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1、1第四章第四章 細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞:細(xì)胞:l細(xì)菌細(xì)菌l酵母酵母l霉菌霉菌l動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞l植物細(xì)胞植物細(xì)胞生物分離的目的組分:生物分離的目的組分: 胞內(nèi)產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物 胞外產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎的難易:細(xì)胞破碎的難易:與細(xì)胞種類(lèi)有關(guān)與細(xì)胞種類(lèi)有關(guān)與目的物的穩(wěn)定性有關(guān)與目的物的穩(wěn)定性有關(guān)2一、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)一、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)1. 1. 細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu):細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu):nG G+ +: : 肽聚糖肽聚糖nG G- -: : 外壁層為外壁層為脂多糖脂多糖和和磷脂磷脂、脂蛋白脂蛋白;內(nèi);內(nèi)壁層壁層肽聚糖肽聚糖。 (脂多糖需脂多糖需CaCa2+2+、MgMg2+2+才能穩(wěn)定)才能穩(wěn)定)32. 2.

2、酵母:由酵母纖維素組成,主要成分是葡聚糖和酵母:由酵母纖維素組成,主要成分是葡聚糖和甘露聚糖甘露聚糖3. 3. 霉菌:幾丁質(zhì)和葡聚糖霉菌:幾丁質(zhì)和葡聚糖4. 4. 植物細(xì)胞:纖維素、半纖維素、果膠、木質(zhì)素等植物細(xì)胞:纖維素、半纖維素、果膠、木質(zhì)素等5. 5. 動(dòng)物細(xì)胞:無(wú)細(xì)胞壁動(dòng)物細(xì)胞:無(wú)細(xì)胞壁4二、常用細(xì)胞破碎方法二、常用細(xì)胞破碎方法1. 1.實(shí)驗(yàn)室方法實(shí)驗(yàn)室方法( (小規(guī)模小規(guī)模) ):l 旋刀勻漿法旋刀勻漿法圖圖 通過(guò)固體剪切力進(jìn)行破碎,劇烈通過(guò)固體剪切力進(jìn)行破碎,劇烈 能完全破壞動(dòng)、植物細(xì)胞,但酵母、細(xì)菌細(xì)胞不同能完全破壞動(dòng)、植物細(xì)胞,但酵母、細(xì)菌細(xì)胞不同 注意防止升溫注意防止升溫l

3、研磨法研磨法圖圖 利用磨料與細(xì)胞間的剪切及碰撞作用,溫和,常在研缽利用磨料與細(xì)胞間的剪切及碰撞作用,溫和,常在研缽內(nèi)進(jìn)行(或細(xì)胞勻漿器)內(nèi)進(jìn)行(或細(xì)胞勻漿器) 常用磨料:石英砂、氧化鋁常用磨料:石英砂、氧化鋁 增效方法:預(yù)先冷凍樣液增效方法:預(yù)先冷凍樣液(一)機(jī)械破碎法(一)機(jī)械破碎法5旋刀勻漿器旋刀勻漿器6研磨法儀器研磨法儀器研缽研缽細(xì)胞勻漿器細(xì)胞勻漿器7l 高壓勻漿法高壓勻漿法2. 2.大規(guī)模方法大規(guī)模方法:過(guò)程:高壓過(guò)程:高壓( (可達(dá)可達(dá)50-100Mpa)50-100Mpa)噴出噴出碰撞碰撞釋放到低壓釋放到低壓高壓造成升溫高壓造成升溫2-3/10MPa2-3/10MPa,需注意冷卻料

4、液,需注意冷卻料液影響因素:壓力、循環(huán)次數(shù)、溫度影響因素:壓力、循環(huán)次數(shù)、溫度適用于酵母和絕大多數(shù)細(xì)菌,不適適用于酵母和絕大多數(shù)細(xì)菌,不適于團(tuán)狀、絲狀菌于團(tuán)狀、絲狀菌處理能力可達(dá)處理能力可達(dá)0.1-100 m3/h89l X X擠壓法(改進(jìn)的高壓勻漿法)擠壓法(改進(jìn)的高壓勻漿法) 濃縮的菌體懸浮液冷卻至濃縮的菌體懸浮液冷卻至-30 -25 -30 -25 形成冰晶體,利用形成冰晶體,利用500MPa500MPa以上的高壓沖擊以上的高壓沖擊 適用范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度低、活性保留適用范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度低、活性保留率高率高 主要用于實(shí)驗(yàn)室主要用于實(shí)驗(yàn)室 對(duì)冷凍融解敏感的

5、生物物質(zhì)不適合對(duì)冷凍融解敏感的生物物質(zhì)不適合l高速珠磨法(高速珠磨法(beadmillbeadmill)利用玻璃小珠與細(xì)胞懸液一起快速攪拌利用玻璃小珠與細(xì)胞懸液一起快速攪拌提高破碎效率的方法:提高攪拌速度、增加小珠量、降提高破碎效率的方法:提高攪拌速度、增加小珠量、降低細(xì)胞濃度、降低通過(guò)珠磨機(jī)的循環(huán)速率低細(xì)胞濃度、降低通過(guò)珠磨機(jī)的循環(huán)速率10高速珠磨機(jī)高速珠磨機(jī)113. 3. 超聲波破碎法(超聲波破碎法(ultrasoundultrasound) 超聲波振蕩器,超聲波振蕩器,15-25kHz15-25kHz的超聲波的超聲波 超聲設(shè)備:槽式,探頭式超聲設(shè)備:槽式,探頭式 圖圖 超聲波作用機(jī)理:空

6、化作用超聲波作用機(jī)理:空化作用 破碎作用影響因素:超聲波的聲強(qiáng)、頻率、處理破碎作用影響因素:超聲波的聲強(qiáng)、頻率、處理時(shí)間、液體的溫度等時(shí)間、液體的溫度等 優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)單,液量損失少。優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)單,液量損失少。 缺點(diǎn):易失活,噪聲,大容量時(shí)聲能不易傳遞、缺點(diǎn):易失活,噪聲,大容量時(shí)聲能不易傳遞、不易散熱。不易散熱。 常用間歇處理,冰浴冷卻。多在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模用。常用間歇處理,冰浴冷卻。多在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模用。12超聲設(shè)備超聲設(shè)備探頭式探頭式(超聲細(xì)胞破碎儀)(超聲細(xì)胞破碎儀)槽式槽式(超聲清洗儀)(超聲清洗儀)13l 反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法 將細(xì)胞在將細(xì)胞在-15-15下急劇凍結(jié)、室溫緩融,反復(fù)多次下急劇

7、凍結(jié)、室溫緩融,反復(fù)多次 機(jī)理機(jī)理:冷凍促進(jìn)細(xì)胞膜疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂,增強(qiáng)其親水性能;:冷凍促進(jìn)細(xì)胞膜疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂,增強(qiáng)其親水性能;胞內(nèi)水形成冰晶粒脹破細(xì)胞胞內(nèi)水形成冰晶粒脹破細(xì)胞 缺點(diǎn):溶質(zhì)釋放、擴(kuò)散慢缺點(diǎn):溶質(zhì)釋放、擴(kuò)散慢l 滲透壓破碎法(溶脹法)滲透壓破碎法(溶脹法) 機(jī)理:低滲溶液細(xì)胞溶脹,也稱(chēng)滲透壓沖擊法機(jī)理:低滲溶液細(xì)胞溶脹,也稱(chēng)滲透壓沖擊法 操作:一定體積的濃細(xì)胞液,加入操作:一定體積的濃細(xì)胞液,加入2倍體積的水中倍體積的水中 操作方法改進(jìn):細(xì)胞預(yù)先置于高滲介質(zhì)中操作方法改進(jìn):細(xì)胞預(yù)先置于高滲介質(zhì)中 特點(diǎn):最溫和,用于易破碎的細(xì)胞,如動(dòng)物細(xì)胞、特點(diǎn):最溫和,用于易破碎的細(xì)胞,如動(dòng)物

8、細(xì)胞、G-等等(二)物理破碎法(二)物理破碎法物理法總體不適于大規(guī)模生產(chǎn),物理法總體不適于大規(guī)模生產(chǎn),因破碎率低、效果較差因破碎率低、效果較差14 通過(guò)化學(xué)試劑使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。通過(guò)化學(xué)試劑使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。常用有:酸、堿、表面活性劑、有機(jī)溶劑等類(lèi)別。常用有:酸、堿、表面活性劑、有機(jī)溶劑等類(lèi)別。(三)化學(xué)破碎法(三)化學(xué)破碎法 表面活性劑、堿表面活性劑、堿溶解細(xì)胞壁上的脂質(zhì)或使細(xì)胞內(nèi)組分滲漏。溶解細(xì)胞壁上的脂質(zhì)或使細(xì)胞內(nèi)組分滲漏。表面活性劑如膽酸鹽、表面活性劑如膽酸鹽、SDSSDS、Triton X-100Triton X-100、TweenTween等。等。 酸酸

9、蛋白質(zhì)水解成氨基酸,常用蛋白質(zhì)水解成氨基酸,常用6M 6M HClHCl。 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑可溶解磷脂層,使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。如丁酯、丁醇、可溶解磷脂層,使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。如丁酯、丁醇、丙酮、氯仿、甲苯等。丙酮、氯仿、甲苯等。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):產(chǎn)物釋出性好、細(xì)胞外形完整、碎片少、胞內(nèi)雜質(zhì)釋產(chǎn)物釋出性好、細(xì)胞外形完整、碎片少、胞內(nèi)雜質(zhì)釋放少,便于后步分離放少,便于后步分離缺點(diǎn)缺點(diǎn):易引起目的物失活,可能給后續(xù)產(chǎn)物純化帶來(lái)困難,易引起目的物失活,可能給后續(xù)產(chǎn)物純化帶來(lái)困難,從而影響最終純度從而影響最終純度15細(xì)菌:溶菌酶,細(xì)菌:溶菌酶,G- G- 還需加入還需加入EDTAEDTA酵母:消解酶、酵母:消解酶、-葡

10、聚糖酶、甘露糖酶、蝸牛酶葡聚糖酶、甘露糖酶、蝸牛酶霉菌:幾丁質(zhì)酶、蝸牛酶霉菌:幾丁質(zhì)酶、蝸牛酶植物:纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶植物:纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶自溶法:細(xì)胞內(nèi)酶(調(diào)節(jié)溫度、自溶法:細(xì)胞內(nèi)酶(調(diào)節(jié)溫度、pHpH或添加有機(jī)溶或添加有機(jī)溶劑誘導(dǎo)細(xì)胞自溶)。劑誘導(dǎo)細(xì)胞自溶)。(四)酶法破碎法(四)酶法破碎法 應(yīng)用酶破壞細(xì)胞壁,可部分或完全破壞細(xì)胞壁,再應(yīng)用酶破壞細(xì)胞壁,可部分或完全破壞細(xì)胞壁,再結(jié)合其他方法破壞細(xì)胞壁。結(jié)合其他方法破壞細(xì)胞壁。n酶法優(yōu)點(diǎn)酶法優(yōu)點(diǎn):條件溫和、反應(yīng)迅速、選擇性強(qiáng);:條件溫和、反應(yīng)迅速、選擇性強(qiáng);n缺點(diǎn)缺點(diǎn):價(jià)格貴、通用性差、有時(shí)存在產(chǎn)物抑制、難適用于:價(jià)格

11、貴、通用性差、有時(shí)存在產(chǎn)物抑制、難適用于大規(guī)模工業(yè)操作,受影響因素多大規(guī)模工業(yè)操作,受影響因素多16細(xì)胞破碎率:被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞細(xì)胞破碎率:被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的百分比數(shù)。數(shù)量的百分比數(shù)。即: Y=(N0-N)/N0100% N N0 0原始細(xì)胞的數(shù)量原始細(xì)胞的數(shù)量 NN經(jīng)細(xì)胞破碎處理后余下的完整細(xì)胞數(shù)經(jīng)細(xì)胞破碎處理后余下的完整細(xì)胞數(shù)三、細(xì)胞破碎率的評(píng)價(jià)三、細(xì)胞破碎率的評(píng)價(jià)細(xì)胞數(shù)的計(jì)算方法:細(xì)胞數(shù)的計(jì)算方法:直接計(jì)數(shù)法直接計(jì)數(shù)法:血球計(jì)數(shù)板血球計(jì)數(shù)板間接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法:細(xì)胞破碎后,測(cè)定細(xì)胞懸浮液中特定細(xì)胞細(xì)胞破碎后,測(cè)定細(xì)胞懸浮液中特定細(xì)胞釋出物的濃度釋出物的濃度17應(yīng)從

12、以下方面考慮:應(yīng)從以下方面考慮:細(xì)胞的處理量細(xì)胞的處理量細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、強(qiáng)度細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、強(qiáng)度目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)破碎條件的敏感性目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)破碎條件的敏感性破碎程度破碎程度具體的操作條件應(yīng)從以下三方面進(jìn)行權(quán)衡:具體的操作條件應(yīng)從以下三方面進(jìn)行權(quán)衡: 高的產(chǎn)物釋放率高的產(chǎn)物釋放率 低的能耗低的能耗 便于后續(xù)提取便于后續(xù)提取四、細(xì)胞破碎方法的選擇依據(jù)四、細(xì)胞破碎方法的選擇依據(jù)18實(shí)際應(yīng)用中,常采用多種方法結(jié)合:實(shí)際應(yīng)用中,常采用多種方法結(jié)合:主要為機(jī)械法與非機(jī)械法的結(jié)合,如主要為機(jī)械法與非機(jī)械法的結(jié)合,如n酶酶+ +高壓勻漿高壓勻漿n酶酶+ +超聲超聲其他如:化學(xué)法其他如:化學(xué)法+ +凍融法凍融法19五、基因

13、工程包含體的純化方法五、基因工程包含體的純化方法包含體:外源基因在細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)蛋白,因此包含體:外源基因在細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)蛋白,因此凝集而成的無(wú)活性固體顆粒。凝集而成的無(wú)活性固體顆粒。 包含體為致密凝聚體,密度較大,低速離心便包含體為致密凝聚體,密度較大,低速離心便可沉淀,與細(xì)胞碎片和可溶性產(chǎn)物分離??沙恋?,與細(xì)胞碎片和可溶性產(chǎn)物分離。分離純化包含體蛋白的分離純化包含體蛋白的基本步驟基本步驟: 收集細(xì)胞收集細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞分離包含體分離包含體包含體洗滌包含體洗滌溶解包含體(目標(biāo)蛋白變性溶解)溶解包含體(目標(biāo)蛋白變性溶解)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)型蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)型復(fù)原(目標(biāo)蛋白的復(fù)性復(fù)原(目標(biāo)蛋白的復(fù)性)20溶解包含體:加變性劑溶解溶解包含體:加變性劑溶解 常用常用6 mol/L6

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