3.1-NA_tech-ISOLATION

1、 第三章第三章核酸研究技術(shù)核酸研究技術(shù)1 u 核酸電泳技術(shù)核酸電泳技術(shù)u核酸的分離和純化技術(shù)核酸的分離和純化技術(shù)u DNA限制酶切和連接技術(shù)限制酶切和連接技術(shù)u遺傳轉(zhuǎn)化遺傳轉(zhuǎn)化u PCR技術(shù)技術(shù)u 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù) u 核酸序列的測定核酸序列的測定2第一節(jié)第一節(jié)核酸的分離和純化核酸的分離和純化31、供體的核酸分離、供體的核酸分離 供體細(xì)胞供體細(xì)胞/組織組織 收集收集(菌體菌體)細(xì)胞細(xì)胞 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 分離分離總總DNA 分離細(xì)胞器分離細(xì)胞器 分離分離總總RNA 分離分離細(xì)胞器細(xì)胞器DNA RNA poly(A)RNA 特異性特異性RNA 染色體染色體DNA(組建基因組文庫組建基因組

2、文庫)一一.一般程序一般程序4 載體載體DNA 感染或轉(zhuǎn)染細(xì)胞（病毒型）感染或轉(zhuǎn)染細(xì)胞（病毒型） 轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞（質(zhì)粒型）轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞（質(zhì)粒型） 分離病毒顆粒分離病毒顆粒 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、收集菌體培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、收集菌體 病毒載體病毒載體DNA分離與純化分離與純化 破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA分離與純化分離與純化 3. DNA片段的分離片段的分離 DNA 限制酶切限制酶切 凝膠電泳分離凝膠電泳分離 特定特定DNA 片段的回收片段的回收2.載體載體DNA分離分離5 1) 凝膠電泳凝膠電泳: 2) 光密度值測定光密度值測定: A260/A280=1.8 3) 限制酶切分析限制酶切分析:4. 質(zhì)量評(píng)估

3、質(zhì)量評(píng)估6 1. 酶法酶法 利用某些細(xì)胞壁裂解酶使細(xì)胞變?yōu)樵|(zhì)體，然后加去垢劑使利用某些細(xì)胞壁裂解酶使細(xì)胞變?yōu)樵|(zhì)體，然后加去垢劑使原生質(zhì)體裂解。原生質(zhì)體裂解。 1) 細(xì)菌：溶菌酶細(xì)菌：溶菌酶 2) 酵母：蝸牛酶、酵母：蝸牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase 等等 3) 絲狀真菌：絲狀真菌：Novozyme234、溶壁酶、纖維素酶、溶壁酶、纖維素酶 4) 植物細(xì)胞：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶植物細(xì)胞：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶 酶法裂解時(shí)要注意細(xì)胞的生長條件和生長時(shí)間，反應(yīng)時(shí)盡可能酶法裂解時(shí)要注意細(xì)胞的生長條件和生長時(shí)間，反應(yīng)時(shí)盡可能滿足酶的最佳反應(yīng)條件。

4、滿足酶的最佳反應(yīng)條件。二二.細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解7 1) 壓力剪切法：壓力剪切法：French壓力機(jī)，酵母細(xì)胞，細(xì)菌（芽孢和壓力機(jī)，酵母細(xì)胞，細(xì)菌（芽孢和G+球球菌除外）菌除外） 2) 射擊破碎法：射擊破碎法：Braun破碎機(jī)，攪切器（破碎機(jī)，攪切器（blender），混合器），混合器（mixer），），0.1-0.45mm玻璃球玻璃球 3) 固體研磨法：將待破碎細(xì)胞與玻璃球（固體研磨法：將待破碎細(xì)胞與玻璃球（0.10.45mm）同時(shí)致）同時(shí)致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末冷，在未融熔前用研杵磨成粉末 4) 反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法 2. 機(jī)械法機(jī)械法81.供體供體DNA的分離與純化的分離與純化 要求：

5、盡可能地保持其高分子量，無其它污染物。要求：盡可能地保持其高分子量，無其它污染物。 1) 基因組大小基因組大?。喝旧w染色體細(xì)菌細(xì)菌 33004200kb酵母酵母 15,000 kb果蠅果蠅 1.28x105 kb人人 3x106 kb植物植物 2x1051x108 kb 天花病毒天花病毒 288 kb痘病毒痘病毒 196 kb質(zhì)體質(zhì)體 幾幾100以上以上kb線粒體線粒體 藻類藻類 線狀線狀 15 kb酵母酵母 環(huán)狀環(huán)狀 1978 kb植物植物 環(huán)狀環(huán)狀 100150 kb動(dòng)物動(dòng)物(扁蟲到人扁蟲到人)環(huán)狀環(huán)狀 1518 kb錐蟲錐蟲 網(wǎng)狀網(wǎng)狀 6000 kb(幼體幼體)短膜蟲短膜蟲 網(wǎng)狀網(wǎng)狀

6、30,000 kb(幼體幼體)三三. DNA的分離與純化的分離與純化9 細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解離心去除細(xì)胞碎片離心去除細(xì)胞碎片 苯酚抽提苯酚抽提 乙醇沉淀乙醇沉淀 RNA去除去除(如有必要如有必要, 可用可用CsCl密度密度梯度離心進(jìn)一步純化梯度離心進(jìn)一步純化DNA)裂解依賴于細(xì)胞特點(diǎn)裂解依賴于細(xì)胞特點(diǎn),如酶法如酶法,機(jī)械破碎等機(jī)械破碎等.此外在抽提此外在抽提緩沖液中通常加入去垢劑等緩沖液中通常加入去垢劑等上清液用水飽和苯酚上清液用水飽和苯酚/氯仿抽提氯仿抽提23次次, 再用氯仿抽至再用氯仿抽至界面無蛋白變性物界面無蛋白變性物上層液相用兩倍體積冷乙醇沉淀上層液相用兩倍體積冷乙醇沉淀, 沉淀物用沉淀物

7、用70%冷乙醇洗滌冷乙醇洗滌,干燥干燥加入加入RNAase處理除去處理除去RNA2) DNA分離純化過程分離純化過程10 在在DNA上清液中加入上清液中加入固體固體CsCl與與EtBr溶液溶液, 超超速離心速離心(45,000rpm)1624 h, 穿孔取出穿孔取出DNA(320nm), 最后用異丙醇抽提溴乙錠最后用異丙醇抽提溴乙錠,透析去除透析去除 CsCl, 乙醇沉淀乙醇沉淀 DNA, 離心離心,洗滌洗滌,干燥干燥. *CsCl法操作步驟少法操作步驟少, 分離分離DNA分子量大分子量大, 耗財(cái)多耗財(cái)多,且需超速離心機(jī)且需超速離心機(jī).。 苯酚法耗時(shí)少苯酚法耗時(shí)少, 不需昂貴儀器不需昂貴儀器,

8、 但操作步驟多但操作步驟多, 易使易使DNA分子斷裂。分子斷裂。 若小若小 心操作心操作, 所獲所獲DNA亦符合要求亦符合要求.*CsCl密度梯度離心密度梯度離心11 植物組織植物組織用核分離緩沖液勻漿用核分離緩沖液勻漿, 過濾過濾, 離心離心(2000g, 10,4) 核緩沖液使核裂解核緩沖液使核裂解(含含0.5%Triton X-100), 抽提抽提DNA 植物組織植物組織用細(xì)胞器緩沖液勻漿用細(xì)胞器緩沖液勻漿, 離心離心(100g, 10,4)除去細(xì)胞除去細(xì)胞核核, 離心離心(1800g, 10,4)分離葉綠體分離葉綠體; 離心離心(10,000g, 10,4)分離線粒體分離線粒體, DN

9、ase除去細(xì)胞器外除去細(xì)胞器外DNA, 加入加入EDTA使使DNase失活失活 , 純化細(xì)胞器純化細(xì)胞器, 細(xì)胞器裂解細(xì)胞器裂解, 提取提取DNA 3) 細(xì)胞器細(xì)胞器DNA的分離的分離122. 載體載體DNA的分離與純化的分離與純化 1) 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體DNA的分離的分離 關(guān)鍵：關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒如何使質(zhì)粒DNA與宿主染色體與宿主染色體DNA分開分開 原理：原理：質(zhì)粒質(zhì)粒DNA比染色體比染色體DNA 小得多小得多, ,在在DNA抽提過程中，染抽提過程中，染色體色體DNA斷裂成小片段斷裂成小片段(線狀線狀), 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋構(gòu)型仍保持超螺旋構(gòu)型 方法：方法：. 超速離心：利用兩種超速

10、離心：利用兩種DNA分子的大小和空間構(gòu)型分子的大小和空間構(gòu)型 . 變性法：在變性條件下使染色體變性法：在變性條件下使染色體DNA變?yōu)閱捂溩優(yōu)閱捂? 而質(zhì)而質(zhì)粒粒DNA仍保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)仍保持環(huán)狀結(jié)構(gòu), 當(dāng)變性條件發(fā)生迅速變化時(shí)當(dāng)變性條件發(fā)生迅速變化時(shí), 前者仍不能前者仍不能復(fù)性復(fù)性, 而后者又可回復(fù)到天然構(gòu)型而后者又可回復(fù)到天然構(gòu)型. (變性條件可采用加熱煮沸法變性條件可采用加熱煮沸法或堿變性法或堿變性法)13 2) 噬菌體載體噬菌體載體DNA的分離的分離 純凈病毒顆粒純凈病毒顆粒, 病毒載體病毒載體DNA M13mp載體可采用質(zhì)粒載體可采用質(zhì)粒DNA的分離方法的分離方法 質(zhì)質(zhì) 粒粒DNA 的的

11、分分 離離14 1. 制備制備RNA的關(guān)鍵的關(guān)鍵防止內(nèi)外源防止內(nèi)外源RNase的作用的作用 1) RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿的特點(diǎn)：抗酸抗堿,具很廣具很廣pH作用范圍作用范圍; 抗高溫嚴(yán)寒抗高溫嚴(yán)寒(065均具活性均具活性);抗變性劑抗變性劑 2) 解決辦法：外源解決辦法：外源RNase高溫高溫,焦磷酸二乙酯焦磷酸二乙酯(DEPC)處理所有溶處理所有溶液液(TrisHCl除外除外)和器皿和器皿, 操作者帶手套操作者帶手套. 內(nèi)源內(nèi)源RNase高溫抽提高溫抽提,強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑,RNase抑制劑抑制劑,蛋白酶蛋白酶K等等. 四四. RNA的分離與純化的分離與純化15 根據(jù)所用蛋白質(zhì)變

12、性劑種類不一樣分為以下三種制備方法：根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類不一樣分為以下三種制備方法： 1）熱苯酚抽提法）熱苯酚抽提法 2）胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍）胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍 3）LiCl/尿素法尿素法其中以胍鹽法最好其中以胍鹽法最好, ,對(duì)于從那些對(duì)于從那些RNase含量很高的組織（胰臟）中含量很高的組織（胰臟）中提取提取RNA特別有效特別有效, ,可使可使RNase迅速變性迅速變性, ,制備的制備的RNA有較高翻譯活有較高翻譯活性性. .在在RNA制備中制備中, ,細(xì)胞破碎與蛋白質(zhì)變性是同步進(jìn)行的細(xì)胞破碎與蛋白質(zhì)變性是同步進(jìn)行的. .2. 總總RNA的制備的制備16 1) 多聚核

13、糖體的分離多聚核糖體的分離 超速離心法（超速離心法（30-40萬萬g，離心，離心2-3 h） 鎂鹽沉淀法（鎂鹽沉淀法（0.1 M Mg+） 分級(jí)分離法分級(jí)分離法分離特異性多聚核糖體分離特異性多聚核糖體 3.多聚核糖體多聚核糖體RNA的制備的制備17 i. 結(jié)合與游離核糖體的分離，這種方法可避免溶酶體破裂。結(jié)合與游離核糖體的分離，這種方法可避免溶酶體破裂。 ii. 核糖體大小分級(jí)分離，利用連續(xù)密度梯度分離特大和特小的核糖體大小分級(jí)分離，利用連續(xù)密度梯度分離特大和特小的 多聚核糖體多聚核糖體 iii.核糖體免疫沉淀法核糖體免疫沉淀法 (可分離到含量僅為可分離到含量僅為1%的的mRNA, 依賴于依賴

14、于抗體純度等抗體純度等) *直接免疫沉淀法直接免疫沉淀法 新生肽鏈新生肽鏈+抗體抗體 蔗糖密度梯度離心蔗糖密度梯度離心 * * *間接免疫沉淀法間接免疫沉淀法 新生肽鏈新生肽鏈+ +抗體抗體+ +抗抗- -抗體（二抗）抗體（二抗） 不不 可可溶復(fù)合物溶復(fù)合物 離心分離離心分離 *免疫親和層析法免疫親和層析法 新生肽鏈新生肽鏈-抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物 不溶交聯(lián)抗原基不溶交聯(lián)抗原基 質(zhì)親和層析柱吸附質(zhì)親和層析柱吸附 洗脫洗脫182) 多聚核糖體多聚核糖體RNA的分離的分離純化多聚核糖體純化多聚核糖體+SDS 蔗糖密度梯度離心或蛋白酶蔗糖密度梯度離心或蛋白酶K-苯酚抽提苯酚抽提 19 1) 分子量大小

15、分級(jí)分離分子量大小分級(jí)分離 i. 蔗糖密度梯度離心蔗糖密度梯度離心 ii. 凝膠電泳凝膠電泳 2) 核酸序列分級(jí)分離核酸序列分級(jí)分離 i. 分子雜交法：適用于同源性很高的分子雜交法：適用于同源性很高的RNA的分離的分離 DNA分子變性分子變性, 結(jié)合到結(jié)合到NCF, RNADNA雜交雜交, 洗滌洗滌, 洗膜洗膜, 乙醇沉淀乙醇沉淀 ii. 親和層析法：親和層析法： 低聚低聚dT纖維素纖維素: 用于用于poly(A)較長的較長的mRNA； 多聚多聚U瓊脂糖瓊脂糖: 用于用于poly(A)較短的較短的mRNA（20A） RNA進(jìn)樣吸附進(jìn)樣吸附, 洗滌洗滌, 洗脫洗脫, 收集收集260 nm處吸收峰

16、樣品處吸收峰樣品, 乙醇沉淀乙醇沉淀 iii. 無無poly(A) mRNA的分離的分離 純化多聚核糖體純化多聚核糖體, 核糖體亞基核糖體亞基+mRNP, mRNP, 蛋白酶蛋白酶K , mRNA, 低聚（低聚（dT）纖維素層析纖維素層析, 洗出液洗出液, 乙醇沉淀（無多聚乙醇沉淀（無多聚A mRNA）4. RNA的分級(jí)分離的分級(jí)分離20 1) 光密度值測定法光密度值測定法 A260/A280=2.0 2) 凝膠電泳凝膠電泳 3) 體外蛋白質(zhì)翻譯體外蛋白質(zhì)翻譯 5. RNA的質(zhì)量評(píng)估方法的質(zhì)量評(píng)估方法21細(xì)胞裂解物細(xì)胞裂解物 胍鹽法胍鹽法 總總RNA 分子雜交法分子雜交法 特異特異RNA分子分

17、子 熱苯酚法熱苯酚法 凝膠電泳凝膠電泳 圍圍RNA大小分級(jí)分離大小分級(jí)分離 大小范大小范蔗糖密度蔗糖密度梯度離心梯度離心 一定一定 LiCl/ 核酸序列核酸序列 尿素法尿素法離心離心 分級(jí)分離分級(jí)分離 親和層析法親和層析法 poly（A）RNA分子分子 高速離心法高速離心法 全部多聚核糖體全部多聚核糖體 上清液上清液 鎂鹽沉淀法鎂鹽沉淀法蔗糖密度梯度離心蔗糖密度梯度離心結(jié)合與結(jié)合與游離多聚核糖體游離多聚核糖體分級(jí)分離法分級(jí)分離法 蔗糖連續(xù)密度蔗糖連續(xù)密度一定范圍大小核糖體一定范圍大小核糖體多聚核糖體多聚核糖體RNA免疫沉淀法免疫沉淀法特異性多聚核糖體特異性多聚核糖體 22 五五. 核酸的試劑盒

18、分離與純化核酸的試劑盒分離與純化 GeneBallTM Genome Preparation Kit使用經(jīng)特殊處理的小珠GeneBall，可以從全血或培養(yǎng)細(xì)胞中簡便、快速提取高純度的基因組DNA。具有以下特點(diǎn)：1. 操作快速、簡便。GeneBall直徑為6.5 mm，DNA和GeneBall結(jié)合后，可以很容易利用重力和液體分離，整體操作只需在一個(gè)離心管中進(jìn)行。從 1 ml全血中抽提基因組DNA只需約1小時(shí)左右。2. 高性能。一次可以處理1 ml的全血或106的培養(yǎng)細(xì)胞。3. 收率高、完整性好、純度高。從1 ml的EDTA處理全血中可以提取3060 mg的完整性較好的基因組DNA，DNA的OD2

19、60/OD280=1.82.1。4. 使用安全。無需使用有害溶劑。23Blood Genome DNA Extraction Kit試劑盒含有GenTLE Solution I、II、III三種溶液。GenTLE Solution I中的陽離子表面活性劑在破壞血細(xì)胞的同時(shí)，與核酸形成電中性復(fù)合體。將該復(fù)合體離心收集并用GenTLE Solution II 清洗后，在沉淀中加入GenTLE Solution III，將DNA分離出來后再加入異丙醇將DNA沉淀回收。整個(gè)操作只需40分鐘左右，便可提取高純度DNA，操作十分簡單方便。由于GenTLE Solution I具有破壞菌體和病毒粒子的作用，

20、對(duì)于處理有可能發(fā)生病源菌等污染的樣品非常有利。適用于尚未凝固的全血，又適用于經(jīng)各種抗凝劑處理過的全血，無論經(jīng)過哪種抗凝劑處理，每100 ml人的血液都能得到1 mg以上的 DNA，其純度A260/280可達(dá)1.8 2.0。提取的DNA可用于PCR擴(kuò)增和限制酶酶切等。24血細(xì)胞血細(xì)胞/培養(yǎng)細(xì)胞基因組培養(yǎng)細(xì)胞基因組DNA小量純化試劑盒小量純化試劑盒TaKaRa MiniBEST Blood & Cultured Cell Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2.0用于血細(xì)胞/動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞基因組DNA小量純化。試劑盒采用了獨(dú)特的細(xì)胞裂解系統(tǒng)，由細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞釋放基因組

21、DNA，然后使用特殊的相分離法除去雜質(zhì)，再結(jié)合DNA制備膜技術(shù)純化基因組DNA。具有高效、快速、方便之特點(diǎn)，全套操作只需1小時(shí)?？蓮?0 200 ml的全血（含抗凝劑）或從1103 5106的培養(yǎng)細(xì)胞中純化得到1 10 mg的高純度基因組DNA（OD260/OD280= 1.8 2.0)。此基因組DNA可用于各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。25細(xì)菌基因組細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒小量純化試劑盒TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2.0 用于細(xì)菌基因組DNA小量純化。采用獨(dú)特的細(xì)胞裂解系統(tǒng)，由細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞釋放基因組DN

22、A，然后使用特殊的相分離法除去雜質(zhì)，再結(jié)合DNA制備膜技術(shù)純化細(xì)菌基因組DNA。具有高效、快速、方便之特點(diǎn)，全套操作只需1小時(shí)。可從 1 4 ml過夜培養(yǎng)菌中得到1 10 mg高純度基因組DNA（OD260/OD280 = 1.8 2.0)?？捎糜诟鞣N分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。26動(dòng)物組織基因組動(dòng)物組織基因組DNA小量純化試劑盒小量純化試劑盒TaKaRa MiniBEST Animal Tissue Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2.0用于動(dòng)物組織基因組DNA小量純化?？蓮? 20 mg動(dòng)物組織中純化得到1 10 mg的高純度基因組DNA（OD260/OD280= 1.

23、8 2.0)。此基因組DNA可用于PCR反應(yīng)、Southern雜交以及RAPD、AFLP、RFLP分析等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。 27植物基因組植物基因組DNA小量純化試劑盒小量純化試劑盒TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2.0用于植物基因組DNA小量純化?？蓮?10 150 mg植物組織或1103 1107的植物培養(yǎng)細(xì)胞中純化得到1 10 mg的高純度基因組DNA（OD260/OD280=1.8 2.0)。此基因組DNA可用于PCR反應(yīng)、Southern雜交以及RAPD、AFLP、RFLP分析等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。28Ca

24、trimox-14TM RNA Isolation Kit Ver. 2.11Catrimox-14TM是一種陽離子表面活性劑，有抑制血液中RNase的作用，能從少量血液中簡單、高效地提取總RNA。Catrimox-14TM也適用于動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中的總RNA的提取。Catrimox-14TM能在破壞血細(xì)胞和其他動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞的同時(shí)，和核酸形成電中性復(fù)合體，很容易從血液和其他動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中提取RNA。將少量血液直接與Catrimox-14TM混合、離心收集，再使用氯化鋰法或異硫氰酸胍法，便能高效地提取RNA。Catrimox-14TM同時(shí)具有破壞菌體和病毒粒子的作用，這對(duì)提取被病原菌等污染的樣品時(shí)非

25、常有利。從培養(yǎng)細(xì)胞中提取的RNA的純度為OD260/OD2802.0；進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)時(shí)也顯示出極高的純度。Catrimox-14TM特別適用于從RNA含量低于100 mg的少量樣品中提取RNA。29病毒顆粒高效濃縮試劑盒病毒顆粒高效濃縮試劑盒TaKaRa High Efficiency Virion Enrichment Kit使用Solution A、B、C三種溶液，可以方便快速地從數(shù)毫升乃至數(shù)十毫升的各種臨床樣本中高效濃縮病毒顆 粒 ， 全 套 操 作 僅 需 3 0 分 鐘 。Solution A可對(duì)溶液中的病毒顆粒進(jìn)行鹽析，加入Solution B后液體形成相分離，此時(shí)病毒顆粒與樣本中的蛋白質(zhì)一起將會(huì)形成凝集物集中于溶液的上下相間，加入Solution C消除相分離后離心分離收集病毒凝集物。由于濃縮病毒所使用的試劑可以滅活病毒和抑制RNase活性， 所以能夠避免病毒污染，防止RNA的降解。30病毒病毒RNA/DNA快速