第二章樣品預處理方法

1、第二章 樣品預處理方法 一、概述： 1、樣品處理的目的樣品處理的目的 色譜分析技術 氣相色譜 高效液相色譜 高效毛細管電泳 平面色譜 氣相色譜質譜 聯(lián)用技術 液相色譜質譜 液相色譜核磁 氣相色譜紅外 石化過程分析石化過程分析 工業(yè)衛(wèi)生調查和評價工業(yè)衛(wèi)生調查和評價 藥物動力學和毒理學研究藥物動力學和毒理學研究 食品分析食品分析 法庭取證分析法庭取證分析 色譜法應用色譜法應用 醫(yī)療診斷醫(yī)療診斷 核能和燃料分析核能和燃料分析 制藥過程監(jiān)測制藥過程監(jiān)測 化妝品和香料組成分析化妝品和香料組成分析 商品質量檢驗商品質量檢驗 樣品預處理的目的 除去微粒除去微粒 減少干擾雜質減少干擾雜質 濃縮微量的組份濃縮微

2、量的組份 提高檢測的靈敏度及選擇性提高檢測的靈敏度及選擇性 改善分離的效果改善分離的效果 有利于色譜柱及儀器的保護有利于色譜柱及儀器的保護 2、樣品處理的必要性和重要性、樣品處理的必要性和重要性 v色譜分析的全過程包括：色譜分析的全過程包括：樣品采集樣品采集、 樣品制備樣品制備、色譜分析、數(shù)據(jù)處理與結色譜分析、數(shù)據(jù)處理與結 果表述果表述 v 樣品種類繁多，其組成、濃度、物樣品種類繁多，其組成、濃度、物 理形態(tài)等均是色譜分析測定的影響因理形態(tài)等均是色譜分析測定的影響因 素。素。樣品處理技術就成為提高分析測樣品處理技術就成為提高分析測 定效率、改善和優(yōu)化色譜分析的重要定效率、改善和優(yōu)化色譜分析的重

3、要 環(huán)節(jié)。環(huán)節(jié)。 v占樣品分析時間的比例（占樣品分析時間的比例（ 60%） 樣品預處理所用時間遠大于色譜分離的時間樣品預處理所用時間遠大于色譜分離的時間 v占分析的消耗總成本最大占分析的消耗總成本最大 消耗大量的溶劑及其他化學品消耗大量的溶劑及其他化學品 v實驗的重復性及準確性最差的環(huán)節(jié)實驗的重復性及準確性最差的環(huán)節(jié) 影響實驗結果好壞的最重要因素影響實驗結果好壞的最重要因素 是決定性的步驟是決定性的步驟 3、樣品處理的原則 （1 1）樣品中可能存在的物質組成？濃度水平？）樣品中可能存在的物質組成？濃度水平？ （2 2）樣品中的主要組分？）樣品中的主要組分？ （3 3）采樣方法是非破壞性的還是破

4、壞性的？）采樣方法是非破壞性的還是破壞性的？ （4 4）收集的樣品必須有代表性。）收集的樣品必須有代表性。 （5 5）采用方法必須和分析目的保持一致。）采用方法必須和分析目的保持一致。 （6 6）樣品制備過程中盡可能防止和避免待測定）樣品制備過程中盡可能防止和避免待測定 組分發(fā)生化學變化或丟失組分發(fā)生化學變化或丟失 3、樣品處理的原則（續(xù)） （7 7）樣品處理中，若進行待測定組分的化學反）樣品處理中，若進行待測定組分的化學反 應，則反應應是已知的和定量完成的。應，則反應應是已知的和定量完成的。 （8 8）樣品制備過程中，要防止和避免待測定組）樣品制備過程中，要防止和避免待測定組 分受到污染，減

5、少無關化合物引入制備過程。分受到污染，減少無關化合物引入制備過程。 （9 9）處理過程應簡單易行，所用樣品處理裝置）處理過程應簡單易行，所用樣品處理裝置 的尺寸應與處理樣品的量相適應。的尺寸應與處理樣品的量相適應。 （1010）采用后應盡可能快的進行分析樣品的制備）采用后應盡可能快的進行分析樣品的制備 和分析，或使用適當?shù)姆椒ㄏ赡墚a(chǎn)生的干和分析，或使用適當?shù)姆椒ㄏ赡墚a(chǎn)生的干 擾，做好樣品的保存。擾，做好樣品的保存。 二、樣品的采集 氣體（包括蒸汽）氣體（包括蒸汽） 涉及的樣品形式涉及的樣品形式 液體（包括乳液）液體（包括乳液） 固體（包括氣體懸浮物、固體（包括氣體懸浮物、 液體懸浮物）

6、液體懸浮物） 直接采集直接采集 主要采集方法主要采集方法 富集采集富集采集 化學反應法采集化學反應法采集 v直接采集：只需將樣品直接引進容器中，所只需將樣品直接引進容器中，所 用容器最好是新的或洗凈后干燥的，以防止用容器最好是新的或洗凈后干燥的，以防止 其他樣品的殘留影響。其他樣品的殘留影響。 v富集采集：是在采集過程中，同時將待測組是在采集過程中，同時將待測組 分富集，如吸附采樣中選擇合適的吸附材料，分富集，如吸附采樣中選擇合適的吸附材料， 在吸附的同時使待測材料在吸附材料上富集在吸附的同時使待測材料在吸附材料上富集 使用采集方法的注意事項 （1 1）采集的樣品應具有代表性，要注意采）采集的

7、樣品應具有代表性，要注意采 樣的時間、地點及采樣位置的選擇。樣的時間、地點及采樣位置的選擇。 （2 2）所有樣品都要采集雙份，一份分析樣）所有樣品都要采集雙份，一份分析樣 品，一份保存樣品，備復查時使用。品，一份保存樣品，備復查時使用。 （3 3）樣品的采集和儲存過程要作記錄，詳）樣品的采集和儲存過程要作記錄，詳 列采樣時間、地點、準確位置等。列采樣時間、地點、準確位置等。 （4 4）采集儲存中待測組分不應有）采集儲存中待測組分不應有損失損失或發(fā)生或發(fā)生化學變化學變 化化。 損失損失包括揮發(fā)、在儲存容器上的吸附等物理原因包括揮發(fā)、在儲存容器上的吸附等物理原因 化學變化化學變化包括被氧化、微生物

8、引起的分解、各包括被氧化、微生物引起的分解、各 組分間的化學反應等組分間的化學反應等 （5 5）避免樣品受到外界污染。）避免樣品受到外界污染。 （6 6）采集后要盡快進行分析樣品的制備和分析。）采集后要盡快進行分析樣品的制備和分析。 三、樣品預處理常用的方法 v高速離心高速離心 v過濾、超濾過濾、超濾 v選擇性沉淀選擇性沉淀 v萃取萃取 v索氏抽提索氏抽提 v衍生反應衍生反應 v新樣品處理技術新樣品處理技術加速溶劑萃?。铀偃軇┹腿。ˋSEASE） v濃縮樣品濃縮樣品 液液- -固萃取固萃取 / / 液液- -液萃取液萃取 固相萃取樣品小柱固相萃取樣品小柱 樣品預處理的過程 去除微粒 v過濾過

9、濾 過濾膜過濾膜/過濾裝置過濾裝置 v有機有機(0.5m)/無機無機(0.45m) v膜片可更換膜片可更換 一次性使用的膜一次性使用的膜 v使用方便簡單，交叉污染小使用方便簡單，交叉污染小 v有更小內徑，可用于微量樣品的處理有更小內徑，可用于微量樣品的處理 v高速離心高速離心 v大于：大于：10,000g 超超 濾濾 v機理機理 超濾是一種基于分子量分離的技術超濾是一種基于分子量分離的技術 v目的目的 根據(jù)分子量的不同把分子、細胞及病毒等分為不根據(jù)分子量的不同把分子、細胞及病毒等分為不 同的餾份同的餾份 除去小分子樣品中的大分子蛋白除去小分子樣品中的大分子蛋白 脫鹽脫鹽 選擇性沉淀選擇性沉淀

10、v常用于生化樣品中除蛋白常用于生化樣品中除蛋白 有機溶劑有機溶劑 v乙腈，甲醇乙腈，甲醇 強酸強酸 v三氯乙酸，過氯酸三氯乙酸，過氯酸 鹽鹽 v50% 硫酸銨硫酸銨 v10% TCA 樣品衍生樣品衍生 v提高檢測的靈敏度提高檢測的靈敏度 增加紫外基團以增強紫外檢測的靈敏度增加紫外基團以增強紫外檢測的靈敏度 增加熒光基團使樣品用高靈敏度熒光檢測器增加熒光基團使樣品用高靈敏度熒光檢測器 v改變分離的選擇性改變分離的選擇性 改變組份的基團，如：改變組份的基團，如： v變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離 v典型的例子典型的例子 氨基酸分析氨基酸分析 加速溶

11、劑萃?。铀偃軇┹腿。ˋSE） tASE ASE 是用溶劑對固體、半固體的樣品進行萃取的技是用溶劑對固體、半固體的樣品進行萃取的技 術術. . tASE ASE 的的原理原理是選擇合適的溶劑、通過增加溫度和壓是選擇合適的溶劑、通過增加溫度和壓 力來提高萃取過程的效率力來提高萃取過程的效率. . tASE ASE 可用來替代索氏提取、超聲萃取、手工振搖、可用來替代索氏提取、超聲萃取、手工振搖、 煮沸法和其他萃取方法煮沸法和其他萃取方法 三種不同型號的三種不同型號的ASE ASE100 ASE200 ASE300 ASE的突出優(yōu)點的突出優(yōu)點 v快速，快速，1515分鐘分鐘 v溶劑用量少溶劑用量少

12、v萃取效率高萃取效率高 v樣品基體影響小樣品基體影響小 v可同時選用四種溶劑萃取可同時選用四種溶劑萃取 v安全，全自動安全，全自動 vASEASE建立了環(huán)境建立了環(huán)境, , 藥物藥物, , 聚合物聚合物, , 食品食品, , 和化妝品和化妝品 工業(yè)的大量應用工業(yè)的大量應用 ASE工作流程工作流程 加溶劑加溶劑 時間時間 (min) 0.51 加樣品加樣品 靜態(tài)萃取靜態(tài)萃取 5 氮氣吹掃氮氣吹掃12 溶劑溶劑 泵泵 吹掃閥吹掃閥 爐體爐體 氮氣瓶氮氣瓶 靜態(tài)閥靜態(tài)閥 收集瓶收集瓶 萃取池萃取池 循環(huán)循環(huán) 加熱加熱 5 加壓加壓 萃取結束萃取結束 Total (min) 準備分析準備分析1218

13、新溶劑沖洗新溶劑沖洗0.5 食品安全評價中ASE的應用 水果和蔬菜中的農(nóng)藥水果和蔬菜中的農(nóng)藥 動物組織中的二動物組織中的二噁噁英和多氯聯(lián)苯英和多氯聯(lián)苯 糧食中的農(nóng)藥糧食中的農(nóng)藥 糧食中的毒枝菌素糧食中的毒枝菌素 熏肉中的多環(huán)芳烴熏肉中的多環(huán)芳烴 葡萄干中的殺真菌劑葡萄干中的殺真菌劑 咸肉中的硝酸鹽咸肉中的硝酸鹽/ /亞硝酸鹽亞硝酸鹽 一些正在發(fā)展的方法一些正在發(fā)展的方法 ASE 的應用領域的應用領域 環(huán)環(huán) 境境 農(nóng)業(yè)、食品農(nóng)業(yè)、食品 聚合物聚合物 制制 藥藥 濃縮樣品 v濃縮樣品的方法濃縮樣品的方法 萃取萃取/吹干吹干 沉淀沉淀/再溶解再溶解 色譜法色譜法 液固抽提液固抽提/固相萃取小柱固相萃

14、取小柱 固相萃?。ü滔噍腿。⊿PE）技術）技術 v固相萃取技術是基于同液相色譜同樣技術開發(fā)的產(chǎn)固相萃取技術是基于同液相色譜同樣技術開發(fā)的產(chǎn) 品，分離復雜樣品中的不同組份品，分離復雜樣品中的不同組份 v固相萃取技術（固相萃取技術（SPE）的重要性）的重要性 實驗室中實驗室中6080%的成本及工作量在樣品制備上的成本及工作量在樣品制備上 v加速樣品的制備時間加速樣品的制備時間 v降低樣品前處理的成本降低樣品前處理的成本 v提高分析的準確性及回收率提高分析的準確性及回收率 v更容易自動化更容易自動化 v減少樣品處理步驟減少樣品處理步驟 v降低對不穩(wěn)定樣品的影響降低對不穩(wěn)定樣品的影響 v提高安全性提高

15、安全性 SPE小柱 vSPE 小柱的應用領域小柱的應用領域 除去雜質及干擾組份除去雜質及干擾組份 把樣品分成不同極性的組進行分析把樣品分成不同極性的組進行分析 富集微量的組份富集微量的組份 vSPE 小柱的主要種類小柱的主要種類 反相反相 正相正相 離子交換離子交換 SPE小柱的種類小柱的種類 反相反相正相正相離子交換離子交換 固定相固定相非極性非極性極性極性帶電荷帶電荷 溶劑溶劑從極性到非極性從極性到非極性從非極性到極性從非極性到極性PH或離子強度（低到高）或離子強度（低到高） 根據(jù)根據(jù)SPESPE小柱的種類及樣品的性質，選洗脫小柱的種類及樣品的性質，選洗脫 強度不同的溶劑把樣品分開強度不同

16、的溶劑把樣品分開 讓樣品的各組份在固定相上吸附、解吸附，讓樣品的各組份在固定相上吸附、解吸附， 或不與固定相作用或不與固定相作用 第一步：第一步：讓所感興趣的樣品留在小柱，雜質通過小柱讓所感興趣的樣品留在小柱，雜質通過小柱 第二步：第二步：用不同極性的溶劑，使所感興趣的樣品通過小柱用不同極性的溶劑，使所感興趣的樣品通過小柱 各種SPE小柱（一） v正相正相 使用方法使用方法 v可先用可先用6 6到到1010倍柱體積的非極性溶劑平衡倍柱體積的非極性溶劑平衡 v加入樣品加入樣品 v用非極性溶劑洗脫不想要的組份用非極性溶劑洗脫不想要的組份 v用極性溶劑洗脫第一組感興趣的組份用極性溶劑洗脫第一組感興趣

17、的組份 v用極性更強的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份用極性更強的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份 在不同條件下，有些填料可以用于反相或離子交在不同條件下，有些填料可以用于反相或離子交 換，如換，如NH2 / CNNH2 / CN 確認回收率確認回收率 各種SPE小柱（二） v反相反相 使用方法使用方法 v可先用可先用6 6到到1010倍柱體積的甲醇或乙腈活化，再倍柱體積的甲醇或乙腈活化，再 用用6 6到到1010倍柱體積的水或緩沖液平衡，不要讓倍柱體積的水或緩沖液平衡，不要讓 小柱干了小柱干了 v樣品溶解在強一些極性的溶劑中樣品溶解在強一些極性的溶劑中 v加入樣品加入樣品 v用強極性溶劑洗脫不想要的組份

18、用強極性溶劑洗脫不想要的組份 v用極性弱些的溶劑洗脫第一組感興趣的組份用極性弱些的溶劑洗脫第一組感興趣的組份 v用極性更弱的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份用極性更弱的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份 確認回收率確認回收率 各種SPE小柱（三） v離子交換離子交換 使用方法使用方法 v可先用可先用6 6到到1010倍柱體積的去離子水或弱緩沖液倍柱體積的去離子水或弱緩沖液 平衡，平衡， v樣品溶解在去離子水或弱緩沖液中樣品溶解在去離子水或弱緩沖液中 v加入樣品加入樣品 v用弱緩沖液洗脫不想要的組份用弱緩沖液洗脫不想要的組份 v用強一些緩沖液（改變用強一些緩沖液（改變pHpH或離子強度）洗脫或離子強度）洗脫

19、第一組感興趣的組份第一組感興趣的組份 v用更強的緩沖液洗脫剩下的感興趣的組份用更強的緩沖液洗脫剩下的感興趣的組份 確認回收率確認回收率 SPE小柱的方法開發(fā) vSPESPE方法開發(fā)的幾個關鍵因素方法開發(fā)的幾個關鍵因素 文獻查閱文獻查閱 流速控制流速控制 v同色譜理論：以同色譜理論：以10ml/min10ml/min潤濕小柱，潤濕小柱，1 1 5ml/min5ml/min加載樣品加載樣品 v離子交換填料或固定相少于離子交換填料或固定相少于100mg100mg的小柱，用的小柱，用 更低的流速加載樣品更低的流速加載樣品 v以以1 15ml/min5ml/min流速洗脫樣品流速洗脫樣品 注意樣品本底的

20、不同注意樣品本底的不同 注意載荷量及加樣方式注意載荷量及加樣方式 四、生物樣品的制備技術 植物：花、葉、莖、根、果實植物：花、葉、莖、根、果實 體液：體液：尿、血液、唾液、胃液、膽汁等尿、血液、唾液、胃液、膽汁等 生物樣品生物樣品 動物動物 毛發(fā)毛發(fā) 肌肉肌肉 組織器官：組織器官：心、肝、肺、腦、胃、腎、胰腺等心、肝、肺、腦、胃、腎、胰腺等 微生物微生物 v生物樣品中需分析的組分： 植物體內植物體內營養(yǎng)成分、農(nóng)藥殘留等營養(yǎng)成分、農(nóng)藥殘留等 動物體內動物體內藥物及代謝產(chǎn)物、糖類及有關化藥物及代謝產(chǎn)物、糖類及有關化 合物、脂類、維生素、核甘、核甘酸及其衍合物、脂類、維生素、核甘、核甘酸及其衍 生物

21、、磷酸酯類化合物、固醇類化合物、氨生物、磷酸酯類化合物、固醇類化合物、氨 基酸、多肽、蛋白及其衍生物、某些生物大基酸、多肽、蛋白及其衍生物、某些生物大 分子分子 生物樣品中待測組分存在的形式及處理方法生物樣品中待測組分存在的形式及處理方法 v待測組分存在于體液或細胞外時：待測組分存在于體液或細胞外時： 用萃取的方法提取、濃縮制備樣品用萃取的方法提取、濃縮制備樣品 用沉淀的方法除去干擾組分（蛋白質、用沉淀的方法除去干擾組分（蛋白質、DNA、多、多 糖）糖） v 待測組分存在于生物細胞內：待測組分存在于生物細胞內： 破碎細胞，釋放待測組分，再用萃取或沉淀等方破碎細胞，釋放待測組分，再用萃取或沉淀等

22、方 法制備樣品法制備樣品 1.生物樣品的采集 采集生物樣品時采集生物樣品時注意事項： （1 1）注意樣品的代表性、典型性和適時性）注意樣品的代表性、典型性和適時性 （2 2）注意采樣部位的準確，特別是動物的組織器）注意采樣部位的準確，特別是動物的組織器 官，一定要認準官，一定要認準 （3 3）生物樣品一般都有一定的生物活性，樣品采）生物樣品一般都有一定的生物活性，樣品采 集后要立即處理集后要立即處理 （4 4）生物樣品的采集大部分可以在實驗室內進行，）生物樣品的采集大部分可以在實驗室內進行， 采樣工具要消毒，最好在無菌的條件下采樣采樣工具要消毒，最好在無菌的條件下采樣 2.細胞的破碎 v根據(jù)樣

23、品的不同，采用不同的破碎方法：根據(jù)樣品的不同，采用不同的破碎方法： v動物的胰臟、肝臟、腦組織一般比較柔軟，用動物的胰臟、肝臟、腦組織一般比較柔軟，用 普通的勻漿器研磨普通的勻漿器研磨 v肌肉及心臟組織較柔韌，要先絞碎再作成勻漿肌肉及心臟組織較柔韌，要先絞碎再作成勻漿 v植物組織用一般碎磨法植物組織用一般碎磨法 v含纖維較多組織則必須在搗碎器內破碎或加砂含纖維較多組織則必須在搗碎器內破碎或加砂 研磨研磨 v對具有堅韌細胞壁的微生物，常用自溶、冷熱對具有堅韌細胞壁的微生物，常用自溶、冷熱 交替、加砂研磨、超聲波和加壓處理等方法。交替、加砂研磨、超聲波和加壓處理等方法。 細胞破碎方法的分類 3.3

24、.生物大分子的提取生物大分子的提取 v提取生物大分子樣品時條件的選擇：提取生物大分子樣品時條件的選擇： （1 1）溶劑）溶劑 常用的溶劑有水、稀酸、稀堿、稀鹽等，也常用的溶劑有水、稀酸、稀堿、稀鹽等，也 可以采用不同比例的有機溶劑，如：乙醇、丙可以采用不同比例的有機溶劑，如：乙醇、丙 酮、氯仿、四氯化碳酮、氯仿、四氯化碳 選擇溶劑時要注意物質的溶解性，如極性物選擇溶劑時要注意物質的溶解性，如極性物 質易溶于極性溶劑；堿性物質易溶于酸性溶劑；質易溶于極性溶劑；堿性物質易溶于酸性溶劑； 溫度升高時一般溶解度相應增大；遠離等電點溫度升高時一般溶解度相應增大；遠離等電點 時溶解度增大時溶解度增大 （2

25、 2）pHpH值值 v 在穩(wěn)定的范圍內，在穩(wěn)定的范圍內，pHpH選擇在偏離選擇在偏離pIpI的兩側的兩側 v 注意測量注意測量pHpH值的準確性，誤差不應超過值的準確性，誤差不應超過0.10.1 （3 3）溫度）溫度 一般提取溫度在一般提取溫度在55以下以下 v 除此之外，還應考慮溶劑的離子強度、介除此之外，還應考慮溶劑的離子強度、介 電常數(shù)等對提取效果的影響電常數(shù)等對提取效果的影響 4.4.蛋白質的去除蛋白質的去除 （1）加熱法）加熱法 v 前提條件前提條件：待測組分熱穩(wěn)定性好，而其待測組分熱穩(wěn)定性好，而其 它易產(chǎn)生熱變性它易產(chǎn)生熱變性 v 該法最簡單，但只能除去熱變性蛋白該法最簡單，但只能

26、除去熱變性蛋白 4.蛋白質的去除（續(xù)） （2 2）鹽析法）鹽析法 v原理原理：利用不同蛋白質在高濃度的鹽溶液中溶解度利用不同蛋白質在高濃度的鹽溶液中溶解度 有不同程度的降低來沉淀去除蛋白質有不同程度的降低來沉淀去除蛋白質 v常用的中性鹽常用的中性鹽有：硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化有：硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化 鈉、磷酸鈉鈉、磷酸鈉 v影響鹽析的條件影響鹽析的條件 鹽的飽和濃度鹽的飽和濃度 pHpH的選擇的選擇 蛋白質的濃度蛋白質的濃度 溫度的影響溫度的影響 4.蛋白質的去除（續(xù)）蛋白質的去除（續(xù)） （3 3）有機溶劑沉淀法）有機溶劑沉淀法 v蛋白質的沉淀和溶解與溶劑的介電常數(shù)有關蛋白質的沉淀

27、和溶解與溶劑的介電常數(shù)有關 v常用的有機溶劑：乙醇、丙酮常用的有機溶劑：乙醇、丙酮 （4 4）等電點沉淀法）等電點沉淀法 v原理原理：利用蛋白質在等電點時溶解度最低，利用蛋白質在等電點時溶解度最低， 用酸、堿調用酸、堿調pHpH值，使蛋白沉淀出來值，使蛋白沉淀出來 v缺點：蛋白沉淀不完全缺點：蛋白沉淀不完全 4.蛋白質的去除（續(xù)） （5）膜分離法）膜分離法 v 膜分離技術膜分離技術：超濾、反滲透析、電滲析、微孔超濾、反滲透析、電滲析、微孔 過慮、氣體滲析、超精密過慮等過慮、氣體滲析、超精密過慮等 v 超濾法的特點超濾法的特點（與沉淀法比較）（與沉淀法比較） 適用于小量樣品適用于小量樣品 適用于

28、對酸堿不穩(wěn)定的樣品適用于對酸堿不穩(wěn)定的樣品 待測物質結合在膜上，影響回收率待測物質結合在膜上，影響回收率 v 超濾膜的材料超濾膜的材料：醋酸纖維素、聚酰胺、聚砜等醋酸纖維素、聚酰胺、聚砜等 4.蛋白質的去除（續(xù)） （6）凝膠層析）凝膠層析 v原理原理：利用分子大小不同的物質利用分子大小不同的物質 在流過凝膠在流過凝膠 固定相時的保留時間不同，分離待測的小分固定相時的保留時間不同，分離待測的小分 子化合物和大分子蛋白質。子化合物和大分子蛋白質。 （7）柱層析）柱層析 v原理原理：用能吸附蛋白質的材料裝填成小柱。：用能吸附蛋白質的材料裝填成小柱。 使含蛋白質的樣品流過，樣品中的蛋白質被使含蛋白質的

29、樣品流過，樣品中的蛋白質被 柱填料吸附，而待測組分則流出小柱。柱填料吸附，而待測組分則流出小柱。 4.蛋白質的去除（續(xù)）蛋白質的去除（續(xù)） （8 8）高速離心）高速離心 v原理原理：根據(jù)物質沉降系數(shù)、質量、浮力因子：根據(jù)物質沉降系數(shù)、質量、浮力因子 等的不同，應用強大的離心力使物質分離、等的不同，應用強大的離心力使物質分離、 濃縮、提純的方法。濃縮、提純的方法。 5.微透析技術 微透析技術：實質上是一種膜分離技術，它 利用膜透析原理，微量地對細胞液進行流動 性連續(xù)采樣的新型采樣和色譜樣品制備技術。 6.應用應用 例：用HPLC法法測定血清和尿中厚樸酚 與和厚樸酚時樣品的制備 厚樸酚、和厚樸酚是

30、木蘭科植物厚樸干 皮、根皮、枝皮的主要成分，作用是抗菌、 抑制胃潰瘍和防止應激性胃功能障礙、抑制 血小板聚集、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)和降血壓等 作用。 6.應用(續(xù)) 用于用于HPLCHPLC法測定的樣品制備方法：法測定的樣品制備方法： v 0.5 ml 0.5 ml 血清或血清或1 ml 1 ml 尿尿 分別加入分別加入0.5 ml 0.5 ml 甲醇，離心甲醇，離心 取上清液取上清液0.5 ml0.5 ml 加入加入 0.1 mol/l 0.1 mol/l 的冰醋酸的冰醋酸 0.1 ml 0.1 ml ， 搖勻；搖勻； 用乙酸乙酯和乙醚混合液（用乙酸乙酯和乙醚混合液（ v/vv/v為為1 1：1

31、 1） 2 ml 2 ml 萃取萃取 離心后，取離心后，取1 ml 1 ml 有機相置尖底試管有機相置尖底試管 在在45 45 水浴中用氮氣流吹干，水浴中用氮氣流吹干， 加入加入HPLCHPLC用流動相用流動相 0.1 ml0.1 ml 分析樣品分析樣品 五、導致待測物損失的因素導致待測物損失的因素 v吸附：吸附： 原因之一：原因之一：玻璃表面或橡膠塞會吸附藥物，特玻璃表面或橡膠塞會吸附藥物，特 別是脂肪胺類及含硫化合物。別是脂肪胺類及含硫化合物。 解決方法：解決方法： 可采用硅烷化減少玻璃表面的吸附性可采用硅烷化減少玻璃表面的吸附性 非極性提取溶劑中加入少量極性溶劑可減少非極性提取溶劑中加入

32、少量極性溶劑可減少 器皿對藥物的吸附。器皿對藥物的吸附。 原因之二：原因之二：血樣中紅血球和纖維蛋白元凝塊的形血樣中紅血球和纖維蛋白元凝塊的形 成，常能引起待測物的共沉淀。成，常能引起待測物的共沉淀。 解決方法：解決方法：將全血樣品加入緩沖液后再行提取。將全血樣品加入緩沖液后再行提取。 這樣血球散開，藥物可從血球表面解吸，以減少這樣血球散開，藥物可從血球表面解吸，以減少 共沉淀的損失。共沉淀的損失。 緩沖液的一定離子強度，可蛋白質變性時形成疏緩沖液的一定離子強度，可蛋白質變性時形成疏 松的絮狀物，這樣可減少藥物的物理性滯留和共沉松的絮狀物，這樣可減少藥物的物理性滯留和共沉 淀的損失。淀的損失。

33、 v化學降解：化學降解： 原因：原因： 樣品的化學和生物學不穩(wěn)定性常引起化學分解樣品的化學和生物學不穩(wěn)定性常引起化學分解 光化學及熱穩(wěn)定性（尤其在凈化步驟中強酸、強光化學及熱穩(wěn)定性（尤其在凈化步驟中強酸、強 堿的中和所產(chǎn)生的熱）引起的損失，也應加注意。堿的中和所產(chǎn)生的熱）引起的損失，也應加注意。 解決方法：解決方法：盡量采用溫和條件制備樣品，經(jīng)免引起盡量采用溫和條件制備樣品，經(jīng)免引起 藥物的部分分解、開環(huán)等情況發(fā)生，有的樣品尚需藥物的部分分解、開環(huán)等情況發(fā)生，有的樣品尚需 避光操作避光操作 v衍生化反應：衍生化反應： 由于不完全反應，待測樣品僅部分轉化為所由于不完全反應，待測樣品僅部分轉化為所 需的產(chǎn)物或形成副