-末端的最后末端的最后3 3個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸殘基都是殘基都是CCACCA，A A為核為核苷。氨基酸可與其成苷。氨基酸可與其成酯，該區(qū)在蛋白質(zhì)合酯，該區(qū)在蛋白質(zhì)合成中起攜帶氨基酸的成中起攜帶氨基酸的作用。作用。(2)(2)反密碼區(qū)反密碼區(qū)與氨基酸接受區(qū)相對(duì)與氨基酸接受區(qū)相對(duì)的一般含有的一般含有7 7個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸殘基的區(qū)域，其中正殘基的區(qū)域，其中正中的中的3 3個(gè)核苷酸殘基稱個(gè)核苷酸殘基稱為反密碼為反密碼核酸結(jié)構(gòu)核酸結(jié)構(gòu)

26、2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué) 二氫尿嘧啶區(qū)二氫尿嘧啶區(qū)該區(qū)含有二氫尿嘧啶。該區(qū)含有二氫尿嘧啶。 T T C C區(qū)區(qū) 該區(qū)與二氫尿嘧該區(qū)與二氫尿嘧啶區(qū)相對(duì)，啶區(qū)相對(duì)， 假尿嘧啶核假尿嘧啶核苷苷胸腺嘧啶核糖核苷環(huán)胸腺嘧啶核糖核苷環(huán)( (T T C)C)由由7 7個(gè)核苷酸組成，個(gè)核苷酸組成，通過(guò)由通過(guò)由5 5對(duì)堿基組成的雙對(duì)堿基組成的雙螺旋區(qū)螺旋區(qū)( (T T C C臂臂) )與與tRNAtRNA的的其余部分相連。除個(gè)別例其余部分相連。除個(gè)別例外，幾乎所有外，幾乎所有tBNAtBNA在此環(huán)在此環(huán)中都含有中都含有T T C C 。 可變區(qū)可變區(qū)位于反密碼區(qū)與位于反密碼區(qū)與T T C C區(qū)

27、之間，區(qū)之間，不同的不同的tRNAtRNA該區(qū)變化較大該區(qū)變化較大。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)DNADNADNADNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)n19531953年，年，J. WatsonJ. Watson和和F. Crick F. Crick 在前人研究在前人研究工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)DNADNA結(jié)晶的結(jié)晶的X-X-衍射圖譜衍射圖譜和分子模型，提出了和分子模型，提出了著名的著名的DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，并對(duì)模型的生模型，并對(duì)模型的生物學(xué)意義作出了科學(xué)物學(xué)意義作出了科學(xué)的解釋和預(yù)測(cè)。的解釋和預(yù)測(cè)。核酸核酸2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)DNADN

28、A雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)nDNADNA分子由兩條分子由兩條DNADNA單單鏈組成。鏈組成。nDNADNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)是分的雙螺旋結(jié)構(gòu)是分子中兩條子中兩條DNADNA單鏈之間單鏈之間基團(tuán)相互識(shí)別和作用基團(tuán)相互識(shí)別和作用的結(jié)果。的結(jié)果。n雙螺旋結(jié)構(gòu)是雙螺旋結(jié)構(gòu)是DNADNA二級(jí)二級(jí)結(jié)構(gòu)的最基本形式。結(jié)構(gòu)的最基本形式。核酸核酸2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)（1 1）DNADNA分子由兩條多聚脫氧核糖核苷酸鏈分子由兩條多聚脫氧核糖核苷酸鏈( (簡(jiǎn)簡(jiǎn)稱稱DNADNA單鏈單鏈) )組成組成。兩條鏈沿著同一根軸平行盤(pán)兩條鏈沿著同一根軸平行盤(pán)繞

29、，形成右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。螺旋中的兩條鏈方繞，形成右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。螺旋中的兩條鏈方向相反向相反，即其中一條鏈的方向?yàn)椋雌渲幸粭l鏈的方向?yàn)?353，而，而另一條鏈的方向?yàn)榱硪粭l鏈的方向?yàn)?535。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)（2 2）嘌呤堿和嘧啶）嘌呤堿和嘧啶堿基位于螺旋的堿基位于螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸和脫內(nèi)側(cè)，磷酸和脫氧核糖基位于螺氧核糖基位于螺旋外側(cè)。堿基環(huán)旋外側(cè)。堿基環(huán)平面與螺旋軸垂平面與螺旋軸垂直，糖基環(huán)平面直，糖基環(huán)平面與堿基環(huán)平面成與堿基環(huán)平面成9090角。角。DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)（3 3）螺旋橫截面的直）螺旋橫

30、截面的直徑約為徑約為2 nm2 nm，每條，每條鏈相鄰兩個(gè)堿基平鏈相鄰兩個(gè)堿基平面之間的距離為面之間的距離為3.4 3.4 nmnm，每，每1010個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸形成一個(gè)螺旋，其形成一個(gè)螺旋，其螺矩（即螺旋旋轉(zhuǎn)螺矩（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）高度為一圈）高度為34 nm34 nm。DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)DNADNA雙螺旋的穩(wěn)定性雙螺旋的穩(wěn)定性nDNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)在生理?xiàng)l件下是很穩(wěn)定的。雙螺旋結(jié)構(gòu)在生理?xiàng)l件下是很穩(wěn)定的。n維持這種穩(wěn)定性的因素包括：兩條維持這種穩(wěn)定性的因素包括：兩條DNADNA鏈之間形鏈之間形成的氫鍵；成的氫鍵；n由于雙

31、螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部形成的疏水區(qū)，消除了介質(zhì)由于雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部形成的疏水區(qū)，消除了介質(zhì)中水分子對(duì)堿基之間氫鍵的影響；介質(zhì)中的陽(yáng)離中水分子對(duì)堿基之間氫鍵的影響；介質(zhì)中的陽(yáng)離子（如子（如NaNa+ +、K K+ +和和MgMg2+2+）中和了磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷，）中和了磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷，降低了降低了DNADNA鏈之間的排斥力、范德華引力等。鏈之間的排斥力、范德華引力等。n改變介質(zhì)條件和環(huán)境溫度，將影響雙螺旋的穩(wěn)定改變介質(zhì)條件和環(huán)境溫度，將影響雙螺旋的穩(wěn)定性。性。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué) 核酸核酸的三級(jí)結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)n在三葉草型二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，突環(huán)上未在三葉草型二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，突環(huán)上未配

32、對(duì)的堿基由于整個(gè)分子的扭曲而配成對(duì)，配對(duì)的堿基由于整個(gè)分子的扭曲而配成對(duì)，目前已知的目前已知的tRNAtRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)均為倒的三級(jí)結(jié)構(gòu)均為倒L L型型核酸核酸2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)核酸核酸2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)核酸核酸2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n基因的定義 基因是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位?；蚴菦Q定一條多肽鏈的DNA片段。n分類 根據(jù)其功能把基因分為三類n編碼蛋白質(zhì)的基因編碼蛋白質(zhì)的基因，它具有轉(zhuǎn)錄和翻譯功能，包括編碼酶和結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)基因以及編碼阻遏蛋白的調(diào)節(jié)基因；n只有轉(zhuǎn)錄功能而沒(méi)有翻譯

33、功能的基因只有轉(zhuǎn)錄功能而沒(méi)有翻譯功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因；1.1.不轉(zhuǎn)錄的基因不轉(zhuǎn)錄的基因，它對(duì)基因表達(dá)起調(diào)節(jié)控制作用，包括啟動(dòng)基因和操縱基因。啟動(dòng)基因和操縱基因有時(shí)被統(tǒng)稱為控制基因。 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)基因的結(jié)構(gòu)2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)中心法則中心法則n生物的遺傳信息從生物的遺傳信息從 DNADNA傳遞給傳遞給 mRNAmRNA的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)錄。根據(jù)的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)錄。根據(jù) mRNAmRNA鏈上的遺傳信息合成蛋鏈上的遺傳信息合成蛋 白質(zhì)的過(guò)程，被稱為翻譯和

34、白質(zhì)的過(guò)程，被稱為翻譯和 表達(dá)。表達(dá)。19581958年年CrickCrick將生物將生物 遺傳信息的這種傳遞方式稱為中心法則。遺傳信息的這種傳遞方式稱為中心法則。DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制復(fù)制2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)錄過(guò)程轉(zhuǎn)錄過(guò)程2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)翻譯過(guò)程翻譯過(guò)程2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)基因的轉(zhuǎn)錄基因的轉(zhuǎn)錄 mRNA mRNA的合成的合成n基因轉(zhuǎn)錄是以基因轉(zhuǎn)錄是以DNADNA為模板合成與其堿基順為模板合成與其堿基順序互補(bǔ)的序互補(bǔ)的mRNAmRNA的過(guò)程。的過(guò)程。n細(xì)胞生長(zhǎng)周期的某個(gè)階段，細(xì)胞生長(zhǎng)周期的某個(gè)階段，DNADN

35、A雙螺旋解雙螺旋解開(kāi)成為轉(zhuǎn)錄模板，在開(kāi)成為轉(zhuǎn)錄模板，在RNARNA聚合酶催化下，聚合酶催化下，合成合成mRNAmRNA。mRNAmRNA不能自我復(fù)制，即其本不能自我復(fù)制，即其本身不能作為復(fù)制模板，因此在轉(zhuǎn)錄過(guò)程身不能作為復(fù)制模板，因此在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中即使出現(xiàn)某些差錯(cuò)，也不會(huì)遺傳下去。中即使出現(xiàn)某些差錯(cuò)，也不會(huì)遺傳下去。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)nmRNA mRNA 是是DNADNA的轉(zhuǎn)錄本，攜帶有合成蛋白的轉(zhuǎn)錄本，攜帶有合成蛋白質(zhì)的全部信息。蛋白質(zhì)的生物合成實(shí)際質(zhì)的全部信息。蛋白質(zhì)的生物合成實(shí)際上是以上是以mRNAmRNA作為模板進(jìn)行的。作為模板進(jìn)行的。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)

36、學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)遺傳密碼遺傳密碼nmRNAmRNA分子中所存儲(chǔ)的蛋白質(zhì)合成信息，是由組成它的四分子中所存儲(chǔ)的蛋白質(zhì)合成信息，是由組成它的四種堿基（種堿基（A A、G G、C C和和U U）以特定順序排列成三個(gè)一組的三）以特定順序排列成三個(gè)一組的三聯(lián)體代表的，即每三個(gè)堿基代表一個(gè)氨基酸信息。聯(lián)體代表的，即每三個(gè)堿基代表一個(gè)氨基酸信息。n這種代表遺傳信息的三聯(lián)體稱為密碼子，或三聯(lián)體密碼這種代表遺傳信息的三聯(lián)體稱為密碼子，或三聯(lián)體密碼子。子。 n因此因此 mRNA mRNA 分子的堿基順序即表示了所合成蛋白質(zhì)的氨分子的堿基順序即表示了所合成蛋白質(zhì)的氨基酸順序?；犴樞颉 mRNAmRNA的每一個(gè)密碼

37、子代表一個(gè)氨基酸。的每一個(gè)密碼子代表一個(gè)氨基酸。2020種基本氨基種基本氨基酸的三聯(lián)體密碼子都已經(jīng)確定。此外，還有一個(gè)密碼子酸的三聯(lián)體密碼子都已經(jīng)確定。此外，還有一個(gè)密碼子是肽鏈合成起始密碼子是肽鏈合成起始密碼子, , 三個(gè)是終止密碼子，以保證蛋三個(gè)是終止密碼子，以保證蛋白質(zhì)合成能夠有序地進(jìn)行。白質(zhì)合成能夠有序地進(jìn)行。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)遺傳密碼遺傳密碼2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)、基因技術(shù)的特征及研究?jī)?nèi)容、基因技術(shù)的特征及研究?jī)?nèi)容 基因工程的基本方法總結(jié)基因工程的基本方法總結(jié) 基本的DNA克隆技術(shù) PCR技術(shù)2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)、基因

38、技術(shù)的特征及研究?jī)?nèi)容、基因技術(shù)的特征及研究?jī)?nèi)容n1、基因工程的定義、基因工程的定義n基因工程（基因工程（genetic engineering），也叫基），也叫基因操作、遺傳工程，或重組體因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術(shù)。它是技術(shù)。它是一項(xiàng)將生物的某個(gè)基因通過(guò)基因載體運(yùn)送到另一項(xiàng)將生物的某個(gè)基因通過(guò)基因載體運(yùn)送到另一種生物的活性細(xì)胞中，并使之無(wú)性繁殖（稱一種生物的活性細(xì)胞中，并使之無(wú)性繁殖（稱之為之為克隆克?。┖托惺拐９δ埽ǚQ之為）和行使正常功能（稱之為表達(dá)表達(dá)），從而創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學(xué)），從而創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學(xué)技術(shù)。技術(shù)。 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)

39、醫(yī)學(xué)n基因工程是專指用生物化學(xué)的方法，在體外將用生物化學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）與載體系統(tǒng)與載體系統(tǒng)（病毒、細(xì)菌質(zhì)粒或噬菌體）的的DNA結(jié)合成一個(gè)復(fù)制子結(jié)合成一個(gè)復(fù)制子。n復(fù)制子所在的宿主生物或細(xì)胞中復(fù)制，繼而通復(fù)制子所在的宿主生物或細(xì)胞中復(fù)制，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、生長(zhǎng)和篩選轉(zhuǎn)化子，過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、生長(zhǎng)和篩選轉(zhuǎn)化子，無(wú)性繁殖使之成為克隆。無(wú)性繁殖使之成為克隆。n直接利用轉(zhuǎn)化子，或者將克隆的分子自轉(zhuǎn)化子直接利用轉(zhuǎn)化子，或者將克隆的分子自轉(zhuǎn)化子分離后再導(dǎo)入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系，使重組基因在分離后再導(dǎo)

40、入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系，使重組基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生特定的基因產(chǎn)物。細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生特定的基因產(chǎn)物。 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n基因工程中內(nèi)外源DNA插入載體分子所形成的雜合分子又稱為嵌合DNA或DNA嵌合體（DNA chimera）。n構(gòu)建這類重組體分子的過(guò)程，即對(duì)重組體分子的無(wú)性繁殖過(guò)程又稱為分子克?。╩olecular cloning），基因克?。╣ene cloning）或重組 DNA（recombinant DNA）。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2、基因工程的特征、基因工程的特征n基因工程有兩個(gè)重要的特征：n可把來(lái)自任何生物的基因轉(zhuǎn)移到與其毫無(wú)關(guān)系的其他受體

41、細(xì)胞中，因此可以實(shí)現(xiàn)按照人們的愿望，改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造出生物的新性狀；n某一段DNA可在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，為制備大量純化的DNA片段提供了可能，拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n3、基因工程的研究?jī)?nèi)容、基因工程的研究?jī)?nèi)容n基因工程的研究?jī)?nèi)容主要包括：n從復(fù)雜的生物體基因組中采用鳥(niǎo)槍克隆法、人工合成法等方法分離并獲得帶有目的基因的DNA片段；n在體外將含目的基因的DNA片段和具有自我復(fù)制功能、并帶有選擇性標(biāo)記的載體分子進(jìn)行酶切連接，獲得重組DNA分子；n 利用特定的方法將重組DNA分子轉(zhuǎn)移至適當(dāng)受體細(xì)胞（寄主細(xì)胞），并與其同步增殖；n從大量的細(xì)胞繁殖

42、群體中，篩選出克隆有重組DNA分子的寄主細(xì)胞；n將目的基因克隆至適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，采用特定的方法將基因?qū)胧荏w細(xì)胞，使其在新的遺傳背景下獲得活性表達(dá)，從而得到需要的特定目的物質(zhì)。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)基因工程流程模式圖基因工程流程模式圖2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)、基因技術(shù)在藥物研究中的基本方法、基因技術(shù)在藥物研究中的基本方法n基因技術(shù)可將已知編碼蛋白基因?qū)肷锃h(huán)境并使蛋白能夠被大量的表達(dá)，同時(shí)還可以改變蛋白特定位置上的氨基酸的位置，既可以對(duì)氨基酸個(gè)點(diǎn)位置、也可以使編碼蛋白基因中特定位置的突變等。n具體的方法包括n基因重組技術(shù)基因重組技術(shù)，如cDNA的克隆、P

43、CR擴(kuò)增等；n重組蛋白的表達(dá)重組蛋白的表達(dá)，表達(dá)宿主包括大腸桿菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等；n新型蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)新型蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)，新設(shè)計(jì)的蛋白包括天然蛋白質(zhì)的變異物、不同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的嵌合物等。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)、基因技術(shù)中常用的工具酶、基因技術(shù)中常用的工具酶n基因工程使用的每一種工具酶都具有自身特定的功能。有的像“手術(shù)刀”（限制性核酸內(nèi)切酶），可以進(jìn)行DNA分子的特定切割；有的像“粘合劑” （DNA連接酶），可以促進(jìn)DNA分子之間的粘合和連接；有的像“砌磚機(jī)”，可以合成完整的雙鏈DNA分子。n其他基因工程常用的工具酶，還有末端轉(zhuǎn)移酶、單鏈核酸酶和反轉(zhuǎn)錄酶

44、等。 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n限制性內(nèi)切酶(Restriction Endonuclease)簡(jiǎn)稱限制酶，能夠識(shí)別DNA大分子鏈上特定的核苷酸順序，并能在某一特定部位將DNA斷裂。這樣，目的基因便有可能完整地存在于某一DNA片段上，然后再把它們分離出來(lái)。n在基因工程中，限制酶是進(jìn)行DNA分子切割的特殊工具,具有“分子剪刀”或“分子手術(shù)刀”之稱。n已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的限制酶多達(dá)20多種。每一種都有極強(qiáng)的特異性，可以準(zhǔn)確無(wú)誤地進(jìn)行核苷酸的識(shí)別， 1、限制性核酸內(nèi)切酶、限制性核酸內(nèi)切酶2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶在識(shí)別和切割序列方面的特性（切割位點(diǎn)）、分

45、子量的大小、酶蛋白的結(jié)構(gòu)、催化條件（反應(yīng)所需的輔助因子等）和修飾活性，將限制酶分為I、 三類，然而在基因克隆中具有實(shí)用價(jià)值的只有類限制酶。n類限制酶的特性類限制酶的特性 n 識(shí)別特點(diǎn) 不同的限制酶對(duì)DNA識(shí)別序列是不同的，多數(shù)限制酶能夠識(shí)別有48個(gè)堿基對(duì)組成的特定核苷酸序列，識(shí)別位點(diǎn)的一個(gè)共同特征是核苷酸順序通常呈雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)，即回文序列，如EcoRI為5-GAATTC-3（較嚴(yán)格而獨(dú)特的識(shí)別序列），Hae I 為（序列中某些部位可有靈活性）， 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n 切割方式 切割位點(diǎn)相對(duì)于雙對(duì)稱軸的位置而言，可有兩種不同的切割方式：一種是在識(shí)別序列對(duì)稱軸兩側(cè)相同的

46、位置分別切割DNA，得到粘性末端（cohesive end，簡(jiǎn)稱粘端）；地二種是在對(duì)稱軸處同時(shí)切割DNA雙鏈，產(chǎn)生具有平端（blum end）的DNA片段（5-GAATTC-33-CTTAAG-5EcoR I5-G3-CTTAA AATTC-3 G-5+5-粘端5-CTGCAG-33-GACGTC-5PstI G-3 ACGTC-55-CTGCA3-G+3-粘端5-CCCGGG-33-GGGCCC-55-CCC3-GGGGGG-3CCC-5+Sam I平端2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n 同裂酶與同尾酶 雖然來(lái)源不同但是能夠識(shí)別相同的核苷酸序列，并且切割方式也相同限制酶稱之為同裂酶

47、；將那些雖然來(lái)源不同，識(shí)別序列和切割方式都不同、但切割后可產(chǎn)生相似的粘性末端的限制酶稱為同尾酶。n 末端的連接 同一種酶或者不同的酶經(jīng)梅切后產(chǎn)生的匹配粘端可在連接酶作用下直接進(jìn)行連接，這是DNA重組最常用的方法。雖然平度也可以直接連接，但是效率較低。此外不匹配粘端在經(jīng)過(guò)一定的修飾后，也可以進(jìn)行連接。n 影響限制酶活性的因素 影響限制酶的活性的因素很多，包括DNA的純度、鉤型、甲基化程度以及緩沖溶液的選擇、反應(yīng)溫度（多數(shù)最佳溫度為37，也有些不是）、酶的活性、用量、反應(yīng)速率（酶切時(shí)間）等。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n2、DNA連接酶連接酶n能催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵,它

48、要求一條DNA的3末端有一條游離羥基,并且在另一條DNA鏈的5末端有一個(gè)有一個(gè)磷酸基團(tuán)。并且它只能連接雙螺旋的DNA分子，而不能連接單鏈的或者環(huán)化的單鏈DNA分子。n3、其它的酶、其它的酶 n除上述的酶以外，在基因工程中還經(jīng)常用到能夠以DNA或者RNA為模版，在體外合成DNA 的DNA聚合酶。比較重要的包括大腸桿菌DNA聚合酶I、klenow酶、T噬菌體DNA聚合酶等；DNA聚合酶、測(cè)序酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、末端轉(zhuǎn)移酶、核酸修飾酶等。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n生物具有很強(qiáng)的排他性，目的基因很難進(jìn)入不同種屬的細(xì)胞中，即使能夠進(jìn)入細(xì)胞中，葉不能進(jìn)行復(fù)制和繁殖，它必須與具有自我復(fù)制能力的D

49、NA共價(jià)結(jié)合后才能被復(fù)制，這種具有在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制的DNA分子就是外源基因的運(yùn)載體。在基因技術(shù)中，基因運(yùn)載體（vector）的設(shè)計(jì)與應(yīng)用是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。運(yùn)載體運(yùn)載體 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n1、運(yùn)載體的類型、運(yùn)載體的類型 n運(yùn)載基因的載體作媒介物是必要的經(jīng)常使用的載體，目前用于基因制藥的基因運(yùn)載體主要包括： 質(zhì)粒環(huán)狀雙鏈小型 DNA 分子，種類甚多，有的可在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制，有的亦可用于動(dòng)、植物細(xì)胞。例如：根瘤土壤桿菌所攜帶的 Ti 質(zhì)粒常用作植物細(xì)胞基因工程的載體。人工改造的質(zhì)粒常用的有pBR322天然質(zhì)粒，派生質(zhì)粒pmB1，psC101等； 噬菌體常用的是噬菌體，

50、經(jīng)構(gòu)建后，常用于細(xì)菌細(xì)胞。此外還有Mu噬菌體載體等； 病毒例如猿猴空泡病毒 SV40 常用作動(dòng)物細(xì)胞基因工程的載體； 粘粒（cosmid，裝配性質(zhì)粒），由質(zhì)粒和Mu噬菌體的cos位點(diǎn)或膜等構(gòu)建而成的一種大容量克隆載體等。n不同的載體，分子量大小、結(jié)構(gòu)和用途上存在著較大的差異2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)2、作為運(yùn)載體的條件、作為運(yùn)載體的條件n用于基因克隆載體的理想質(zhì)粒應(yīng)能夠滿足： 具有復(fù)制起始點(diǎn)，即具有復(fù)制子功能，且復(fù)制起始區(qū)中沒(méi)有所需的限制酶切位點(diǎn)，并可維持使每個(gè)細(xì)胞含有一定的質(zhì)?？截悢?shù)，一般，一個(gè)質(zhì)粒只含有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子。 具有兩個(gè)易被檢測(cè)的選擇形標(biāo)記，一

51、個(gè)理想的質(zhì)粒克隆載體應(yīng)具有兩種抗生素抗性基因，以便為寄主細(xì)胞提供易于檢測(cè)的選擇形標(biāo)記。 具有多種限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，適用于各種限制酶產(chǎn)生的DNA片段的插入，以滿足基因克隆的需要，在插入適當(dāng)大小的外源DNA片段后，應(yīng)該不影響質(zhì)粒DNA的復(fù)制功能。 應(yīng)具有盡可能小的分子量，以利于分離純化等條件 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)3、載體的共性、載體的共性n能在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的DNA自我復(fù)制。在其DNA插人外源基因后，仍然保持穩(wěn)定的復(fù)制狀態(tài)和遺傳特性； 易于從宿主細(xì)胞中分離，并進(jìn)行純化；n在其DNA序列中，具有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)。這些位點(diǎn)位于DNA復(fù)制的非必需區(qū)內(nèi)，可在這些位

52、點(diǎn)上插人外源DNA，但不影響載體自身DNA的復(fù)制；2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n基因工程的原料就是目的基因。所謂目的基因，是指已被或欲被分離、改造、擴(kuò)增和表達(dá)的特定基因或DNA片段，能編碼某一產(chǎn)物或某一性狀。n目前獲取目的基因的方法主要有三種：反向轉(zhuǎn)錄法從細(xì)胞基因組直接分離法人工合成法。 、目的基因的獲取、目的基因的獲取 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)（1）反向轉(zhuǎn)錄法：n主要用于分子量較大而又不知其序列的基因.以目的基因的mRNA為模板，借助反轉(zhuǎn)錄酶合成堿基互補(bǔ)的DNA片段，即cDNA，再在DNA聚合酶的催化下合成雙鏈cDNA，亦即目的基因的雙鏈DNA。 2021-1

53、0-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)（2）從細(xì)胞基因組中直接分離：包括兩個(gè)主要步驟： 基因文庫(kù)組建n提取細(xì)胞的整體DNA，用內(nèi)切酶或其它方法將完整的雙鏈DNA分子隨機(jī)切割成適當(dāng)長(zhǎng)度的片段，得到的DNA片段群的某一片段上可能剛好有所需要的目的基因；然后把這些片段連接到合適的基因載體上，引入受體細(xì)胞中進(jìn)行分子克隆，即進(jìn)行目的基因的增殖。n測(cè)定所有含有重組DNA的克隆的個(gè)數(shù)，插入的染色體DNA片段的長(zhǎng)度，加以統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)算出克隆里包含的某物種染色體DNA遺傳信息量的概率。如果庫(kù)內(nèi)所有的重組DNA克隆上的染色體 DNA已經(jīng)代表了這個(gè)物種遺傳信息量的 95以上，那么這個(gè)基因文庫(kù)就建成了。 2021-10-10

54、藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué) 檢索n挑選含有特定目的基因的單一受體細(xì)胞。 利用某種檢測(cè)方法 根據(jù)重組克隆株明顯的表型變化，通過(guò)直接觀察挑選 利用核酸探針，直接檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的目的基因。核酸探針是用放射性同位素或其他標(biāo)記物標(biāo)記的DNA片段，具有非常特異的序列，能與互補(bǔ)鏈結(jié)合，因此用它可以進(jìn)行特定基因的檢測(cè)。 n用鳥(niǎo)槍法分離目的基因，具有簡(jiǎn)單、方便和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。許多病毒和原核生物、一些真核生物的基因，都用這種方法獲得了成功的分離。 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)（3）人工合成： 依照某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列，即可按密碼子推算出其基因的核苷酸序列，隨后應(yīng)用化學(xué)合成法，就可在短時(shí)間內(nèi)合成目的基因202

55、1-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)（1）獲取目的基因 即用各種不同的方法取得人所需要的基因，也就是某些DNA片段。那里面含有一種或幾種遺傳信息的全套遺傳密碼。獲取目的基因是基因工程操作的關(guān)鍵。（2）獲取基因載體 用人工方法，取得目的基因的適宜的載體，即質(zhì)?；虿《尽］d體一般帶有必要的標(biāo)志基因，以便進(jìn)行檢測(cè)。 基因工程的基本方法總結(jié)基因工程的基本方法總結(jié)2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué) (3)重組DNA 即用人工方法，讓目的基因與運(yùn)載體相結(jié)合，首先要用限制性內(nèi)切酶和其他一些酶類，切割或修飾載體DNA和目的基因，然后用連接酶將兩者連接起來(lái)，使目的基因插入載體內(nèi)，形成重組DNA分子。這些工

56、作都在生物體外進(jìn)行，所以基因工程操作又叫體外DNA重組。（4）把重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增 即用人工方法，讓攜帶著目的基因的運(yùn)載體進(jìn)入新的生物細(xì)胞里，讓其增殖，由此形成重組DNA的無(wú)性生殖系（即克?。?。（5）篩選與培育 即基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定、收集和加工等一系列復(fù)雜過(guò)程的綜合。 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)基因工程操作流程圖基因工程操作流程圖 合成基因基因組 DNA組織、器官、細(xì)胞mRNAcDNA克隆基因文庫(kù)合成文庫(kù)、基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)載體構(gòu)建細(xì)菌質(zhì)粒、病毒等蛋白質(zhì)氨基酸序列核酸序列寡聚核苷酸探針肽鏈合成目的基因克隆DNA序列篩選多肽抗體目的基因轉(zhuǎn)移原核細(xì)胞表達(dá)真核細(xì)胞表

57、達(dá)植物中表達(dá)動(dòng)物中表達(dá)人體表達(dá)發(fā)酵工程轉(zhuǎn)基因植物動(dòng)物器官反應(yīng)器轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因治療治療遺傳性疾病提取產(chǎn)品蛋白質(zhì)表達(dá)篩選2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué) 其他相關(guān)技術(shù)其他相關(guān)技術(shù)n1、PCR技術(shù)技術(shù)n多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是一種依賴于特異DNA序列的體外酶促擴(kuò)增技術(shù)n在試管中有DNA模版、引物和含有四種不同堿基的脫氧核糖核苷酸的合適緩沖液中，DNA聚合酶催化DNA合成的往復(fù)循環(huán)，體系中含有短的DNA引物和幾種脫氧核苷酸混合物，其中一條引物與cDNA未尾結(jié)合另一引物與cDNA的互補(bǔ)鏈另一端結(jié)合，反應(yīng)的結(jié)果使模版DNA被大量的擴(kuò)增，反應(yīng)往

58、返循環(huán)下去就使靶序列大大擴(kuò)增，n理論上每循環(huán)一次，就使產(chǎn)物在前一循環(huán)的基礎(chǔ)上翻一倍，依次下去，經(jīng)過(guò)2530個(gè)循環(huán)后，最初的靶序列就可擴(kuò)增105109倍。 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)n2、生物芯片技術(shù)、生物芯片技術(shù)n.生物芯片是近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)。n主要是指通過(guò)微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固格體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA 以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)6-3 與基因有關(guān)的藥物設(shè)計(jì)與基因有關(guān)的藥物設(shè)計(jì)n一、核酸的作用基礎(chǔ)一、核酸的作用基礎(chǔ)n二、以核酸為靶點(diǎn)的藥物

59、設(shè)計(jì)二、以核酸為靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)n三、基因突變、基因重組與藥物設(shè)計(jì)三、基因突變、基因重組與藥物設(shè)計(jì)2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)一、核酸的作用基礎(chǔ)一、核酸的作用基礎(chǔ)n基因的研究已經(jīng)深入到許多領(lǐng)域，但研究的基礎(chǔ)卻可以用一個(gè)模型、一個(gè)法則和四個(gè)概念來(lái)簡(jiǎn)述：n一個(gè)模型：一個(gè)模型：1953年由Watson和Crick提出的DNA的雙螺旋模型，基因研究的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；n一個(gè)法則：一個(gè)法則：基因表達(dá)的中心法則指的是生物的遺傳信息從 DNA傳遞給mRNA的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)錄。根據(jù)mRNA鏈上的遺傳信息合成蛋白質(zhì)的過(guò)程，被稱為翻譯和表達(dá)。n四個(gè)概念：四個(gè)概念：復(fù)制（replication）、轉(zhuǎn)錄（transc

60、ription）、翻譯(translation)和密碼子(codon) 2021-10-10藥物設(shè)計(jì)學(xué)基因技術(shù)醫(yī)學(xué)中心法則nDNA復(fù)制與生物遺傳信息的保持復(fù)制與生物遺傳信息的保持在復(fù)制開(kāi)始階段，DNA的雙螺旋拆分成兩條單鏈。以DNA單鏈為模板，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則, 在DNA聚合酶催化下，合成與模板DNA完全互補(bǔ)的新鏈，并形成一個(gè)新的DNA分子。通過(guò)DNA復(fù)制形成的新DNA分子, 與原來(lái)的DNA分子完全相同。 經(jīng)過(guò)一個(gè) 復(fù)制周期后，子代DNA分子的兩條鏈中，一條來(lái)自親代DNA分子，另一條是新合成的，所以又稱為半保留復(fù)制。D DN NA A儲(chǔ)儲(chǔ)存存的的一一維維信信息息轉(zhuǎn)錄R RN NA A儲(chǔ)儲(chǔ)