高效液相色譜法簡(jiǎn)介

1、高效液相色譜法高效液相色譜法 High-Performance Liquid Chromatography，HPLC主要內(nèi)容主要內(nèi)容l第一節(jié)第一節(jié) 概述概述l第二節(jié)第二節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀l第三節(jié)第三節(jié) 高效液相色譜類型高效液相色譜類型l第四節(jié)第四節(jié) 固定相和流動(dòng)相的選擇固定相和流動(dòng)相的選擇l第五節(jié)第五節(jié) 圖形結(jié)果分析及其應(yīng)用圖形結(jié)果分析及其應(yīng)用第一節(jié)第一節(jié) 概述概述l 高效液相色譜（高效液相色譜（HPLC）也叫高壓液相色也叫高壓液相色譜（譜（high pressure liquid chromatography）、高速）、高速液相色譜（液相色譜（high speed liquid

2、 chromatography）、）、高分離度液相色譜（高分離度液相色譜（high resolution liquid chromatography）等。）等。l 高效液相色譜法高效液相色譜法是以液體作為流動(dòng)相的色譜是以液體作為流動(dòng)相的色譜法，它是利用樣品中各組分在色譜柱中固定相和流法，它是利用樣品中各組分在色譜柱中固定相和流動(dòng)相相間分配系數(shù)或吸附系數(shù)的差異，將各組分分動(dòng)相相間分配系數(shù)或吸附系數(shù)的差異，將各組分分離后進(jìn)行定性、定量分析。離后進(jìn)行定性、定量分析。發(fā)展歷史l 2020世紀(jì)初，俄國(guó)植物學(xué)家茨維特提出經(jīng)典液相色世紀(jì)初，俄國(guó)植物學(xué)家茨維特提出經(jīng)典液相色譜法。譜法。l 19601960年代

3、，由于氣相色譜對(duì)高沸點(diǎn)有機(jī)物分析的年代，由于氣相色譜對(duì)高沸點(diǎn)有機(jī)物分析的局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。典液相色譜。l 19601960年代末，科克蘭（年代末，科克蘭（KirklandKirkland）、哈伯、荷瓦）、哈伯、荷瓦斯斯(Horvath)(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開(kāi)發(fā)了世界、莆黑斯、里普斯克等人開(kāi)發(fā)了世界上第一臺(tái)高效液相色譜儀，開(kāi)啟了高效液相色譜上第一臺(tái)高效液相色譜儀，開(kāi)啟了高效液相色譜的時(shí)代。的時(shí)代。l 2020世紀(jì)世紀(jì)

4、7070年代，高效液相色譜法開(kāi)始廣泛應(yīng)用。年代，高效液相色譜法開(kāi)始廣泛應(yīng)用。高效液相色譜的特點(diǎn)高效液相色譜的特點(diǎn)l高壓高壓壓力可達(dá)150300 kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。 l高速高速流速為0.110.0 mL/min。 l高效高效塔板數(shù)可達(dá)5000/米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。 l高靈敏度高靈敏度紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。 第二節(jié)第二節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀高效液相色譜儀基本裝置高效液相色譜儀基本裝置流動(dòng)相流動(dòng)相進(jìn)樣閥進(jìn)樣閥注入樣品液注入樣品液色譜柱色譜柱檢測(cè)器檢測(cè)器色譜處理機(jī)色譜處理機(jī)高壓泵高壓泵流出液流出液高效液相色譜

5、儀的組成高效液相色譜儀的組成l 高效液相色譜儀一般可分為高效液相色譜儀一般可分為四四個(gè)主要個(gè)主要部分：部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。此外還配有。此外還配有輔助裝置輔助裝置：如：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣、餾分收集及數(shù)據(jù)處梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣、餾分收集及數(shù)據(jù)處理等。理等。1 1）貯液器：）貯液器：1-2L1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過(guò)濾器的玻璃瓶，配有溶劑過(guò)濾器( (NiNi合金合金) )，其孔很小約，其孔很小約2 2 m m，可防止顆粒物進(jìn)，可防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。入泵內(nèi)。2 2）脫氣）脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通超聲波脫氣或真空加熱

6、脫氣。溶劑通過(guò)脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分子量小的氣體透過(guò)脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分子量小的氣體透過(guò)膜從溶劑中除去（過(guò)膜從溶劑中除去（氣泡會(huì)影響檢測(cè)氣泡會(huì)影響檢測(cè)）。）。1、高壓輸液系統(tǒng)、高壓輸液系統(tǒng)3 3）高壓泵）高壓泵注射型泵注射型泵-輸出精確，無(wú)脈動(dòng)，需更換溶劑而中斷工作。輸出精確，無(wú)脈動(dòng)，需更換溶劑而中斷工作。恒流泵恒流泵往復(fù)型泵往復(fù)型泵-造價(jià)低廉，溶劑更換方便，但存在脈動(dòng)。造價(jià)低廉，溶劑更換方便，但存在脈動(dòng)。高壓泵按排液性質(zhì)可分為：恒壓型和恒流型。高壓泵按排液性質(zhì)可分為：恒壓型和恒流型。對(duì)流量變化敏感的檢測(cè)器會(huì)有噪聲對(duì)流量變化敏感的檢測(cè)器會(huì)有噪聲干擾，此時(shí)可連接一脈動(dòng)阻尼器。干擾，此時(shí)可連

7、接一脈動(dòng)阻尼器。恒壓泵恒壓泵-壓力恒定，但流量不恒定（現(xiàn)在已經(jīng)壓力恒定，但流量不恒定（現(xiàn)在已經(jīng)較少使用較少使用）。）。（使用較多）（使用較多） 輸液泵應(yīng)具備如下性能：輸液泵應(yīng)具備如下性能：流量穩(wěn)定流量范圍寬輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150300 kg/cm2；液缸容積??；密封性能好，耐腐蝕。輸液泵操作注意事項(xiàng)：輸液泵操作注意事項(xiàng)：l 防止固體微粒進(jìn)入泵體防止固體微粒進(jìn)入泵體l 流動(dòng)相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)流動(dòng)相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)l 防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完l 不超過(guò)規(guī)定的最高壓力不超過(guò)規(guī)定的最高壓力l 流動(dòng)相一般應(yīng)該先脫氣流動(dòng)相一般應(yīng)該先脫氣l HPLC有等強(qiáng)度(isoc

8、ratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，提高檢測(cè)靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。 4）梯度淋洗裝置：）梯度淋洗裝置：l梯度洗脫有兩種實(shí)現(xiàn)方式梯度洗脫有兩種實(shí)現(xiàn)方式：l 一是高壓梯度（內(nèi)梯度），一是高壓梯度（內(nèi)梯度），利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合均勻后再進(jìn)

9、入色譜柱。l 二是低壓梯度（外梯度），二是低壓梯度（外梯度），通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例抽入一臺(tái)高壓泵中混合，隨后打入色譜柱。高壓梯度高壓梯度低壓梯度低壓梯度2 2、進(jìn)樣系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)l 早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器，裝在色譜柱入口處。現(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器。進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。lHPLCHPLC進(jìn)樣方式可分為：進(jìn)樣方式可分為：l （1）隔膜進(jìn)樣l （2）停流進(jìn)樣l （3）自動(dòng)進(jìn)樣l （4）閥進(jìn)樣l （1）隔膜進(jìn)樣）隔膜進(jìn)樣。使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡(jiǎn)單、使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡(jiǎn)單、死體積

10、小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差，常規(guī)分析使用受死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差，常規(guī)分析使用受到局限。到局限。l （2）停流進(jìn)樣）停流進(jìn)樣。可避免在高壓下進(jìn)樣。但在?？杀苊庠诟邏合逻M(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動(dòng)時(shí)往往會(huì)中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動(dòng)時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)出現(xiàn)“鬼峰鬼峰”；另一缺點(diǎn)是保留時(shí)間不準(zhǔn)。在以峰的；另一缺點(diǎn)是保留時(shí)間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號(hào)控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。始末信號(hào)控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。l （3）自動(dòng)進(jìn)樣）自動(dòng)進(jìn)樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。用于大量樣品的常規(guī)分析。l （4）閥進(jìn)樣）閥進(jìn)樣。一般一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥分析常用六通進(jìn)樣

11、閥，其關(guān)，其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣（約下降（約下降510%左右），但耐高壓（左右），但耐高壓（3540MPa），進(jìn)樣），進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（0.5%），操作方便。），操作方便。圖圖 六通進(jìn)樣閥六通進(jìn)樣閥 l 分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。l 色譜柱色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成。其內(nèi)徑為26mm，柱長(zhǎng)為1050cm，

12、柱形多為直形，內(nèi)部充滿微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫。3 3、分離系統(tǒng)、分離系統(tǒng) 色譜柱色譜柱發(fā)展趨勢(shì)： 填料粒度小 柱徑小標(biāo)準(zhǔn)柱型： 4.6mm或 3.9mm L: 15-30cm填料粒度：5-10m裝柱技術(shù)：干法：填料粒度大于裝柱技術(shù)：干法：填料粒度大于20 m時(shí)可用。時(shí)可用。 濕法（勻漿法）：配成懸浮液。高壓泵壓入濕法（勻漿法）：配成懸浮液。高壓泵壓入 色譜柱，洗凈備用色譜柱，洗凈備用4 4、檢測(cè)系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)l 檢測(cè)器是檢測(cè)器是HPLCHPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。l要求：要求：

13、l 靈敏度高靈敏度高l 噪音低（即對(duì)溫度、流量等外界變化不敏感）噪音低（即對(duì)溫度、流量等外界變化不敏感）l 線性范圍寬線性范圍寬l 重復(fù)性好重復(fù)性好l 適用范圍廣適用范圍廣分類：分類：l 1）按原理可分為光學(xué)檢測(cè)器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射）、熱學(xué)檢測(cè)器（如吸附熱）、電化學(xué)檢測(cè)器（如極譜、庫(kù)侖、安培）、電學(xué)檢測(cè)器（電導(dǎo)、介電常數(shù)、壓電石英頻率）、放射性檢測(cè)器（閃爍計(jì)數(shù)、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測(cè)器。l 2）按測(cè)量性質(zhì)可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測(cè)器測(cè)量的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，它對(duì)溶劑和溶質(zhì)組分均有反應(yīng)，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。通用型的靈敏度一般比

14、專屬型的低。專屬型檢測(cè)器只能檢測(cè)某些組分的某一性質(zhì)，如紫外、熒光檢測(cè)器，它們只對(duì)有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。l 3）按檢測(cè)方式分為濃度型和質(zhì)量型。濃度型檢測(cè)器的響應(yīng)與流動(dòng)相中組分的濃度有關(guān)，質(zhì)量型檢測(cè)器的響應(yīng)與單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)檢測(cè)器的組分的量有關(guān)。l 4）按破壞性還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。la.紫外檢測(cè)器（紫外檢測(cè)器（UD）lb.熒光檢測(cè)器（熒光檢測(cè)器（FD)lc.示差折光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器(RID）ld.安培檢測(cè)器安培檢測(cè)器le.電導(dǎo)檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器lf.蒸發(fā)光散射檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)檢測(cè)器介紹檢測(cè)器介紹a.紫外檢測(cè)器(ultraviolet detector)

15、 l UV檢測(cè)器是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器，約有80%的物質(zhì)可以在254 nm或280nm處產(chǎn)生紫外吸收。l 檢測(cè)原理：檢測(cè)原理：朗伯比爾朗伯比爾 (Lambert-Beer) (Lambert-Beer) 定律，響應(yīng)信號(hào)定律，響應(yīng)信號(hào)（吸光度）與濃度成正比（吸光度）與濃度成正比A=Cll 特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度較高（靈敏度較高（1010-6-61010-9-9 g/ml g/ml），噪音低，線），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，應(yīng)用廣（分析、制備）。應(yīng)用廣（分析、制備）。l 局限：局限：只能檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng)相的截止波只能

16、檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)應(yīng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)。長(zhǎng)應(yīng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)。 l 專屬型、濃度型檢測(cè)器專屬型、濃度型檢測(cè)器石英窗 接色譜柱UV光電倍增管廢液l （1 1）固定波長(zhǎng)檢測(cè)器）固定波長(zhǎng)檢測(cè)器 ：254nm254nml （2 2）可變波長(zhǎng)檢測(cè)器）可變波長(zhǎng)檢測(cè)器：光源：氘燈（和鎢燈），光源：氘燈（和鎢燈）， 200200400400（800800）nmnm，單，單色器，流通池（試樣），光電色器，流通池（試樣），光電管管光路系統(tǒng)和紫外分光光度計(jì)相似光路系統(tǒng)和紫外分光光度計(jì)相似 l （3 3）光電二極管陣列檢測(cè)器）光電二極管陣列檢測(cè)器 (photodiode (photodiode array

17、detectorarray detector； PDAD)PDAD)：1024個(gè)二極管陣列，個(gè)二極管陣列，一個(gè)二極管對(duì)應(yīng)接受光譜上約一個(gè)二極管對(duì)應(yīng)接受光譜上約1nm1nm譜帶寬的單色光，譜帶寬的單色光，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖。處理，三維立體譜圖。類型：類型：l光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器l 工作原理工作原理：復(fù)光通過(guò)流通池，再進(jìn)入單色器，：復(fù)光通過(guò)流通池，再進(jìn)入單色器，分光后照射在二極管陣列裝置上，同時(shí)獲得各分光后照射在二極管陣列裝置上，同時(shí)獲得各波長(zhǎng)的信號(hào)強(qiáng)度，即獲得組分的吸收光譜。獲波長(zhǎng)的信號(hào)強(qiáng)度，即獲得組分的吸收光譜。獲得得三維

18、光譜色譜圖三維光譜色譜圖。l 用途用途：吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積：吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量用于定量, ,判斷峰純度。判斷峰純度。 光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展，如圖所示。紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展，如圖所示。光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器b.熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器(fluorescence detector；FD)l檢測(cè)原理檢測(cè)原理：化合物受紫外光激發(fā)后，發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)化合物受紫外光激發(fā)后，發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光，稱為熒光；的光，稱為熒光；熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度 (F) 與激發(fā)光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度 (I0) 及熒光物質(zhì)濃度及熒光

19、物質(zhì)濃度 (C) 之間的關(guān)系為：之間的關(guān)系為： F=2.3QKI0Cl Q為量子產(chǎn)率，為量子產(chǎn)率，K為熒光效率，為熒光效率，為摩爾吸光系數(shù)，為摩爾吸光系數(shù)，l為光徑長(zhǎng)度。為光徑長(zhǎng)度。 F=KC 選擇性好，選擇性好，專屬型檢測(cè)器，靈敏專屬型檢測(cè)器，靈敏度比紫外檢測(cè)器高度比紫外檢測(cè)器高（檢測(cè)限（檢測(cè)限10-10 g/ml10-10 g/ml） 對(duì)多環(huán)芳烴，維對(duì)多環(huán)芳烴，維生素生素B B、黃曲霉素、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；類化合物等有響應(yīng)；c. 示差折光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器（differential refractive i

20、ndex detector，RID）原理：原理：可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值，差值與濃度呈正比；折光指數(shù)差值，差值與濃度呈正比； 除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；通用型檢除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）； 靈敏度低靈敏度低（10-6g）、對(duì)溫度敏感、不能用于梯、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫；度洗脫； 偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；d.安培檢測(cè)器安培檢測(cè)器 由恒電位儀和一薄層反由恒電位儀和一薄層反應(yīng)池（體積為應(yīng)池（體積為15 L）

21、組）組成。如圖。成。如圖。 原理：原理：利用待測(cè)利用待測(cè)物流入反應(yīng)池時(shí)在工作電物流入反應(yīng)池時(shí)在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，兩電極間就有電流通應(yīng)，兩電極間就有電流通過(guò)，此電流大小與待測(cè)物過(guò)，此電流大小與待測(cè)物濃度成正比。濃度成正比。 采用安培檢測(cè)器時(shí)，采用安培檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相必須含有電解質(zhì)，流動(dòng)相必須含有電解質(zhì)，且呈化學(xué)隋性。它最適于且呈化學(xué)隋性。它最適于與反相色譜匹配。但此檢與反相色譜匹配。但此檢測(cè)器只能檢測(cè)具有電活性測(cè)器只能檢測(cè)具有電活性的物質(zhì)。的物質(zhì)。接參比電極接參比電極和對(duì)電極和對(duì)電極接色譜柱接色譜柱Teflon塑料塊塑料塊1 cm工作電極工作電極(Pt, Au

22、, 碳糊碳糊)e.e.電導(dǎo)檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器 電導(dǎo)檢測(cè)器主要用于離子色譜的檢測(cè)。電導(dǎo)檢測(cè)器主要用于離子色譜的檢測(cè)。原理：原理：根據(jù)待測(cè)物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)根據(jù)待測(cè)物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來(lái)測(cè)量電離物質(zhì)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來(lái)測(cè)量電離物質(zhì)的含量。的含量。 電導(dǎo)檢測(cè)器的主要部件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)電導(dǎo)檢測(cè)器的主要部件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)受溫度影響較大，因此需要將電導(dǎo)池置于恒溫受溫度影響較大，因此需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。另外，當(dāng)箱中。另外，當(dāng)pH7pH7時(shí)，該檢測(cè)器不夠靈敏。時(shí)，該檢測(cè)器不夠靈敏。電導(dǎo)檢測(cè)器不能用于梯度洗脫。電導(dǎo)檢測(cè)器不能用于梯度洗脫。f.f.蒸發(fā)光散射檢測(cè)

23、器（蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSDELSD）原理：原理：通過(guò)檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)光散射光散射程度而測(cè)定溶質(zhì)濃度的檢測(cè)器。色譜程度而測(cè)定溶質(zhì)濃度的檢測(cè)器。色譜柱后流出物在通向檢測(cè)器途中，被高速載氣（氮?dú)猓﹪姵伸F柱后流出物在通向檢測(cè)器途中，被高速載氣（氮?dú)猓﹪姵伸F狀液滴，再進(jìn)入蒸發(fā)漂移管中，流動(dòng)相不斷蒸發(fā)，含溶質(zhì)的狀液滴，再進(jìn)入蒸發(fā)漂移管中，流動(dòng)相不斷蒸發(fā)，含溶質(zhì)的霧狀液滴形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過(guò)檢測(cè)器。霧狀液滴形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過(guò)檢測(cè)器。在檢測(cè)器中，光被散射的程度取決于溶質(zhì)顆粒的大小與數(shù)量。在檢測(cè)器中，光被散射的程度取決于溶質(zhì)顆粒的大小與數(shù)量。特點(diǎn)：特點(diǎn)：消除了溶劑的干擾，不受溫

24、度變化影響，靈敏度高，消除了溶劑的干擾，不受溫度變化影響，靈敏度高，是通用型檢測(cè)器。是通用型檢測(cè)器。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器示意圖蒸發(fā)光散射檢測(cè)器示意圖色譜數(shù)據(jù)處理色譜數(shù)據(jù)處理lHPLC通常配有記錄儀、積分儀或色通常配有記錄儀、積分儀或色譜工作站等，以完成對(duì)檢測(cè)信號(hào)的記譜工作站等，以完成對(duì)檢測(cè)信號(hào)的記錄、處理和控制等。錄、處理和控制等。第三節(jié)第三節(jié)高效液相色譜分高效液相色譜分析法析法一、液一、液- -固吸附色譜固吸附色譜二、液二、液- -液分配色譜液分配色譜三、離子交換色譜三、離子交換色譜四、離子色譜四、離子色譜五、離子對(duì)色譜五、離子對(duì)色譜六、排阻色譜六、排阻色譜七、親和色譜七、親和色譜(AC)(AC

25、)主要分離類型與原理主要分離類型與原理一、一、 液液-固吸附色譜固吸附色譜固定相固定相：硅膠、氧化鋁等：硅膠、氧化鋁等;流動(dòng)相流動(dòng)相：各種不同極性：各種不同極性的一元或多元溶劑。的一元或多元溶劑?；驹砘驹恚航M分在固定相吸附劑上的吸附與解吸：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸; 吸附系數(shù)吸附系數(shù)K不僅取決于不僅取決于X固相固相與與X液相液相的比值，的比值，還取決于溶劑分子還取決于溶劑分子S的吸附能力。的吸附能力。K大，表示該溶大，表示該溶劑分子吸附能力強(qiáng)，后流出色譜柱，后出峰。劑分子吸附能力強(qiáng)，后流出色譜柱，后出峰。nX固相液相液相固相SXSn K= 二、二、 液液-液分配色譜液分配色譜基

26、本原理基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配不同不同K是分配系數(shù)是分配系數(shù)，K大，保留時(shí)間長(zhǎng)，后流出色大，保留時(shí)間長(zhǎng)，后流出色譜柱。譜柱。 K=流固CC 正相色譜法與反相色譜法比較表正相色譜法與反相色譜法比較表 正相色譜法正相色譜法反相色譜法反相色譜法固定相極性固定相極性高中高中中低中低流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性低中低中中高中高組分洗脫次序組分洗脫次序 極性小先洗出極性小先洗出 極性大先洗出極性大先洗出三、三、 離子交換色譜離子交換色譜固定相固定相：陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂流動(dòng)相流動(dòng)相：陰離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用酸性：陰離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用

27、酸性水溶液；反之。水溶液；反之?；驹砘驹恚弘x子交換樹(shù)脂上可電離的離子與流動(dòng)相：離子交換樹(shù)脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離中具有相同電荷的溶質(zhì)進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子在交換樹(shù)脂上有不同的親和力而被分離。子在交換樹(shù)脂上有不同的親和力而被分離。 陽(yáng)離子交換：陽(yáng)離子交換：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 陰離子交換：陰離子交換：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 離子交換色譜的分離機(jī)理離子交換色譜的分離機(jī)理1、qxyP + L PL不足之處不足之處：忽略了在填料表面上形成復(fù)合物時(shí)：忽略了在填料表面上形成復(fù)合物時(shí)溶質(zhì)被流動(dòng)相中

28、小分子飽和并不斷進(jìn)行計(jì)量置溶質(zhì)被流動(dòng)相中小分子飽和并不斷進(jìn)行計(jì)量置換反應(yīng)的重要因素。換反應(yīng)的重要因素。2 2、P0 + ZD0 Pb + ZDbP P0 0：流動(dòng)相中溶質(zhì)的濃度：流動(dòng)相中溶質(zhì)的濃度P Pb b：填料表面上被吸附的溶質(zhì)濃度：填料表面上被吸附的溶質(zhì)濃度D D0 0：流動(dòng)相中洗脫劑的濃度：流動(dòng)相中洗脫劑的濃度D Db b：填料表面上洗脫劑的濃度：填料表面上洗脫劑的濃度Z Z：是蛋白質(zhì)在吸附過(guò)程中從填料表面上被置換的：是蛋白質(zhì)在吸附過(guò)程中從填料表面上被置換的洗脫劑的數(shù)目洗脫劑的數(shù)目。K=Pb X (Db)zP0 X (D0)z Z可以小到忽略不計(jì)，反應(yīng)常數(shù)變?yōu)榉峙湎禂?shù)可以小到忽略不計(jì)，

29、反應(yīng)常數(shù)變?yōu)榉峙湎禂?shù)Kd=Pb P0 在Z值不能忽略時(shí)值不能忽略時(shí)K= (Db)z (D0)zKdx在等度洗脫蛋白質(zhì)的過(guò)程中，容量因子在等度洗脫蛋白質(zhì)的過(guò)程中，容量因子KK與保與保留留體積成比例，同時(shí)洗脫過(guò)程中，體積成比例，同時(shí)洗脫過(guò)程中，K Kd d， D Db b是常數(shù)，是常數(shù)，用用K Kz z表示。表示。K= 1 (D0)zKzx 1 D0lgK = lg Kz + Zlg離子交換色譜的影響因素離子交換色譜的影響因素1 1、填料孔徑的影響、填料孔徑的影響2 2、柱長(zhǎng)的影響、柱長(zhǎng)的影響3 3、流速的影響、流速的影響4 4、PHPH值的影響值的影響四、四、 離子色譜離子色譜 離子色譜離子色譜

30、是在是在20世紀(jì)世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來(lái)年代中期發(fā)展起來(lái)的一中技術(shù)，其與的一中技術(shù)，其與離子交換色譜離子交換色譜的區(qū)別是其的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹(shù)脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)換樹(shù)脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合陰離子的有效方和電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合陰離子的有效方法。法。 五、五、 離子對(duì)色譜離子對(duì)色譜 原理原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)

31、化合物，使其能夠在兩相子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配。之間進(jìn)行分配。 陰離子分離陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化十六烷基：常采用烷基銨類，如氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子；三甲銨作為對(duì)離子； 陽(yáng)離子分離：陽(yáng)離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子。為對(duì)離子。六、六、 排阻色譜色譜排阻色譜色譜 固定相：固定相：凝膠凝膠(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)； 原理：原理：按按分子大小和形狀分子大小和形狀不同不同分離。分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最慢；中等由其中通過(guò)，出峰最慢

32、；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。故在最后出峰。 七、七、 親和色譜親和色譜(AC) 原理：原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。親和力，進(jìn)行選擇性分離。 先在載體表面鍵合上一先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基再連接上配基(酶、抗原等酶、抗原等)，這種固載化的配基將只，這種固載化的配基將只能和

33、具有親和力特性吸附能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。留。改變淋洗液后洗脫。載體載體LX配基配基待分離物質(zhì)待分離物質(zhì)親合色譜影響因素親合色譜影響因素1、平衡和平衡緩沖溶液、平衡和平衡緩沖溶液2、蛋白質(zhì)的濃度和溫度效應(yīng)、蛋白質(zhì)的濃度和溫度效應(yīng)3、特異性洗脫、特異性洗脫4、非特異性洗脫、非特異性洗脫 (受緩沖溶液中的受緩沖溶液中的PH值，值， 離子強(qiáng)度，溫度和介電常數(shù)的控制。離子強(qiáng)度，溫度和介電常數(shù)的控制。)影響分離的因素與操作條件的選擇影響分離的因素與操作條件的選擇(一一)影響分離的因素影響分離的因素l 1、在高效液相色譜中在高效液相色譜中,

34、液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬(wàn)分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)的萬(wàn)分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較較小，可以忽略不計(jì)，即：小，可以忽略不計(jì)，即： H = A + C ul 故液相色譜故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如曲線與氣相色譜的形狀不同，如下圖所示。下圖所示。2、流速、流速 流速大于流速大于0.5 cm/s時(shí)時(shí), Hu曲線是一段斜率曲線是一段斜率不大的直線。降低流不大的直線。降低流速，柱效提高不是很速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。要可選擇參數(shù)。

35、 3、固定相及分離柱、固定相及分離柱氣相色譜中的固定液原則上氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，在高效液相色譜中，分離柱分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制高的工作，一般很少自行制備。備。（二）分離類型選擇（二）分離類型選擇 （見(jiàn)下頁(yè)表）（見(jiàn)下頁(yè)表）分離類型選擇（分離類型選擇（choice of separation types）第四節(jié)第四節(jié) 固定相和流動(dòng)相的選擇固定相和流動(dòng)相的選擇一、固定相一、固定相 1、高效液相色譜固定相、高效液相色譜固定相以承受

36、高壓能力以承受高壓能力來(lái)分類，可分為來(lái)分類，可分為剛性固體和硬膠剛性固體和硬膠兩大類。兩大類。 剛性固體以剛性固體以二氧化硅二氧化硅為基質(zhì)為基質(zhì) 硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。 2、固定相按、固定相按孔隙深度孔隙深度分類，可分為分類，可分為表面表面多孔型多孔型和和全多孔型全多孔型固定相兩類固定相兩類固定相的要求：固定相的要求：l顆粒細(xì)且均勻；顆粒細(xì)且均勻；l傳質(zhì)快；傳質(zhì)快；l機(jī)械強(qiáng)度高，能耐高壓；機(jī)械強(qiáng)度高，能耐高壓；l化學(xué)穩(wěn)定性好，不與流動(dòng)相發(fā)生化化學(xué)穩(wěn)定性好，不與流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反

37、應(yīng)。學(xué)反應(yīng)。二、流動(dòng)相二、流動(dòng)相 正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是：對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是：（1）溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極）溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。性和良好的選擇性。（2）溶劑與檢測(cè)器匹配。對(duì)于紫外吸收檢測(cè)）溶劑與檢測(cè)器匹配。對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比器，應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外溶劑的紫外截止波長(zhǎng)截止波長(zhǎng) 要長(zhǎng)。要長(zhǎng)。 所謂所謂溶劑的紫外截止波長(zhǎng)溶劑的紫外截止波長(zhǎng)指當(dāng)小于截止波指當(dāng)小于截止波長(zhǎng)的輻射通過(guò)溶劑時(shí)，長(zhǎng)的輻射通過(guò)溶劑時(shí)， 溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)

38、溶劑被看作是光學(xué)不透明，強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測(cè)量。它嚴(yán)重干擾組分的吸收測(cè)量。（3）高純度）高純度 由于高效液相色譜靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相由于高效液相色譜靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰偽峰”。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好）化學(xué)穩(wěn)定性好（5）低粘度（粘度適中）低粘度（粘度適中） 若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過(guò)低的溶劑也不宜采醇和乙腈等；但粘度過(guò)低的溶

39、劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離。柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離。 流動(dòng)相類別流動(dòng)相類別按流動(dòng)相按流動(dòng)相組成組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；分：?jiǎn)谓M分和多組分；按按極性極性分：極性、弱極性、非極性；分：極性、弱極性、非極性；按按使用方式使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑常用溶劑有己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙有己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。醇、乙腈、水。 選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題（1）盡量使用）盡量使用高純度試劑高純度試劑作流動(dòng)相，

40、防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。柱子。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。 第五節(jié)第五節(jié) 圖形圖形結(jié)果分析及其應(yīng)用結(jié)果分析及其應(yīng)用l色譜圖色譜圖(Chromatogram) :

41、(Chromatogram) :l 色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖線圖, ,其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度, ,橫坐標(biāo)為時(shí)間橫坐標(biāo)為時(shí)間色譜峰色譜峰時(shí)間時(shí)間( (分分) )基線基線峰高峰高峰寬峰寬響應(yīng)值響應(yīng)值色譜數(shù)據(jù)處理色譜數(shù)據(jù)處理分離柱檢測(cè)器記錄儀積分儀色譜工作站色譜儀信號(hào)輸出方框圖色譜數(shù)據(jù)處理通過(guò)色譜數(shù)據(jù)處理通過(guò)ADC轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換器, 把模擬把模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào), 然后采用色譜軟件處然后采用色譜軟件處理給出色譜圖等信息。理給出色譜圖等信息。 數(shù)據(jù)處理原理：數(shù)據(jù)處理原理： 峰的檢測(cè)峰的檢測(cè) 數(shù)

42、據(jù)采集數(shù)據(jù)采集 基線校正和重疊峰的分離基線校正和重疊峰的分離 自動(dòng)處理自動(dòng)處理 人工修正人工修正 峰的檢測(cè)峰的檢測(cè) 峰的檢測(cè)和判別是依據(jù)在基線的訊號(hào)水平上，預(yù)峰的檢測(cè)和判別是依據(jù)在基線的訊號(hào)水平上，預(yù)設(shè)一個(gè)設(shè)一個(gè)“閾值閾值”，超過(guò)該值時(shí)，判別為峰可開(kāi)始檢，超過(guò)該值時(shí)，判別為峰可開(kāi)始檢測(cè)。一般采用下面兩種方式判別峰訊號(hào)的變化：測(cè)。一般采用下面兩種方式判別峰訊號(hào)的變化：切線色譜峰的判斷 最小面積依照信號(hào)斜率依照信號(hào)斜率的變化檢測(cè)信號(hào)的變化檢測(cè)信號(hào)依照積分面積依照積分面積檢測(cè)峰信號(hào)檢測(cè)峰信號(hào) 保留時(shí)間和峰面積的計(jì)算Aa ttn ti iinrr i1 基線校正和重疊峰的分離基線校正和重疊峰的分離 在

43、色譜分析中，經(jīng)常會(huì)遇到基線漂移和色譜峰不能完全分離的情況。通常采用谷谷規(guī)則或預(yù)設(shè)基線漂移值參數(shù)來(lái)解決 色譜儀自動(dòng)定性和定量分析色譜儀自動(dòng)定性和定量分析 “時(shí)間窗時(shí)間窗”法法 (Time Window)：tRt 對(duì)整個(gè)色譜圖上各個(gè)峰的保留值都設(shè)定相同區(qū)間“時(shí)間窗” ，規(guī)定圖中各個(gè)峰保留時(shí)間的變化范圍。該法設(shè)置簡(jiǎn)單，但用于識(shí)別保留時(shí)間相差很近的相鄰峰不大方便。 “時(shí)間帶時(shí)間帶”法法 (Time Band): tR(1a%) 對(duì)每個(gè)需識(shí)別的定量峰，都設(shè)定一個(gè)保留時(shí)間的相對(duì)變動(dòng)范圍。該設(shè)置較麻煩，但對(duì)不同峰可給出不同的變動(dòng)范圍，對(duì)識(shí)別相鄰峰的分辨率較好，同時(shí)用于編組定量分析也很方便。高效液相色譜的定性

44、和定量分析高效液相色譜的定性和定量分析 1.1.定性分析定性分析在液相色譜中保留值定性的方法主要是用直接在液相色譜中保留值定性的方法主要是用直接與已知標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)照的方法。當(dāng)未知峰的保留值與已知標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)照的方法。當(dāng)未知峰的保留值（t R或或V R ）與某一已知標(biāo)準(zhǔn)物完全相同時(shí)，）與某一已知標(biāo)準(zhǔn)物完全相同時(shí)，則未知峰可能與此已知標(biāo)準(zhǔn)物是同一物質(zhì)，特則未知峰可能與此已知標(biāo)準(zhǔn)物是同一物質(zhì)，特別是在改變色譜柱或改變洗脫液的組成時(shí)，未別是在改變色譜柱或改變洗脫液的組成時(shí)，未知峰的保留值與已知標(biāo)準(zhǔn)物的保留值仍能完全知峰的保留值與已知標(biāo)準(zhǔn)物的保留值仍能完全相同，則可以基本上認(rèn)定未知峰與標(biāo)準(zhǔn)物是同相同，則可以基本

45、上認(rèn)定未知峰與標(biāo)準(zhǔn)物是同一物質(zhì)。一物質(zhì)。 2.定量分析定量分析基本方法有基本方法有內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法等。內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法等。 外標(biāo)法外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 是一種簡(jiǎn)便、快速的是一種簡(jiǎn)便、快速的絕對(duì)絕對(duì)定量方定量方法（歸一化法則是法（歸一化法則是相對(duì)相對(duì)定量方法）。定量方法）。首先用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)首先用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。準(zhǔn)工作曲線。具體作法是具體作法是：用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與欲測(cè)組分相同的色譜條件下，等體積準(zhǔn)確量進(jìn)欲測(cè)組分相同的色譜條件下，等體積準(zhǔn)確量進(jìn)樣，測(cè)量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰樣，測(cè)量各峰的峰面積

46、或峰高，用峰面積或峰高對(duì)樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，此標(biāo)準(zhǔn)工作高對(duì)樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，此標(biāo)準(zhǔn)工作曲線應(yīng)是通過(guò)原點(diǎn)的直線。曲線應(yīng)是通過(guò)原點(diǎn)的直線。若標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不若標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過(guò)原點(diǎn)，說(shuō)明測(cè)定方法存在系統(tǒng)誤差。標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)原點(diǎn)，說(shuō)明測(cè)定方法存在系統(tǒng)誤差。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率即為絕對(duì)校正因子。工作曲線的斜率即為絕對(duì)校正因子。l實(shí)驗(yàn)儀器的基本操作實(shí)驗(yàn)儀器的基本操作l 1、 開(kāi)機(jī)，啟動(dòng)裝置，進(jìn)入開(kāi)機(jī)，啟動(dòng)裝置，進(jìn)入Win2000；開(kāi)啟；開(kāi)啟LC，點(diǎn)擊點(diǎn)擊Instrumentl online圖標(biāo)，進(jìn)入儀器控制面圖標(biāo)，進(jìn)入儀器控制面板，設(shè)置所需各項(xiàng)參數(shù)。板，設(shè)置所需各項(xiàng)參數(shù)。 l 2、 設(shè)置分析用流動(dòng)相

47、清洗流路設(shè)置分析用流動(dòng)相清洗流路,等待色譜柱、系等待色譜柱、系統(tǒng)的平衡，基線穩(wěn)定，開(kāi)始進(jìn)樣分析。統(tǒng)的平衡，基線穩(wěn)定，開(kāi)始進(jìn)樣分析。l 3、 分析結(jié)束，數(shù)據(jù)處理，打印報(bào)告。分析結(jié)束，數(shù)據(jù)處理，打印報(bào)告。l 4、 關(guān)閉柱溫箱和檢測(cè)器，沖洗色譜柱，關(guān)閉脫關(guān)閉柱溫箱和檢測(cè)器，沖洗色譜柱，關(guān)閉脫氣機(jī)、泵，關(guān)閉整個(gè)裝置。氣機(jī)、泵，關(guān)閉整個(gè)裝置。l 5、 關(guān)閉總電源。關(guān)閉總電源。l 6、 在記錄本上記錄使用情況。在記錄本上記錄使用情況。高效液相色譜的應(yīng)用高效液相色譜的應(yīng)用l高效液相色譜法被廣泛應(yīng)用于分離、分析高效液相色譜法被廣泛應(yīng)用于分離、分析高沸點(diǎn)物質(zhì)，熱穩(wěn)定性差物質(zhì)，生理活性高沸點(diǎn)物質(zhì)，熱穩(wěn)定性差物質(zhì)，生理活性以及大分子物質(zhì)以及大分子物質(zhì)l一、樣品測(cè)定一、樣品測(cè)定l1流動(dòng)相比例調(diào)整流動(dòng)相比例調(diào)整：建議第一次檢驗(yàn)時(shí)請(qǐng)：建議第一次檢驗(yàn)時(shí)請(qǐng)少配流動(dòng)相，以免浪費(fèi)。弱電解質(zhì)的流動(dòng)少配流動(dòng)相，以免浪費(fèi)。弱電解質(zhì)的流動(dòng)相其重現(xiàn)性更不容易達(dá)到，請(qǐng)注意充分平相其重現(xiàn)性更不容易達(dá)到，請(qǐng)注意充分平衡柱。衡柱。l2樣品配制