登革熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1、登革熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)登革熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)云南省寄生蟲(chóng)病防治所云南省寄生蟲(chóng)病防治所20142014年年1010月月概要概要n檢測(cè)目的檢測(cè)目的n檢測(cè)對(duì)象檢測(cè)對(duì)象n檢測(cè)內(nèi)容檢測(cè)內(nèi)容q實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)q復(fù)核檢測(cè)n檢測(cè)方法檢測(cè)方法n樣本采集、保存和運(yùn)輸樣本采集、保存和運(yùn)輸檢測(cè)目的檢測(cè)目的n及時(shí)發(fā)現(xiàn)、診斷病例。n病毒分型和溯源。n為登革熱流行趨勢(shì)的預(yù)測(cè)、預(yù)警和制定防治對(duì)策、措施提供科學(xué)依據(jù)。檢測(cè)對(duì)象檢測(cè)對(duì)象n疑似和臨床診斷病例（按照登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)WS216-2008）。檢測(cè)內(nèi)容檢測(cè)內(nèi)容n實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)q登革熱疑似病例發(fā)生所在地醫(yī)院和/或縣（市）疾控機(jī)構(gòu)采集病例血清，檢測(cè)登革病毒抗原、核酸或抗體。登革熱疑似病例實(shí)驗(yàn)

2、室檢測(cè)流程檢測(cè)內(nèi)容n復(fù)核檢測(cè)復(fù)核檢測(cè)q送州/市CDC或云南省寄生蟲(chóng)病防治所的臨床標(biāo)本，抽樣30%進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)，疫點(diǎn)首發(fā)病例需采用病原學(xué)和/或雙份標(biāo)本血清學(xué)方法復(fù)核檢測(cè)，暴發(fā)疫情復(fù)核檢測(cè)不少于5例，疫情少于5例者應(yīng)全部檢測(cè)，病毒核酸陽(yáng)性標(biāo)本應(yīng)分型檢測(cè)。q疫點(diǎn)首發(fā)病例，重癥病例、輸入病例急性期標(biāo)本應(yīng)采用PCR方法進(jìn)行分型檢測(cè)，陽(yáng)性者分離病毒，從臨床標(biāo)本或所分離病毒中擴(kuò)增E蛋白編碼基因，完成序列分析。q實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)陰性臨床病例以及重癥病例，應(yīng)對(duì)恢復(fù)期血清進(jìn)行IgM、IgG抗體和/或中和抗體檢測(cè)。檢測(cè)方法n病原學(xué)檢測(cè)病原學(xué)檢測(cè)q主要適用于急性期血液標(biāo)本。1、抗原檢測(cè)：一般發(fā)病后5天內(nèi)血液標(biāo)本NS1抗原檢

3、出率高。標(biāo)本中檢出NS1抗原可以確診病毒感染，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，可用于早期診斷2、核酸檢測(cè)：一般發(fā)病后6天內(nèi)血液標(biāo)本病毒核酸檢出率高。在病人血清中檢出病毒核酸，可確診而且能夠分型，可用于早期診斷，但核酸檢測(cè)容易因污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性，因此要求嚴(yán)格分區(qū)操作3、病毒分離：一般發(fā)病后5天內(nèi)血液標(biāo)本病毒分離率較高。將標(biāo)本接種于蚊源細(xì)胞（C6/36）或哺乳動(dòng)物細(xì)胞（BHK21、Vero）進(jìn)行分離培養(yǎng)，出現(xiàn)病變以后，用檢測(cè)抗原或核酸的方法鑒定病毒。分離到登革病毒可以確診，但其耗時(shí)長(zhǎng)，不適于快速診斷。檢測(cè)方法n血清學(xué)檢測(cè)血清學(xué)檢測(cè)q主要適用于發(fā)病5天以后血液樣本，但需注意可能與其他黃病毒感染發(fā)生交叉反應(yīng)。1、

4、血清特異性血清特異性IgM抗體：抗體：采用ELISA、免疫層析等方法檢測(cè)。IgM抗體陽(yáng)性，提示患者可能新近感染登革病毒，適用于登革熱早期診斷，但單份標(biāo)本不能確診2、血清特異性血清特異性IgG抗體：抗體：采用ELISA、免疫熒光（IFA）、免疫層析等方法檢測(cè)?；颊呋謴?fù)期血清 IgG 抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4倍及以上升高可以確診3、中和抗體：采用空斑減少中和實(shí)驗(yàn)、微量中和實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)，可用于分型。患者恢復(fù)期血清中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4倍及以上升高可以確診。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒NS1抗原抗原 n檢測(cè)儀器設(shè)備和材料檢測(cè)儀器設(shè)備和材料q加樣器、溫箱、洗板機(jī)、含波長(zhǎng)450

5、nm的酶標(biāo)儀、登革病毒抗原檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒NS1抗原抗原n操作步驟操作步驟1 、將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡30分鐘，使用前將試劑輕輕震蕩混勻。2 、配液：將試劑盒中濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋。3 、編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔板編號(hào)，每板設(shè)陰性對(duì)照3孔，陽(yáng)性對(duì)照2孔和空白對(duì)照1孔。4 、加稀釋液：每孔加稀釋液50L，空白孔除外。5 、加樣：分別在相應(yīng)孔加入待測(cè)樣品或陰陽(yáng)性對(duì)照各50L，空白孔除外。6、 溫育：用封板膜封板后，置37溫育60分鐘。7 、每孔加酶標(biāo)試劑50L，空白孔除外，輕輕震蕩混勻。8、 溫育：用封板膜封板后，置37溫育30分

6、鐘。9 、洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量扣干。10、顯色：每孔加入顯色劑A、B液各50L，輕輕震蕩混勻，37避光顯色15分鐘。11、測(cè)定：每孔加終止液50L，10分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果。設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)于450nm處（建議使用雙波長(zhǎng)450nm/600-650nm檢測(cè)），用空白孔調(diào)零后測(cè)定各孔A值。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒NS1抗原抗原n結(jié)果判定結(jié)果判定1、 臨界值計(jì)算：臨界值=0.10+陰性對(duì)照孔A值均值（陰性對(duì)照孔A值低于0.05者以0.05計(jì)算）。2 、陰性對(duì)照的正常值范圍：陰性對(duì)照孔A0.1（若1孔A大于0.1應(yīng)舍棄，若兩孔或兩孔以上陰性對(duì)照大于0.1，應(yīng)

7、重復(fù)實(shí)驗(yàn)）。3 、陽(yáng)性對(duì)照正常值范圍：A0.8.4、陽(yáng)性判定：樣品A值臨界值者為登革病毒抗原陽(yáng)性。5、陰性判定：樣品A值臨界值者為登革病毒抗原陰性。n意義意義q結(jié)合臨床信息，陽(yáng)性結(jié)果可以診斷為登革病毒感染，但陰性結(jié)果并不排除登革病毒感染的可能。膠體金免疫層析法檢測(cè)登革病毒膠體金免疫層析法檢測(cè)登革病毒NS1抗原抗原 n檢測(cè)儀器設(shè)備和材料檢測(cè)儀器設(shè)備和材料q加樣器、登革熱病毒抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）n檢測(cè)步驟檢測(cè)步驟1 、將試劑盒和待檢樣本自冰箱中取出平衡至室溫。2 、當(dāng)準(zhǔn)備好測(cè)試時(shí)，打開(kāi)密封的鋁箔袋，取出檢測(cè)卡，平放于水平桌面上。3 、在檢測(cè)卡上標(biāo)記病人的樣本號(hào)。4 、加樣：用滴管從樣本中取1

8、滴（約30-45L）血清或血漿標(biāo)本，加于檢測(cè)卡/條上的加樣區(qū)內(nèi)，另外加1滴（約30-45L）稀釋液，保證操作過(guò)程中沒(méi)有氣泡產(chǎn)生。（如果加樣后30秒鐘，沒(méi)有看到樣本移動(dòng)，可能是由于樣本太黏稠，可在樣本加樣孔內(nèi)再加1滴樣本稀釋液。5、 加入樣本后20-25分鐘內(nèi)判讀結(jié)果，并將結(jié)果拍照。膠體金免疫層析法檢測(cè)登革病毒膠體金免疫層析法檢測(cè)登革病毒NS1抗原抗原 n結(jié)果判定結(jié)果判定1 、陰性結(jié)果：僅質(zhì)控線C出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)條帶。2 、陽(yáng)性結(jié)果：質(zhì)控線C和檢測(cè)線T均出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)條帶。3 、無(wú)效結(jié)果：未肉眼可見(jiàn)的質(zhì)控線C4 、質(zhì)量控制：如遇下列情況，請(qǐng)按上述操作步驟使用實(shí)驗(yàn)室備用的陽(yáng)性和陰性樣本對(duì)該批產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量

9、控制： 4.1 、新檢驗(yàn)員使用本產(chǎn)品。 4.2 、使用新批號(hào)產(chǎn)品。 4.3 、試劑卡儲(chǔ)存溫度在2-30以外。 4.4 、測(cè)試區(qū)溫度在2-30以外。n9 意義意義q陽(yáng)性結(jié)果說(shuō)明檢測(cè)到登革病毒抗原，結(jié)合臨床可以診斷為登革病毒感染；陰性結(jié)果說(shuō)明沒(méi)有檢測(cè)到登革病毒抗原，但不能排除登革陰性結(jié)果說(shuō)明沒(méi)有檢測(cè)到登革病毒抗原，但不能排除登革病毒感染。病毒感染。NS1快速診斷卡的使用NS1快速診斷卡的使用NS1快速診斷卡的使用NS1快速診斷卡的使用IgM捕捉捕捉ELISA法（法（MacELISA）檢測(cè)登革）檢測(cè)登革熱熱IgM抗體抗體n檢測(cè)儀器設(shè)備和材料檢測(cè)儀器設(shè)備和材料q加樣器、溫箱、洗板機(jī)、含波長(zhǎng)450nm的

10、酶標(biāo)儀、登革病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒，或?qū)嶒?yàn)室自備材料：1 、抗原：q陽(yáng)性抗原：采用C6/36細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽(yáng)性抗原。q陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36細(xì)胞為陰性抗原對(duì)照。2、抗人IgM（鏈）單克隆抗體或多克隆抗體；3、登革病毒IgM陽(yáng)性、陰性對(duì)照血清；4、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記登革病毒單克隆抗體；5、緩沖液：q洗滌液：pH7.4 PBST（0.05吐溫20）；q稀釋液：pH7.4 PBS（5牛血清）；q封閉液：pH9.6 碳酸緩沖液（1牛血清白蛋白）；6、顯色液：A/B液7、終止液：4N H2SO4IgM捕捉捕捉ELISA法（法（MacELISA）檢測(cè)登革）檢測(cè)登革熱熱IgM抗體抗

11、體n檢測(cè)步驟檢測(cè)步驟1、 用稀釋液按效價(jià)稀釋抗人鏈單克隆抗體，100l/孔，加蓋，4過(guò)夜；2 、棄去抗人鏈，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加封閉液，100l/孔，置37水浴孵育2小時(shí)；3 、棄封閉液，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干。4 、將待檢血清用稀釋液從1：10開(kāi)始作2或4倍連續(xù)稀釋?zhuān)尤朊笜?biāo)板孔中，100l/孔，同時(shí)加入已1：10稀釋的陽(yáng)性血清、陰性血清對(duì)照各4孔，100l/孔，置37水浴孵育2小時(shí)；5 、棄去血清，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，分別加4個(gè)型DV抗原及陰性抗原對(duì)照，100l/孔，4過(guò)夜；6 、棄抗原，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加用稀釋液稀釋至工作濃度的相應(yīng)的登革熱酶標(biāo)單克隆抗體，正?？?/p>

12、原加4個(gè)型混合的酶標(biāo)單克隆抗體，100l/孔，37水浴2小時(shí)；7 、棄去標(biāo)記物，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B液各一滴，37，避光35分鐘；8 、加終止液于每反應(yīng)孔，一滴/孔。IgM捕捉捕捉ELISA法（法（MacELISA）檢測(cè)登革）檢測(cè)登革熱熱IgM抗體抗體n結(jié)果判斷結(jié)果判斷1、目測(cè)方法：q陽(yáng)性對(duì)照孔呈明顯藍(lán)色，陰性對(duì)照孔呈無(wú)色，對(duì)照成立；若待檢血清孔呈明顯淡藍(lán)色或深藍(lán)色（TMB），則標(biāo)本為登革熱IgM抗體陽(yáng)性，反之陰性。2、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)：q于450nm（TMB）陽(yáng)性對(duì)照孔OD值/陰性對(duì)照孔OD值，即P/N2.1，對(duì)照成立；若待檢血清孔OD值與陰性對(duì)照孔OD比值2.1

13、，則標(biāo)本為登革熱IgM抗體陽(yáng)性，反之陰性。（陰性對(duì)照孔OD值小于0.05按0.05記，若大于0.05按實(shí)際數(shù)值計(jì)算）酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒IgG抗體抗體n檢測(cè)儀器設(shè)備和材料檢測(cè)儀器設(shè)備和材料q加樣器、溫箱、洗板機(jī)、含波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀、登革病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒，或?qū)嶒?yàn)室自備材料：1 、抗原：q陽(yáng)性抗原：采用C6/36細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽(yáng)性抗原。q陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36細(xì)胞為陰性抗原對(duì)照。2 、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體；3 、緩沖液：q包被液：pH9.6碳酸緩沖液；q稀釋液：pH7.4 PBS（含5%脫脂奶）q洗滌液：pH7.4 PBS

14、T（0.05吐溫20）；4 、顯色液：A/B液5 、終止液：4NH2SO46 、酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒IgG抗體抗體n檢測(cè)步驟檢測(cè)步驟1、 用包被液按工作濃度稀釋抗原，100l/孔，4過(guò)夜；2 、棄去包被液，用PBS-T重復(fù)洗滌35次，甩干；3 、將待檢血清用稀釋液從1：100開(kāi)始作2或4倍連續(xù)稀釋?zhuān)尤肟乖祝?00l/孔，同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照，37水浴1小時(shí)；4 、棄去血清，用洗滌液洗滌56次；5 、加酶結(jié)合物，用稀釋液按工作濃度稀釋?zhuān)?00l/孔，37水浴1小時(shí)；6 、棄去酶標(biāo)抗體，用洗滌液洗滌6次，甩干；7 、加顯色液：于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B液各一滴，

15、37，避光35分鐘；8 、加終止液于每反應(yīng)孔，100l /孔。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒IgG抗體抗體n 結(jié)果判斷結(jié)果判斷q于450nm（TMB）陽(yáng)性對(duì)照孔OD值/陰性對(duì)照孔OD值，即P/N2.1，對(duì)照成立；若待檢血清孔OD值與陰性對(duì)照孔OD比值2.1，則標(biāo)本為登革熱IgG抗體陽(yáng)性，反之陰性。（陰性對(duì)照孔OD值小于0.05按0.05記，若大于0.05按實(shí)際數(shù)值計(jì)算）n意義意義q陽(yáng)性結(jié)果，表明曾受到DV感染；恢復(fù)期血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，或抗體滴度比急性期抗體滴度有4倍及以上升高則可確診。免疫熒光法檢測(cè)登革病毒免疫熒光法檢測(cè)登革病毒IgG抗體抗體n檢測(cè)儀器設(shè)備和材料檢測(cè)儀器設(shè)備和材料1、

16、 DV14型抗原片：DV標(biāo)準(zhǔn)毒株感染VERO或BHK21細(xì)胞制備，低溫干燥保存；2 、對(duì)照：登革熱患者恢復(fù)期血清（陽(yáng)性對(duì)照），非登革熱患者血清陰性對(duì)照)；3 、羊抗人（或兔抗人）IgG熒光素標(biāo)記抗體；4 、常用稀釋液：pH7.27.4PBS、伊文思蘭等；5 、熒光顯微鏡。免疫熒光法檢測(cè)登革病毒免疫熒光法檢測(cè)登革病毒IgG抗體抗體n檢驗(yàn)步驟：檢驗(yàn)步驟：1 、用pH7.4，0.02mol/L PBS稀釋待檢血清，從1:20開(kāi)始做2倍連續(xù)稀釋至需要的稀釋度。2 、取出抗原片，用蒸餾水漂洗后，風(fēng)干。3 、用加樣器依次從高稀釋度到低稀釋度逐個(gè)加入已稀釋的待檢血清，加入量以覆蓋細(xì)胞抗原面為準(zhǔn)（若為雙份血清

17、，最好上排為急性期血清，下排為恢復(fù)期血清），在37水浴箱濕盒孵育30分鐘（每次試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陽(yáng)、陰性對(duì)照）。4 、用PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，再用蒸餾水洗滌1次脫鹽，風(fēng)干。5 、用含1：3萬(wàn)的伊文思蘭PBS按工作濃度稀釋熒光結(jié)合物，滴加各孔（以覆蓋細(xì)胞抗原面為準(zhǔn)），在37 水浴箱濕盒孵育30分鐘，然后同（4）洗滌、漂洗、吹干。6 、熒光顯微鏡觀察結(jié)果。免疫熒光法檢測(cè)登革病毒免疫熒光法檢測(cè)登革病毒IgG抗體抗體n結(jié)果判斷：結(jié)果判斷：q細(xì)胞內(nèi)病毒特異性熒光為黃綠色顆粒，分布在感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)。根據(jù)特異性熒光顆粒多少、熒光亮度、陽(yáng)性細(xì)胞在細(xì)胞總數(shù)中所占比例，可將免疫熒光反應(yīng)大致區(qū)分為14個(gè)“+”。可參考陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：75%為“+”；無(wú)特異性熒光者為“”（陰性）。檢測(cè)抗體滴度時(shí)，以能觀察到明顯特異性熒光反應(yīng)（“+”）最高血清稀釋度的倒數(shù)表示。n意義：意義：q陽(yáng)性結(jié)果，表明曾受到登革病毒感染，恢復(fù)期血清抗體滴度比急性期抗體滴度有4倍或4倍以上升高則可確診。IgG/ IgM快卡的使用快卡的使用n實(shí)驗(yàn)