醫(yī)學標書范文

1、色素上皮衍生因子（PEDF）在膀胱癌中的表 達及其對膀胱癌治療作用的研究 、趨勢判斷和需求分析 國內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢（含知識產(chǎn)權(quán)狀況和技術(shù)標準狀況）；經(jīng)濟建 設(shè)和社會發(fā)展需求；科學技術(shù)價值、特色和創(chuàng)新點。 膀胱癌是危及人類健康的重大疾病，全世界范圍內(nèi)統(tǒng)計其發(fā)病率占全身腫瘤的第8位，在男性其標 準發(fā)病率9.9/10萬；在女性，其標準發(fā)病率為2.3/10萬，占第25位。死亡率在男性為4.2/10萬，占全身 腫瘤死亡率的第9位，在女性為1.1/10萬，占第16位。在我國，膀胱癌也是泌尿外科的最常見惡性腫瘤, 占全身惡性腫瘤的3.2%，1995年，北京市城區(qū)膀胱癌發(fā)病率大約為7/10萬人，上海市

2、城區(qū)發(fā)病率為 8.6/10 萬人1，且今后發(fā)病率仍有上升趨勢。作為危害人類健康的常見惡性腫瘤，膀胱癌發(fā)病機制和治療方面 的研究始終是臨床基礎(chǔ)研究的重點之一。 目前膀胱癌的治療仍以手術(shù)切除為主，輔以膀胱灌注化療和免疫治療、全身化療、放療和生物治 療等措施，但這些治療方法效果都不滿意，主要是治療后易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率高達 80%，其中大約 16%-25% 復(fù)發(fā)的腫瘤其惡性程度增加，有10%發(fā)展為浸潤性或轉(zhuǎn)移性癌，因此 ，尋找一種新的、更有效的生物治療 方法，是當前臨床迫切需要解決的問題。 在膀胱癌的這些輔助性治療方法中，無論是化療還是免疫治療，主要機制是通過直接殺死腫瘤細胞、 阻斷腫瘤細胞分裂或誘導(dǎo)細胞

3、調(diào)亡的方式來抑制腫瘤生長。做為一種實體性腫瘤生長，腫瘤細胞的增殖 固然重要，而新生血管的形成在腫瘤的生長和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮非常重要作用。在正常狀態(tài)下, 人體內(nèi)的脈管系統(tǒng)在血管生長因子和抑制因子網(wǎng)絡(luò)式的相互作用下處于平衡狀態(tài)；病理狀態(tài)下，尤其是 發(fā)生惡性腫瘤時，這種平衡向血管生成的方向發(fā)展。當腫瘤生長達到腫瘤組織超過 2mm時就會有新生血 管形成，如果沒有新生血管生成，腫瘤生長明顯受到抑制，甚至停止 2, 3?？寡苌莎煼ㄊ遣煌谀?前常規(guī)療法的新的腫瘤治療策略，具有高效低毒和不易產(chǎn)生耐藥性的特點 4。有關(guān)血管生長因子和血管 生長抑制因子在腫瘤中所起作用，以及通過抗血管生成治療腫瘤已經(jīng)成

4、為當前腫瘤研究的一個熱點。 近來研究發(fā)現(xiàn)，色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor, PEDF ）是一種對腫瘤有抑制 作用的細胞因子。這種細胞因子是Tombran-Tink等在實驗中發(fā)現(xiàn)的，由人視網(wǎng)膜色素上皮細胞分泌的一 精品文庫 種蛋白質(zhì)，分子量為50 KD5，屬于serpin卵白蛋白/PAT-2亞群，其基因全長16 kb，位于染色體17p13.1-pter 多項研究表明，PEDF是一種天然的高效的新生血管抑制劑7，并通過誘導(dǎo)腫瘤細胞分化起到 抑制腫瘤生長的作用。Tombran-Tink等將PEDF基因定位于染色體17p13.1,腫瘤發(fā)生與該區(qū)域關(guān)

5、系密切, 提示該基因可能是抑癌基因或腫瘤相關(guān)基因5。對腫瘤細胞進行編碼PEDF的腺病毒轉(zhuǎn)染，在血管內(nèi)皮 生長因子(Vascularendothelial growth factor , VEGF )存在的情況下，PEDF明顯阻止了血管內(nèi)皮細胞管 腔形成和遷移。對患有 CNV/AMD 患者的體外實驗也發(fā)現(xiàn)，PEDF大量減少的情況下，內(nèi)皮細胞有明顯 遷移；而對照組含有正常水平PEDF,則抑制了內(nèi)皮細胞的遷移6。 Crawford等發(fā)現(xiàn)PEDF在神經(jīng)母細胞瘤 中是腫瘤細胞分化調(diào)控的主要的抗血管生成的抑制劑 7。肝癌患者血管增生和腫瘤發(fā)展中, PEDF作為 VEGF的拮抗因子，起到了抑制作用。對裸小鼠

6、的在體實驗以及鼠的肺癌模型也同樣證明了 PEDF對腫瘤 的抑制作用。其機制乃因PEDF減少腫瘤微血管的密度，因而可被用于抑制腫瘤新生血管形成, 從而抑 制腫瘤的生長，在腫瘤的治療前景上非常樂觀 8。 歡迎下載12 我們最近對PEDF在膀胱癌中表達情況的初步研究發(fā)現(xiàn)，PEDF在膀胱癌組織中表達明顯低于正常 PEDF 在 膀胱組織，而且 PEDF表達情況與膀胱癌的惡性程度以及癌組織中微血管密度呈負相關(guān)，提示 膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用, PEDF的正常表達可能抑制膀胱癌細胞的生長、增殖, PEDF 有 可能成為膀胱癌生物學治療的一種有效的新方法。目前國內(nèi)、外尚未見此項研究的相關(guān)報道。因此我

7、們 設(shè)想，擴大樣本量，應(yīng)用分子生物學技術(shù)檢測膀胱癌組織及非癌膀胱組織中 PEDF的表達水平，進一步 研究PEDF在膀胱癌中的表達情況，并結(jié)合臨床資料分析 PEDF表達與膀胱癌分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后 的關(guān)系；通過研究膀胱癌組織中PEDF與VEGF表達的相關(guān)性，PEDF與血小板反應(yīng)素-1表達的相關(guān)性, 探討膀癌組織中 PEDF表達與腫瘤血管形成的相關(guān)性及可能的作用機制；通過研究 PEDF表達與金屬蛋 白酶-9 ( MMP-9 )的相關(guān)性，探討 PEDF表達與膀胱癌浸潤的相關(guān)性；通過研究PEDF表達與已知的對 腫瘤生長有明確調(diào)節(jié)作用的腫瘤壞死因子a( TNF- a)、白細胞介素 1 a( IL-1

8、a)、血栓調(diào)節(jié)蛋白 (thrombomodulin )和白介素8 (IL-8 )等細胞因子表達的相關(guān)性，探討PEDF表達對膀癌細胞調(diào)節(jié)的可 能機制，從而探討 PEDF在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中的可能作用機制；在此基礎(chǔ)上，以連接有 PEDF 編 碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞株、以PEDF蛋白治療裸鼠膀胱癌模型，進一步探討PEDF表達對 膀胱癌細胞生長的抑制作用以及對膀胱癌的治療效果 ,為膀胱癌的生物學治療探索一種有效的新方法。 參考文獻 2吳階平，吳階平泌尿外科學，山東科學技術(shù)出版社, 2004.5 : 898-917 二、研究內(nèi)容和技術(shù)關(guān)鍵 研究的總體目標： (1)研究PEDF表達與膀胱癌的

9、發(fā)生、分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，探討 PEDF表達在膀胱癌 發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中可能的作用機制。 (2)研究PEDF對膀胱癌細胞的治療效果，為臨床治療膀胱癌的生物治療探索一種新的有效方法 研究的創(chuàng)新點: 本課題研究的內(nèi)容和思路不同于以往的其他研究，應(yīng)用分子生物學方法從研究 PEDF表達與膀胱癌的發(fā) 生、分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系入手，探討 PEDF表達在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中可能的作用機 PEDF蛋白治療裸鼠膀 制。在此基礎(chǔ)上，以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞株、以 胱癌模型，探討 PEDF對膀胱癌的治療作用。目前，本項研究國內(nèi)、外尚未見報道。本研究的順利完成, 將

10、為膀胱癌的生物學行為的研究開辟了新的途徑，也將為膀胱癌的生物學治療探索一種新的有效方法。 研究的主要內(nèi)容: (1)膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關(guān)細胞因子表達的檢測及相關(guān)性研究: 應(yīng)用分子生物學技術(shù)研究膀胱癌組織和非癌膀胱組織中 PEDF表達狀況，并檢測 VEGF、TSP-1、 MMP-9、TNF-a、IL-1 a、血栓調(diào)節(jié)蛋白( thrombomodulin )和IL-8的表達狀況；采用免疫組化技術(shù)檢 測膀胱癌組織和非癌膀胱組織中的微血管密度 (microvascular density ,MVD )，分析 PEDF 與 VEGF、TSP-1、 MMP-9、TNF-a、IL-1 a、

11、血栓調(diào)節(jié)蛋白和 IL-8表達的相關(guān)性，PEDF與MVD的相關(guān)性；并結(jié)合臨床 資料分析研究PEDF表達與膀胱癌患者 5年生存率之間的關(guān)系；闡明 PEDF表達與膀胱癌的發(fā)生、分期、 分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，探討PEDF表達在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的可能機制。 (2) PEDF對膀胱癌細胞株的治療: 以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞株，以空載轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞株作為對照, 觀察檢測VEGF、TNF- a的表達情況及膀胱癌細胞的凋亡、增殖情況。 PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療: PEDF蛋白（購自吉泰生物科技有限 以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以 公司）直接注射于裸鼠皮下

12、腫瘤組織內(nèi)作為治療組, 以未注射PEDF組為陰性對照組。 觀察各組的 MVD、 VEGF及腫瘤增殖情況，探討 PEDF表達在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，評估 PEDF對膀胱癌的治 療效果，為進一步過度到臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 需要解決的技術(shù)關(guān)鍵: （1）連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞株的轉(zhuǎn)染成功率。 （2） PEDF定量檢測：我們已有對前列腺癌、腎癌、膀胱癌等組織標本的 PEDF定量分析的基礎(chǔ)，已 形成較成熟技術(shù)條件、設(shè)備和研究經(jīng)驗。 （3）膀胱癌裸鼠模型的構(gòu)建。我們已有成功構(gòu)建裸鼠膀胱癌和前列腺癌模型的經(jīng)驗。 研究方法: 方法（1）膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關(guān)細胞

13、因子表達的檢測及相關(guān)性研究: 實驗組 對照組 膀胱癌組織 非癌膀胱組織 標本A 期B期C 期D 期 癌旁膀胱組正常膀胱組炎性膀胱組 織織織 例數(shù) 30 30 30 30 120 120 120 . 應(yīng)用SYBRGreen I實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR技術(shù),對膀胱癌、非癌膀胱組織中 進行定量測定。 P EDF . Western blot 法檢測 VEGF TSP-1、MMP-9 . ELISA法檢測TNF- a、IL-1 a、血栓調(diào)節(jié)蛋白、 IL-8濃度。 . 免疫組化方法檢測標本 MVD . 整理臨床資料: 5年生存率。 膀胱癌患者性別、年齡、組織病理、分期、分級、是否

14、轉(zhuǎn)移、 . 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析（使用SPSS統(tǒng)計分析軟件）: PEDF與VEGF表達的相關(guān)性。 PEDF與 TSP-1表達的相關(guān)性 PEDF與 MMP-9表達的相關(guān)性 IL-8濃度的相關(guān)性。 PEDF與 TNF- a、IL-1 a、血栓調(diào)節(jié)蛋白、 PEDF與組織MVD相關(guān)性。 PEDF與膀胱癌分期的相關(guān)性。 PEDF與膀胱癌惡性程度(分級)的相關(guān)性。 PEDF與膀胱癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。 PEDF與膀胱癌5年生存率的相關(guān)性。 方法(2)PEDFX寸膀胱癌細胞株的治療: 以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞，以空載轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞作為對照，檢測VEGF TNF-a濃度，觀察細胞的增殖、凋亡情況，

15、分析相關(guān)性。 . 以RT- PCR法擴增PEDF基因。 . 將擴增后的P EDF基因連接入腺病毒載體，轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞。 并以空載轉(zhuǎn) . . 觀察膀胱癌細胞增殖、侵襲、凋亡情況。 . 統(tǒng)計分析。 方法 (3) PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療: 以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以 為治療組，以未注射 P EDF為陰性對照組。觀察兩組膀胱癌組織 價PEDF對膀胱癌的治療效果。 P EDF蛋白直接注射于裸鼠皮下腫瘤內(nèi)作 MVD VEGF表達情況、腫瘤增殖情況，評 . 以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下構(gòu)建膀胱癌裸鼠模型。 . 將PEDF蛋白注射于裸鼠瘤體內(nèi)。 染為對照。 Western b

16、lot 法檢測 VEGF、TSP-1、MMP-9表達。 . VEGF TSP-1、MMP-9觀察腫瘤增殖、凋 應(yīng)用免疫組化方法檢測MVD應(yīng)用Western blot 法檢測 亡情況。分析PEDF與 VEGF的相互作用關(guān)系及其對腫瘤生長的作用機制。 技術(shù)路線: (1)膀胱癌組織和非癌膀胱組織中P EDF及相關(guān)細胞因子表達的檢測及相關(guān)性研究: a RT-PCR 檢測 PEDF mRNA表達 Western blot 法檢測VEGF TSP-1、MMP-9 ELISA法檢測TNF- a、IL-1 a、血栓調(diào) 節(jié)蛋白、IL-8濃度 免疫組化方法檢測 標本微血管密度 (MVD 膀胱癌標本 120例 癌旁

17、膀胱組織標 本120例 正常膀胱組織標 本120例 炎性膀胱組織標 本120例 結(jié)合臨床資料，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 (2) PEDF對膀胱癌細胞株的治療: 將PEDF轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞株，檢測 VEGF TSP-1、MMP-9 TNF- a濃度，觀察腫瘤細胞的增殖、凋亡 RT PCR法擴增 PEDF基因 情況。 fl Western blot 法檢 測 VEGF、TSP-1、 MMP-9表達 ELISA法檢 測 TNF- a 結(jié)果分析 觀察細胞凋 亡、增殖情 況 PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療: 觀察PEDF與 VEGF MVD相關(guān)性及其對膀胱癌細胞的抑制作用 構(gòu)建膀胱癌裸鼠模型 未注射（對照） 觀察微血

18、 管密度 （MVD VEGF TSP-1、 MMP-S定量測 定 腫瘤凋亡、增 殖、侵襲情況 注射PEDF蛋白 結(jié)果分析 先后開展了膀胱癌、前列腺癌等的一系列基礎(chǔ)研究（包括分子生物學研究）和臨床研究，如：裸 如 RT-PCR、southern、 鼠膀胱癌模型的建立、CD44基因、端粒酶、P53和Ras基因等表達與膀胱癌的關(guān)系、VEGF表達與膀胱 癌的關(guān)系等，熟練掌握了泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤分子生物學和細胞學研究的技術(shù)方法, northern雜交、DNA測序、擁有獨立的泌尿外科免疫、病理、分子生物學和細胞學實驗室，實驗室設(shè)備 完善，技術(shù)方法先進，擁有 PCR-擴增儀、酶標儀、各種電泳槽、凝膠成像設(shè)備、

19、細胞房及各種基礎(chǔ)實驗 設(shè)備等,為本課題的順利進行提供了有力的技術(shù)和儀器設(shè)備保證。細胞培養(yǎng)、腺病毒載體構(gòu)建等技術(shù)，積 累了較豐富的研究經(jīng)驗。 最近我們開展了對膀胱癌、前列腺癌組織中 PDEF表達的初步研究，掌握了對腫瘤組織包括膀胱 癌組織中PDEF表達的檢測方法，對本課題的順利進行提供了便利條件。例如：已完成對膀胱腫瘤與正 常膀胱組織PEDF表達情況的對照性研究，初步結(jié)果顯示如下 （1）定量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見：PEDF在正常膀胱組織中高表達，而在膀胱癌組織中 表達明顯降低（見圖 1）。 M M2 N3 T3 PEI3F 54 100 1OO 注: N1 , N2, N3 :正常膀胱

20、組織 T1 , T2 , T3 :膀胱癌組織 GAPDH :內(nèi)參照 M:為標記分子量 GAPDH 圖1 :正常膀胱組織與膀胱癌組織 PEDF定量PCR （2）在膀胱癌組織中 PEDF低表達與微血管增殖相關(guān)（見圖 2 )。 預(yù)期成果: (1) 明確測定出PEDF在膀胱癌中的表達情況以及其與相關(guān)細胞因子表達之間的關(guān)系。 PEDF在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。 PEDF對膀胱癌的治療有效，為最終過渡到臨床應(yīng)用提供強有力的實驗依據(jù)。 成果以論文的形式表達，并申請“PEDF治療裸鼠膀胱癌模型技術(shù)”的專利；擬發(fā)表論著 5-7 篇, 其中國內(nèi)權(quán)威雜志 4 5篇，SCI收錄雜志2篇。申請成果鑒定。 本課題實施過程中，形成一整套的細胞因子檢測方法、