登革熱實驗室檢測

1、登革熱實驗室檢測登革熱實驗室檢測云南省寄生蟲病防治所云南省寄生蟲病防治所20142014年年1010月月概要概要n檢測目的檢測目的n檢測對象檢測對象n檢測內(nèi)容檢測內(nèi)容q實驗室檢測q復(fù)核檢測n檢測方法檢測方法n樣本采集、保存和運輸樣本采集、保存和運輸檢測目的檢測目的n及時發(fā)現(xiàn)、診斷病例。n病毒分型和溯源。n為登革熱流行趨勢的預(yù)測、預(yù)警和制定防治對策、措施提供科學依據(jù)。檢測對象檢測對象n疑似和臨床診斷病例（按照登革熱診斷標準WS216-2008）。檢測內(nèi)容檢測內(nèi)容n實驗室檢測實驗室檢測q登革熱疑似病例發(fā)生所在地醫(yī)院和/或縣（市）疾控機構(gòu)采集病例血清，檢測登革病毒抗原、核酸或抗體。登革熱疑似病例實驗

2、室檢測流程檢測內(nèi)容n復(fù)核檢測復(fù)核檢測q送州/市CDC或云南省寄生蟲病防治所的臨床標本，抽樣30%進行復(fù)核檢測，疫點首發(fā)病例需采用病原學和/或雙份標本血清學方法復(fù)核檢測，暴發(fā)疫情復(fù)核檢測不少于5例，疫情少于5例者應(yīng)全部檢測，病毒核酸陽性標本應(yīng)分型檢測。q疫點首發(fā)病例，重癥病例、輸入病例急性期標本應(yīng)采用PCR方法進行分型檢測，陽性者分離病毒，從臨床標本或所分離病毒中擴增E蛋白編碼基因，完成序列分析。q實驗室檢測陰性臨床病例以及重癥病例，應(yīng)對恢復(fù)期血清進行IgM、IgG抗體和/或中和抗體檢測。檢測方法n病原學檢測病原學檢測q主要適用于急性期血液標本。1、抗原檢測：一般發(fā)病后5天內(nèi)血液標本NS1抗原檢

3、出率高。標本中檢出NS1抗原可以確診病毒感染，適用于現(xiàn)場快速檢測，可用于早期診斷2、核酸檢測：一般發(fā)病后6天內(nèi)血液標本病毒核酸檢出率高。在病人血清中檢出病毒核酸，可確診而且能夠分型，可用于早期診斷，但核酸檢測容易因污染而產(chǎn)生假陽性，因此要求嚴格分區(qū)操作3、病毒分離：一般發(fā)病后5天內(nèi)血液標本病毒分離率較高。將標本接種于蚊源細胞（C6/36）或哺乳動物細胞（BHK21、Vero）進行分離培養(yǎng)，出現(xiàn)病變以后，用檢測抗原或核酸的方法鑒定病毒。分離到登革病毒可以確診，但其耗時長，不適于快速診斷。檢測方法n血清學檢測血清學檢測q主要適用于發(fā)病5天以后血液樣本，但需注意可能與其他黃病毒感染發(fā)生交叉反應(yīng)。1、

4、血清特異性血清特異性IgM抗體：抗體：采用ELISA、免疫層析等方法檢測。IgM抗體陽性，提示患者可能新近感染登革病毒，適用于登革熱早期診斷，但單份標本不能確診2、血清特異性血清特異性IgG抗體：抗體：采用ELISA、免疫熒光（IFA）、免疫層析等方法檢測?；颊呋謴?fù)期血清 IgG 抗體陽轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4倍及以上升高可以確診3、中和抗體：采用空斑減少中和實驗、微量中和實驗等方法檢測，可用于分型?；颊呋謴?fù)期血清中和抗體陽轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4倍及以上升高可以確診。酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒NS1抗原抗原 n檢測儀器設(shè)備和材料檢測儀器設(shè)備和材料q加樣器、溫箱、洗板機、含波長450

5、nm的酶標儀、登革病毒抗原檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒NS1抗原抗原n操作步驟操作步驟1 、將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡30分鐘，使用前將試劑輕輕震蕩混勻。2 、配液：將試劑盒中濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋。3 、編號：將樣品對應(yīng)微孔板編號，每板設(shè)陰性對照3孔，陽性對照2孔和空白對照1孔。4 、加稀釋液：每孔加稀釋液50L，空白孔除外。5 、加樣：分別在相應(yīng)孔加入待測樣品或陰陽性對照各50L，空白孔除外。6、 溫育：用封板膜封板后，置37溫育60分鐘。7 、每孔加酶標試劑50L，空白孔除外，輕輕震蕩混勻。8、 溫育：用封板膜封板后，置37溫育30分

6、鐘。9 、洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌5遍，最后一次盡量扣干。10、顯色：每孔加入顯色劑A、B液各50L，輕輕震蕩混勻，37避光顯色15分鐘。11、測定：每孔加終止液50L，10分鐘內(nèi)測定結(jié)果。設(shè)定酶標儀波長于450nm處（建議使用雙波長450nm/600-650nm檢測），用空白孔調(diào)零后測定各孔A值。酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒NS1抗原抗原n結(jié)果判定結(jié)果判定1、 臨界值計算：臨界值=0.10+陰性對照孔A值均值（陰性對照孔A值低于0.05者以0.05計算）。2 、陰性對照的正常值范圍：陰性對照孔A0.1（若1孔A大于0.1應(yīng)舍棄，若兩孔或兩孔以上陰性對照大于0.1，應(yīng)

7、重復(fù)實驗）。3 、陽性對照正常值范圍：A0.8.4、陽性判定：樣品A值臨界值者為登革病毒抗原陽性。5、陰性判定：樣品A值臨界值者為登革病毒抗原陰性。n意義意義q結(jié)合臨床信息，陽性結(jié)果可以診斷為登革病毒感染，但陰性結(jié)果并不排除登革病毒感染的可能。膠體金免疫層析法檢測登革病毒膠體金免疫層析法檢測登革病毒NS1抗原抗原 n檢測儀器設(shè)備和材料檢測儀器設(shè)備和材料q加樣器、登革熱病毒抗原檢測試劑盒（膠體金法）n檢測步驟檢測步驟1 、將試劑盒和待檢樣本自冰箱中取出平衡至室溫。2 、當準備好測試時，打開密封的鋁箔袋，取出檢測卡，平放于水平桌面上。3 、在檢測卡上標記病人的樣本號。4 、加樣：用滴管從樣本中取1

8、滴（約30-45L）血清或血漿標本，加于檢測卡/條上的加樣區(qū)內(nèi)，另外加1滴（約30-45L）稀釋液，保證操作過程中沒有氣泡產(chǎn)生。（如果加樣后30秒鐘，沒有看到樣本移動，可能是由于樣本太黏稠，可在樣本加樣孔內(nèi)再加1滴樣本稀釋液。5、 加入樣本后20-25分鐘內(nèi)判讀結(jié)果，并將結(jié)果拍照。膠體金免疫層析法檢測登革病毒膠體金免疫層析法檢測登革病毒NS1抗原抗原 n結(jié)果判定結(jié)果判定1 、陰性結(jié)果：僅質(zhì)控線C出現(xiàn)肉眼可見條帶。2 、陽性結(jié)果：質(zhì)控線C和檢測線T均出現(xiàn)肉眼可見條帶。3 、無效結(jié)果：未肉眼可見的質(zhì)控線C4 、質(zhì)量控制：如遇下列情況，請按上述操作步驟使用實驗室備用的陽性和陰性樣本對該批產(chǎn)品進行質(zhì)量

9、控制： 4.1 、新檢驗員使用本產(chǎn)品。 4.2 、使用新批號產(chǎn)品。 4.3 、試劑卡儲存溫度在2-30以外。 4.4 、測試區(qū)溫度在2-30以外。n9 意義意義q陽性結(jié)果說明檢測到登革病毒抗原，結(jié)合臨床可以診斷為登革病毒感染；陰性結(jié)果說明沒有檢測到登革病毒抗原，但不能排除登革陰性結(jié)果說明沒有檢測到登革病毒抗原，但不能排除登革病毒感染。病毒感染。NS1快速診斷卡的使用NS1快速診斷卡的使用NS1快速診斷卡的使用NS1快速診斷卡的使用IgM捕捉捕捉ELISA法（法（MacELISA）檢測登革）檢測登革熱熱IgM抗體抗體n檢測儀器設(shè)備和材料檢測儀器設(shè)備和材料q加樣器、溫箱、洗板機、含波長450nm的

10、酶標儀、登革病毒IgM抗體檢測試劑盒，或?qū)嶒炇易詡洳牧希? 、抗原：q陽性抗原：采用C6/36細胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽性抗原。q陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36細胞為陰性抗原對照。2、抗人IgM（鏈）單克隆抗體或多克隆抗體；3、登革病毒IgM陽性、陰性對照血清；4、辣根過氧化物酶標記登革病毒單克隆抗體；5、緩沖液：q洗滌液：pH7.4 PBST（0.05吐溫20）；q稀釋液：pH7.4 PBS（5牛血清）；q封閉液：pH9.6 碳酸緩沖液（1牛血清白蛋白）；6、顯色液：A/B液7、終止液：4N H2SO4IgM捕捉捕捉ELISA法（法（MacELISA）檢測登革）檢測登革熱熱IgM抗體抗

11、體n檢測步驟檢測步驟1、 用稀釋液按效價稀釋抗人鏈單克隆抗體，100l/孔，加蓋，4過夜；2 、棄去抗人鏈，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加封閉液，100l/孔，置37水浴孵育2小時；3 、棄封閉液，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干。4 、將待檢血清用稀釋液從1：10開始作2或4倍連續(xù)稀釋，加入酶標板孔中，100l/孔，同時加入已1：10稀釋的陽性血清、陰性血清對照各4孔，100l/孔，置37水浴孵育2小時；5 、棄去血清，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，分別加4個型DV抗原及陰性抗原對照，100l/孔，4過夜；6 、棄抗原，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加用稀釋液稀釋至工作濃度的相應(yīng)的登革熱酶標單克隆抗體，正?？?/p>

12、原加4個型混合的酶標單克隆抗體，100l/孔，37水浴2小時；7 、棄去標記物，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B液各一滴，37，避光35分鐘；8 、加終止液于每反應(yīng)孔，一滴/孔。IgM捕捉捕捉ELISA法（法（MacELISA）檢測登革）檢測登革熱熱IgM抗體抗體n結(jié)果判斷結(jié)果判斷1、目測方法：q陽性對照孔呈明顯藍色，陰性對照孔呈無色，對照成立；若待檢血清孔呈明顯淡藍色或深藍色（TMB），則標本為登革熱IgM抗體陽性，反之陰性。2、酶聯(lián)免疫檢測儀檢測：q于450nm（TMB）陽性對照孔OD值/陰性對照孔OD值，即P/N2.1，對照成立；若待檢血清孔OD值與陰性對照孔OD比值2.1

13、，則標本為登革熱IgM抗體陽性，反之陰性。（陰性對照孔OD值小于0.05按0.05記，若大于0.05按實際數(shù)值計算）酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒IgG抗體抗體n檢測儀器設(shè)備和材料檢測儀器設(shè)備和材料q加樣器、溫箱、洗板機、含波長450nm的酶標儀、登革病毒IgG抗體檢測試劑盒，或?qū)嶒炇易詡洳牧希? 、抗原：q陽性抗原：采用C6/36細胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽性抗原。q陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36細胞為陰性抗原對照。2 、辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體；3 、緩沖液：q包被液：pH9.6碳酸緩沖液；q稀釋液：pH7.4 PBS（含5%脫脂奶）q洗滌液：pH7.4 PBS

14、T（0.05吐溫20）；4 、顯色液：A/B液5 、終止液：4NH2SO46 、酶標板、酶標儀。酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒IgG抗體抗體n檢測步驟檢測步驟1、 用包被液按工作濃度稀釋抗原，100l/孔，4過夜；2 、棄去包被液，用PBS-T重復(fù)洗滌35次，甩干；3 、將待檢血清用稀釋液從1：100開始作2或4倍連續(xù)稀釋，加入抗原孔，100l/孔，同時設(shè)陰、陽性對照，37水浴1小時；4 、棄去血清，用洗滌液洗滌56次；5 、加酶結(jié)合物，用稀釋液按工作濃度稀釋，100l/孔，37水浴1小時；6 、棄去酶標抗體，用洗滌液洗滌6次，甩干；7 、加顯色液：于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B液各一滴，

15、37，避光35分鐘；8 、加終止液于每反應(yīng)孔，100l /孔。酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒IgG抗體抗體n 結(jié)果判斷結(jié)果判斷q于450nm（TMB）陽性對照孔OD值/陰性對照孔OD值，即P/N2.1，對照成立；若待檢血清孔OD值與陰性對照孔OD比值2.1，則標本為登革熱IgG抗體陽性，反之陰性。（陰性對照孔OD值小于0.05按0.05記，若大于0.05按實際數(shù)值計算）n意義意義q陽性結(jié)果，表明曾受到DV感染；恢復(fù)期血清抗體陽轉(zhuǎn)，或抗體滴度比急性期抗體滴度有4倍及以上升高則可確診。免疫熒光法檢測登革病毒免疫熒光法檢測登革病毒IgG抗體抗體n檢測儀器設(shè)備和材料檢測儀器設(shè)備和材料1、

16、 DV14型抗原片：DV標準毒株感染VERO或BHK21細胞制備，低溫干燥保存；2 、對照：登革熱患者恢復(fù)期血清（陽性對照），非登革熱患者血清陰性對照)；3 、羊抗人（或兔抗人）IgG熒光素標記抗體；4 、常用稀釋液：pH7.27.4PBS、伊文思蘭等；5 、熒光顯微鏡。免疫熒光法檢測登革病毒免疫熒光法檢測登革病毒IgG抗體抗體n檢驗步驟：檢驗步驟：1 、用pH7.4，0.02mol/L PBS稀釋待檢血清，從1:20開始做2倍連續(xù)稀釋至需要的稀釋度。2 、取出抗原片，用蒸餾水漂洗后，風干。3 、用加樣器依次從高稀釋度到低稀釋度逐個加入已稀釋的待檢血清，加入量以覆蓋細胞抗原面為準（若為雙份血清

17、，最好上排為急性期血清，下排為恢復(fù)期血清），在37水浴箱濕盒孵育30分鐘（每次試驗同時設(shè)陽、陰性對照）。4 、用PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，再用蒸餾水洗滌1次脫鹽，風干。5 、用含1：3萬的伊文思蘭PBS按工作濃度稀釋熒光結(jié)合物，滴加各孔（以覆蓋細胞抗原面為準），在37 水浴箱濕盒孵育30分鐘，然后同（4）洗滌、漂洗、吹干。6 、熒光顯微鏡觀察結(jié)果。免疫熒光法檢測登革病毒免疫熒光法檢測登革病毒IgG抗體抗體n結(jié)果判斷：結(jié)果判斷：q細胞內(nèi)病毒特異性熒光為黃綠色顆粒，分布在感染細胞的胞漿內(nèi)。根據(jù)特異性熒光顆粒多少、熒光亮度、陽性細胞在細胞總數(shù)中所占比例，可將免疫熒光反應(yīng)大致區(qū)分為14個“+”?？蓞⒖缄栃约毎麛?shù)：75%為“+”；無特異性熒光者為“”（陰性）。檢測抗體滴度時，以能觀察到明顯特異性熒光反應(yīng)（“+”）最高血清稀釋度的倒數(shù)表示。n意義：意義：q陽性結(jié)果，表明曾受到登革病毒感染，恢復(fù)期血清抗體滴度比急性期抗體滴度有4倍或4倍以上升高則可確診。IgG/ IgM快卡的使用快卡的使用n實驗