微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)

1、微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)主要內(nèi)容：主要內(nèi)容：2.1 微生物分離和純培養(yǎng)微生物分離和純培養(yǎng) 2.2 顯微鏡和顯微技術(shù)顯微鏡和顯微技術(shù) 微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)顯微技術(shù)是微生物研究的另一項重要技術(shù)顯微技術(shù)是微生物研究的另一項重要技術(shù)個體小個體小微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2.1 微生物的分離和純培養(yǎng)微生物的分離和純培養(yǎng) 2.1.1 無菌技術(shù)無菌技術(shù) 2.1.2. 用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 2.1.3. 用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 2.1.4. 單細(xì)胞（孢子）分離單細(xì)胞（孢子）分離 2.1.5. 選擇培養(yǎng)分離選擇培養(yǎng)分離 2

2、.1.6. 二元培養(yǎng)物二元培養(yǎng)物 微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù) 無菌技術(shù)：在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時防止其被無菌技術(shù)：在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時防止其被其它微生物污染的技術(shù)。其它微生物污染的技術(shù)。 它是保證微生物學(xué)研究正常進(jìn)行的關(guān)鍵它是保證微生物學(xué)研究正常進(jìn)行的關(guān)鍵A 微生物培養(yǎng)的常用器具微生物培養(yǎng)的常用器具B 最常用滅菌方法最常用滅菌方法C 接種操作接種操作2.1.1 無菌技術(shù)無菌技術(shù)微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)A 微生物培養(yǎng)的常用器具微生物培養(yǎng)的常用器具常用器具：試管、玻璃燒瓶、平皿等器皿都要常用器具：試管、玻璃燒瓶、平皿等器皿都要滅菌滅菌培養(yǎng)基：培養(yǎng)微生物營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基：培養(yǎng)微

3、生物營養(yǎng)物質(zhì)。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時）。主要用干玻璃小時）。主要用干玻璃器皿消毒器皿消毒濾器：過濾除菌，大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血濾器：過濾除菌，大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌清、酶液等均采用濾過法除菌 超凈工作臺：為操作提供無菌環(huán)境超凈工作臺：為操作提供無菌環(huán)境紫外燈紫外燈 ：紫外線消毒。：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒A 微

4、生物培養(yǎng)的常用器具微生物培養(yǎng)的常用器具微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)B 最常用的滅菌方法最常用的滅菌方法1. 干熱滅菌：一般玻璃用具，如培養(yǎng)皿、吸管干熱滅菌：一般玻璃用具，如培養(yǎng)皿、吸管等用報紙包好后，放烘箱中，使溫度逐漸升等用報紙包好后，放烘箱中，使溫度逐漸升至至150160，保持，保持2小時后，關(guān)閉電源，小時后，關(guān)閉電源，使緩慢冷卻（降溫太快時玻璃易碎），即滅使緩慢冷卻（降溫太快時玻璃易碎），即滅菌完畢。菌完畢。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)常壓法（間歇滅菌法）：是用蒸汽鍋（或普常壓法（間歇滅菌法）：是用蒸汽鍋（或普通鍋）蒸，溫度不超過通鍋）蒸，溫度不超過100。每次一小時，。每次一小時，

5、共三次，每次間隔共三次，每次間隔24小時（殺死孢子）。小時（殺死孢子）。2. 濕熱滅菌：利用蒸氣殺菌。濕熱滅菌：利用蒸氣殺菌。高壓法：鍋內(nèi)增加壓力時則溫度隨之增高。高壓法：鍋內(nèi)增加壓力時則溫度隨之增高。 溫度為溫度為112.6；滅菌；滅菌30分鐘。分鐘。溫度為溫度為120121；滅菌；滅菌20分鐘。分鐘。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)3. 過濾除菌法過濾除菌法 本法系用濾過方法除去活的或死的微生物的方本法系用濾過方法除去活的或死的微生物的方法，是一種機(jī)械除菌的方法。本法主要用于對熱法，是一種機(jī)械除菌的方法。本法主要用于對熱極不穩(wěn)定的藥物小針劑或凍干粉針制劑的除菌。極不穩(wěn)定的藥物小針劑或凍干粉針

6、制劑的除菌。 除菌過濾器采用孔徑分布均勻的微孔濾膜作過除菌過濾器采用孔徑分布均勻的微孔濾膜作過濾材料，為保證阻止細(xì)菌和細(xì)菌孢子通過濾器，濾材料，為保證阻止細(xì)菌和細(xì)菌孢子通過濾器，濾膜的孔徑一般不超過濾膜的孔徑一般不超過0.22m。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù) 對于接種針或其對于接種針或其它金屬用具滅菌，可它金屬用具滅菌，可直接在酒精燈火焰上直接在酒精燈火焰上燒至紅熱。此外在接燒至紅熱。此外在接種過程中，試管或三種過程中，試管或三角瓶口，也采取通過角瓶口，也采取通過火焰達(dá)到滅菌的目的。火焰達(dá)到滅菌的目的。4. 火焰滅菌：火焰滅菌：微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù) 70的酒精：操作前手或器皿的表面

7、殺菌，的酒精：操作前手或器皿的表面殺菌，載玻片，蓋玻片的浸泡等。載玻片，蓋玻片的浸泡等。 1:1000 新潔爾滅溶液，浸泡時間為新潔爾滅溶液，浸泡時間為30分鐘，分鐘，常用于表面的消毒。常用于表面的消毒。 福爾馬林（福爾馬林（40甲醛液）：用于空間熏蒸滅甲醛液）：用于空間熏蒸滅菌，加熱或加高錳酸鉀使其放出甲醛氣體。注菌，加熱或加高錳酸鉀使其放出甲醛氣體。注意將空間密閉并維持意將空間密閉并維持24小時。小時。5. 藥物滅菌：藥物滅菌：微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)6. 紫外線滅菌紫外線滅菌用于接種室等空氣滅菌。用于接種室等空氣滅菌。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣壓

8、力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒小時）。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過濾除菌，大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等濾器：過濾除菌，大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌均采用濾過法除菌 超凈工作臺：為操作提供無菌環(huán)境超凈工作臺：為操作提供無菌環(huán)境紫外燈紫外燈 ：紫外線消毒。：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒培養(yǎng)板等表面消毒常用的滅菌器具常用的滅菌器具微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)無菌操作臺無菌操作臺火焰旁

9、無菌區(qū)火焰旁無菌區(qū)超凈臺超凈臺 超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2.1.2 用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 菌落（菌落（colony） ：由單個微生物在適宜：由單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度后，形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)程度后，形成肉眼

10、可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長群體。的子細(xì)胞生長群體。 菌苔菌苔(lawn)：固體培養(yǎng)基表面眾多菌落：固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片，呈片狀，這就是菌苔。連成一片，呈片狀，這就是菌苔。 A 相關(guān)概念相關(guān)概念1菌落與菌苔菌落與菌苔微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)菌落的大小、形狀、邊緣狀況、質(zhì)地、光澤、顏菌落的大小、形狀、邊緣狀況、質(zhì)地、光澤、顏色及透明度等是微生物分類、鑒定的重要依據(jù)。色及透明度等是微生物分類、鑒定的重要依據(jù)。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù) 放線菌在固體培養(yǎng)基上形成與細(xì)菌不同的菌落特征，放線菌菌絲相互交錯放線菌在固體培養(yǎng)基上形成與細(xì)菌不同的菌落特征，放線菌菌絲相互交錯纏繞形成質(zhì)

11、地致密的小菌落，干燥、不透明、難以挑取，當(dāng)大量孢子覆蓋于纏繞形成質(zhì)地致密的小菌落，干燥、不透明、難以挑取，當(dāng)大量孢子覆蓋于菌落表面時，就形成表面為粉末狀或顆粒狀的典型放線菌菌落。菌落表面時，就形成表面為粉末狀或顆粒狀的典型放線菌菌落。放放線線菌菌菌菌落落微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)酵母菌落酵母菌落微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù) A 相關(guān)概念相關(guān)概念2純種微生物的分離純種微生物的分離n在自然界中，各種各樣的微生物總是混雜在一起的，在自然界中，各種各樣的微生物總是混雜在一起的，要研究和利用某一微生物，就必須把它同其他微生物要研究和利用某一微生物，就必須把它同其他微生物分開，才能得到只含有同一種微

12、生物的純種微生物。分開，才能得到只含有同一種微生物的純種微生物。這種方法叫純種微生物的分離這種方法叫純種微生物的分離n大多數(shù)細(xì)菌、酵母菌、以及許多真菌和單細(xì)胞大多數(shù)細(xì)菌、酵母菌、以及許多真菌和單細(xì)胞藻類能在固體培養(yǎng)基上形成孤立的菌落，采用藻類能在固體培養(yǎng)基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養(yǎng)。適宜的平板分離法很容易得到純培養(yǎng)。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)B 純種微生物的分離方法純種微生物的分離方法n稀釋倒平板法稀釋倒平板法n涂布平板法涂布平板法n平板劃線分離法平板劃線分離法n稀釋搖管法稀釋搖管法 微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)1 稀釋倒平板法稀釋倒平板法稀釋：先將待分離的材

13、料用無菌水作一系列的稀釋稀釋：先將待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋（如（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000.）；）；倒平板：然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷倒平板：然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至卻至50左右的瓊脂培養(yǎng)基混勻后，傾入滅過菌的培左右的瓊脂培養(yǎng)基混勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板；養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板；培養(yǎng)：保溫培養(yǎng)一定時間即可出現(xiàn)菌落。隨后挑取該培養(yǎng)：保溫培養(yǎng)一定時間即可出現(xiàn)菌落。隨后挑取該單個菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。單個菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。微生

14、物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)3. 平板劃線法平板劃線法n接種環(huán)沾取少許微生物，在無菌平板扇形、平行等接種環(huán)沾取少許微生物，在無菌平板扇形、平行等劃線，隨劃線次數(shù)增加而分散開，得到單菌落。劃線，隨劃線次數(shù)增加而分散開，得到單菌落。平板劃線分離平板劃線分離微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)厭氧微生物分離裝置：厭氧微生物分離裝置：厭氧罐厭氧罐厭氧手套箱厭氧手套箱微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2.1.4 單細(xì)胞分離單細(xì)胞分離單細(xì)胞（單孢子）顯微分離單細(xì)胞（單孢子）顯微分離稀釋法缺點稀釋法缺點分離優(yōu)勢菌分離優(yōu)勢菌顯微分離法直接分離單細(xì)胞或單個個顯微分離法直接分離單細(xì)胞或單個個體培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)體培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)顯

15、微操作儀，專業(yè)程度高顯微操作儀，專業(yè)程度高微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2.1.5 選擇培養(yǎng)分離選擇培養(yǎng)分離 對某微生物生長需要了解后，根據(jù)微生物的特對某微生物生長需要了解后，根據(jù)微生物的特性設(shè)計培養(yǎng)基，即使該微生物在混雜群體中很少也性設(shè)計培養(yǎng)基，即使該微生物在混雜群體中很少也可分離。可分離。如：耐高溫菌采用高溫篩選；如：耐高溫菌采用高溫篩選； 蛋白酶產(chǎn)生菌加牛奶或酪素篩選；蛋白酶產(chǎn)生菌加牛奶或酪素篩選； 抗抗生素可采用加抗生素篩選抗抗生素可采用加抗生素篩選A 利用選擇培養(yǎng)基直接分離利用選擇培養(yǎng)基直接分離微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2 富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)土懸液土懸液培養(yǎng)基培養(yǎng)基+硫磺硫磺分離出

16、硫桿菌分離出硫桿菌土懸液土懸液以羥基苯甲酸為唯一碳源的培養(yǎng)基以羥基苯甲酸為唯一碳源的培養(yǎng)基分分離出能降解羥基苯甲酸的微生物。離出能降解羥基苯甲酸的微生物。特定的環(huán)境條件特定的環(huán)境條件僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長待分離微生物在群落中的數(shù)量大大增加待分離微生物在群落中的數(shù)量大大增加從自然界中分離到所需的特定微生物從自然界中分離到所需的特定微生物微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2.1.6 二元培養(yǎng)物二元培養(yǎng)物純培養(yǎng)物：只含有一種微生物的培養(yǎng)物叫做純培養(yǎng)物。純培養(yǎng)物：只含有一種微生物的培養(yǎng)物叫做純培養(yǎng)物。混合培養(yǎng)物：含有兩種以上微生物的培養(yǎng)物叫做混合混合培養(yǎng)物：含有兩種以

17、上微生物的培養(yǎng)物叫做混合培養(yǎng)物。培養(yǎng)物。二元培養(yǎng)物二元培養(yǎng)物: 培養(yǎng)物只含兩種微生物，并有意識保持兩培養(yǎng)物只含兩種微生物，并有意識保持兩者之間者之間 的特定關(guān)系的培養(yǎng)物為二元培養(yǎng)物。的特定關(guān)系的培養(yǎng)物為二元培養(yǎng)物。 例如寄生于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的病毒與細(xì)菌一起培養(yǎng)。對于例如寄生于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的病毒與細(xì)菌一起培養(yǎng)。對于病毒來說，二元培養(yǎng)物是在實驗室控制條件下可能達(dá)病毒來說，二元培養(yǎng)物是在實驗室控制條件下可能達(dá)到的最接近于純培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。到的最接近于純培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2.1.7 微生物的保藏技術(shù)微生物的保藏技術(shù)菌種保藏目的：給微生物一特定的條件，使其不污菌種保藏目的：給微生物

18、一特定的條件，使其不污染、不改變特性而存活下來。染、不改變特性而存活下來。l 性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進(jìn)行。求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進(jìn)行。 l菌種保藏原理：用人工方法降低微生物的代謝強(qiáng)度，菌種保藏原理：用人工方法降低微生物的代謝強(qiáng)度，限制微生物的生長和繁殖，使其處于休眠狀態(tài)。限制微生物的生長和繁殖，使其處于休眠狀態(tài)。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)傳代培養(yǎng)保藏傳代培養(yǎng)保藏隔絕空氣低溫保藏隔絕空氣低溫保藏冷凍保藏冷凍保藏保護(hù)劑保護(hù)劑+菌種菌種零下零下196度速凍度速凍保存，或保存，或-70度冷凍室保存，度冷

19、凍室保存，-20-30度普通冰度普通冰箱冷凍室保存。箱冷凍室保存。干燥保藏干燥保藏砂土管保存法和冷凍真空干燥保砂土管保存法和冷凍真空干燥保藏法藏法微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2.2 顯微鏡和顯微技術(shù)顯微鏡和顯微技術(shù)決定顯微觀察效果的兩個重要因素決定顯微觀察效果的兩個重要因素分辨率：指能辨別兩點之間最小距離的能力分辨率：指能辨別兩點之間最小距離的能力反差：指樣品區(qū)別于背景的程度反差：指樣品區(qū)別于背景的程度微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2.2.1. 顯微鏡的種類及原理顯微鏡的種類及原理 2.2.2. 顯微觀察樣品的制備顯微觀察樣品的制備2.2 顯微鏡和顯微技術(shù)顯微鏡和顯微技術(shù)微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)

20、和顯微技術(shù)2.2.1 顯微鏡的種類及原理顯微鏡的種類及原理1.1. 普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡 2.2. 暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡3.3. 相差顯微鏡相差顯微鏡 4.4. 熒光顯微鏡熒光顯微鏡5.5. 透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡 6.6. 掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡 7.7. 掃描隧道顯微鏡掃描隧道顯微鏡 微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)1. 普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡 機(jī)械裝置：鏡座、支架、載物機(jī)械裝置：鏡座、支架、載物臺、調(diào)焦螺旋臺、調(diào)焦螺旋 光學(xué)系統(tǒng)：物鏡、目鏡、聚光光學(xué)系統(tǒng)：物鏡、目鏡、聚光器器 普通顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖普通顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)顯微鏡的分辨率

21、與放大倍數(shù)顯微鏡的分辨率與放大倍數(shù)分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。 D = 0.61/ NA = 0.61/sin/2 其中其中為入射光線波長；為入射光線波長；NA為鏡口率為鏡口率 sin/2，n=介質(zhì)折射率；介質(zhì)折射率；=鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角）鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角） 。 思考：思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？如何提高顯微鏡的分辨能力？微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)顯微鏡的幾個光學(xué)特點顯微鏡的幾個光學(xué)特點 制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.651.78，所用介，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。質(zhì)的折射率越接近玻

22、璃的越好。sin /2的最大值必然小于的最大值必然小于1；介質(zhì)為空氣，鏡口率一；介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為般為0.050.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近近1.5。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2.暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡利用特殊聚光器實現(xiàn)給樣品斜射照明，由樣品反利用特殊聚光器實現(xiàn)給樣品斜射照明，由樣品反射或折射的光再進(jìn)入物鏡，這樣整個視野是暗的，射或折射的光再進(jìn)入物鏡，這樣整個視野是暗的，只有樣品是明亮的。只有樣品是明亮的。主要用于觀察生活細(xì)菌的運動性。主要用于觀察生活細(xì)菌的運動性。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)3. 相差顯微鏡相差顯微鏡n光線透過透明

23、標(biāo)本，波長（顏色）和振幅（亮度）沒有多大變化，用光線透過透明標(biāo)本，波長（顏色）和振幅（亮度）沒有多大變化，用普通顯微鏡觀察透明標(biāo)本，其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)難以分辨。細(xì)胞各部分普通顯微鏡觀察透明標(biāo)本，其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)難以分辨。細(xì)胞各部分折射率和厚度不同，當(dāng)光線通過時，直射光和衍射光光程有差別，而折射率和厚度不同，當(dāng)光線通過時，直射光和衍射光光程有差別，而人眼看不到，但是可通過相差顯微鏡看到。人眼看不到，但是可通過相差顯微鏡看到。n相差顯微鏡采用特殊光學(xué)裝置：環(huán)狀光闌和相差板，利用光的干涉，相差顯微鏡采用特殊光學(xué)裝置：環(huán)狀光闌和相差板，利用光的干涉，將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢姷恼穹睿靼担?，使能不染?/p>

24、而看到將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢姷恼穹睿靼担鼓懿蝗旧吹交罴?xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的某些顯微結(jié)構(gòu)。活細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的某些顯微結(jié)構(gòu)。n其發(fā)明人其發(fā)明人F.ZernikeF.Zernike因此獲因此獲19531953年諾貝爾物理獎。年諾貝爾物理獎。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)4. 熒光顯微鏡熒光顯微鏡熒光顯微技術(shù)原理：熒光素吸收熒光顯微技術(shù)原理：熒光素吸收uv放出波長較長的可見放出波長較長的可見光，因此在光，因此在uv照射下，發(fā)熒光的物體會在黑暗背景顯現(xiàn)照射下，發(fā)熒光的物體會在黑暗背景顯現(xiàn)為光亮有色物體。在免疫學(xué)和分子生物學(xué)應(yīng)用廣泛。為光亮有色物體。在免疫學(xué)和分子生物學(xué)應(yīng)用廣泛。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)

25、和顯微技術(shù)5. 透射電子顯微鏡（簡寫透射電子顯微鏡（簡寫TEM）用波長短的電磁波取代可見光，用波長短的電磁波取代可見光，使分辨率提高。使分辨率提高。 工作原理類似，工作原理類似，因光源不同，有區(qū)別因光源不同，有區(qū)別: 1）電子遇空氣中分子會發(fā)生偏）電子遇空氣中分子會發(fā)生偏轉(zhuǎn)使物象不清楚，因此鏡筒高真轉(zhuǎn)使物象不清楚，因此鏡筒高真空；空； 2)電子帶電荷，電鏡是用電磁圈電子帶電荷，電鏡是用電磁圈使之聚焦使之聚焦 ；3)電子像人眼看不到，用熒光屏電子像人眼看不到，用熒光屏顯示或感光膠片記錄。顯示或感光膠片記錄。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)6. 掃描電子顯微鏡（掃描電子顯微鏡（SEM）掃描電子顯微鏡

26、掃描電子顯微鏡大腸桿菌掃描電鏡圖大腸桿菌掃描電鏡圖工作原理與光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡不同，是電子束掃描，激發(fā)樣品表面放出工作原理與光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡不同，是電子束掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，電子產(chǎn)生多少與標(biāo)本表面立體形貌有關(guān)。電子經(jīng)探測器收集，經(jīng)光電倍二次電子，電子產(chǎn)生多少與標(biāo)本表面立體形貌有關(guān)。電子經(jīng)探測器收集，經(jīng)光電倍增管和放大器，產(chǎn)生樣品立體圖像于熒光屏上。增管和放大器，產(chǎn)生樣品立體圖像于熒光屏上。 主要用于：樣品表面結(jié)構(gòu)主要用于：樣品表面結(jié)構(gòu)微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)7. 掃描隧道顯微鏡（掃描隧道顯微鏡（STM）80年代出現(xiàn)的，原理：利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)。年代出現(xiàn)

27、的，原理：利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)。 其橫向分辨率：其橫向分辨率：0.10.2nm，縱向分辨率：，縱向分辨率：0.001nm 這種分辨率足以對單個原子觀察。這種分辨率足以對單個原子觀察。 用這種顯微鏡可直接觀察蛋白質(zhì)、用這種顯微鏡可直接觀察蛋白質(zhì)、DNA、RNA等分子等分子的結(jié)構(gòu)。的結(jié)構(gòu)。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù) 廚房抹布上的細(xì)菌和霉菌廚房抹布上的細(xì)菌和霉菌棉纖維上的汗垢棉纖維上的汗垢掃描隧道顯微鏡下的掃描隧道顯微鏡下的DNA微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2.2.2 顯微鏡和顯微技術(shù)顯微鏡和顯微技術(shù)n 樣品好壞直接影響觀察結(jié)果。樣品好壞直接影響觀察結(jié)果。 n 考慮因素：根據(jù)所用顯微鏡特點

28、采用合適考慮因素：根據(jù)所用顯微鏡特點采用合適制樣方法，盡可能使樣品生理結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，制樣方法，盡可能使樣品生理結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，采用各種方法提高反差。采用各種方法提高反差。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)光學(xué)顯微鏡制樣光學(xué)顯微鏡制樣活體觀察活體觀察染色染色壓滴法壓滴法懸滴法懸滴法菌絲埋片法菌絲埋片法活菌活菌死菌死菌美藍(lán)染色美藍(lán)染色簡單染色簡單染色鑒別染色鑒別染色革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)特點：避免染色對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，用于運動性、攝特點：避免染色對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，用于運動性、攝食特性、生長繁殖過程中形態(tài)變化等觀察食特性、生長繁殖過程中形態(tài)變化等

29、觀察 。壓滴法：菌懸液滴載玻片，加蓋玻片直接觀察；壓滴法：菌懸液滴載玻片，加蓋玻片直接觀察； 懸滴法：蓋玻片滴一滴菌懸液，反轉(zhuǎn)置于特制凹載玻懸滴法：蓋玻片滴一滴菌懸液，反轉(zhuǎn)置于特制凹載玻片直接觀察片直接觀察 ；菌絲埋片法：無菌小玻璃紙鋪平板表面，涂布孢子懸菌絲埋片法：無菌小玻璃紙鋪平板表面，涂布孢子懸液，培養(yǎng)后，取下玻璃紙置于載玻片，觀察液，培養(yǎng)后，取下玻璃紙置于載玻片，觀察 。光學(xué)顯微鏡樣品制備活體觀察光學(xué)顯微鏡樣品制備活體觀察微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)活體觀察難看到微生物的細(xì)致形態(tài)和結(jié)構(gòu)，需染色活體觀察難看到微生物的細(xì)致形態(tài)和結(jié)構(gòu)，需染色觀察。染色前需要對觀察。染色前需要對樣品固定樣品

30、固定，目的：殺死細(xì)，目的：殺死細(xì)菌使菌體黏附在玻片上；還可增加對染料的親和菌使菌體黏附在玻片上；還可增加對染料的親和力。力。 常用方法：常用方法：酒精火焰加熱酒精火焰加熱和和化學(xué)固定（化學(xué)固定（ 95%酒酒精、酒精和醚各半的混合物、丙酮、精、酒精和醚各半的混合物、丙酮、12%的鋨酸等）的鋨酸等）光學(xué)顯微樣品制備染色觀察光學(xué)顯微樣品制備染色觀察微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)革蘭氏染色法革蘭氏染色法革蘭氏染色法：革蘭氏染色法：1884年，由丹麥病理學(xué)家革蘭創(chuàng)造并使年，由丹麥病理學(xué)家革蘭創(chuàng)造并使用的一種能鑒別細(xì)菌的染色方法。用的一種能鑒別細(xì)菌的染色方法。微生物學(xué)微生物純培養(yǎng)和顯微技術(shù)大腸桿菌革蘭氏染色大腸桿菌革蘭氏染