植物病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

1、 植物病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展 劉茂炎 摘要：隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展特別是分子技術(shù)的發(fā)展，鑒定和檢測(cè)病毒的方法越來越多，也越來越精確快速。以PCR為基礎(chǔ)的基因工程技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒核酸分子的鑒定，其高靈敏度和高特異性是與PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性引物相關(guān)聯(lián)的；于此同時(shí)傳統(tǒng)的鑒定檢測(cè)技術(shù)依然有其發(fā)展優(yōu)勢(shì)。不論怎樣的方法技術(shù)，都是以病毒的理化性質(zhì)以及侵染性為基礎(chǔ)的。在此基礎(chǔ)上，甚至出現(xiàn)了某些邊緣技術(shù)在病毒鑒定檢測(cè)方面的應(yīng)用。本文主要綜述的是對(duì)植物病毒鑒定檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展。 關(guān)鍵詞：植物病毒； 檢測(cè)技術(shù)； PCR 病毒在生物學(xué)上特征（如病毒的理化性質(zhì)，包括病毒粒子的形態(tài)、大小、對(duì)理化因子的耐受性等）以及在

2、寄主上的反應(yīng)（如寄主范圍、癥狀表現(xiàn)、傳播方式等）是對(duì)病毒最直觀的認(rèn)識(shí)。常規(guī)的對(duì)植物病毒的鑒定檢測(cè)方法有：生物學(xué)測(cè)定方法、血清學(xué)技術(shù)、電子顯微鏡技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)等。生物學(xué)測(cè)定依據(jù)病毒的侵染性，觀察寄主植株或其它生物的癥狀表現(xiàn)；血清學(xué)技術(shù)以病毒外殼蛋白(CP)為基礎(chǔ)；電子顯微鏡技術(shù)依據(jù)病毒的形狀大小的不同；分子生物學(xué)鑒定則以病毒核酸為基礎(chǔ)。1. 生物學(xué)鑒定最直接的方法是目測(cè)法，直接觀察病毒對(duì)植物的病害癥狀。如煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害癥狀為葉上出現(xiàn)花葉癥狀，生長陷于不良狀態(tài)，葉常呈畸形；玉米鼠耳病的診斷主要依據(jù)田間癥狀表現(xiàn)1。目測(cè)法因觀察的主觀性和癥

3、狀的不確定性的影響而不精準(zhǔn)。1929年美國病毒學(xué)家霍姆斯（Holmes） 用感病的植物葉片粗提液接種指示植物，23天后接種葉片出現(xiàn)圓形枯斑，枯斑數(shù)與侵染性病毒的濃度成正比，能測(cè)出病毒的相對(duì)侵染力，對(duì)病毒的定性有著重要的意義，這種人工接種鑒定的方法就是枯斑和指示植物檢測(cè)法。國內(nèi)報(bào)道的水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28屬57種禾本科植物，該病毒的主要傳毒介體是灰飛虱(Laodelphax striatella)，玉米是灰飛虱的橋梁寄主而非最適寄主2，以玉米作為指示植物可以良好地鑒定RBSDV。目前接種鑒定的方法主要有四種

4、：粉風(fēng)接種鑒定、嫁接接種鑒定、農(nóng)桿菌接種鑒定、基因槍轟擊法接種鑒定(葉青靜等,2009)。后兩種鑒定方法涉及到了分子克隆技術(shù)，是傳統(tǒng)方法與基因工程技術(shù)的結(jié)合。用農(nóng)桿菌接種法將番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus disease, TYLCD )導(dǎo)入葉盤和整個(gè)植株,TYLCV在植株中進(jìn)行系統(tǒng)侵染，誘導(dǎo)致病癥狀，同時(shí)此法還可以用來篩選抗TYLCV的植株3。2. 免疫-血清檢測(cè)方法 2.1.血清學(xué)檢測(cè)法 目前血清學(xué)技術(shù)依然是植物病毒病原檢測(cè)中最常用的方法之一，它是上世紀(jì)世紀(jì)六七十年代誕生的病毒檢測(cè)技術(shù)，此類技術(shù)的原理主要根據(jù)病毒的侵染性以及其作為核蛋白的特性而

5、設(shè)計(jì)的，利用血清中可以和具有某種特定結(jié)構(gòu)特征的病毒結(jié)合的抗體，從而進(jìn)行病毒的定性定量分析。其中重要的一些方法有：補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定法（補(bǔ)體能在抗體存在的情況下通過補(bǔ)體的酶作用溶解紅細(xì)胞和革蘭氏陰性菌）、沉淀法（不同病毒類型在電解質(zhì)存在時(shí)抗體與同源抗原相互結(jié)合形成的沉淀也不同）等。利用基因工程的方法從大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)中高效表達(dá)病毒的外殼蛋白， 純化表達(dá)產(chǎn)物制備抗血清具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可彌補(bǔ)常規(guī)方法的不足4。 2.2.酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）也是利用特異抗體吸附病毒顆粒的原理，只是在抗體上附帶了酶標(biāo)記，從而使反應(yīng)可以有顏色強(qiáng)弱的變化，利于

6、定時(shí)定量監(jiān)測(cè)病毒濃度。此法靈敏度高，且不受濃度范圍或其他抑制劑的干擾。ELISA基本類型主要有間接法(I-ELISA)和直接法(DAS-ELISA也叫雙抗體夾心ELISA)5 、三抗體夾心ELISA(TAS-ELISA)等(Accotto et al., 2000; Accotto&Noris, 2007;孫偉等,2002)。其中TAS-ELISA是檢測(cè)TYLCV常用和有效的手段之一。1976 年Voller等首次將 ELISA 方法用于檢測(cè)植物病毒，Clark 和 Adams 等6在1977年首次對(duì)植物病毒病原利用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行了鑒定。ELISA 方法可以檢測(cè)出 0.110 ng/mL 的病

7、毒，特異性很強(qiáng)、操作簡單、簡便有效，國內(nèi)外已研發(fā)出許多商品化的 ELISA 試劑盒7-10。因此，在植物病毒檢測(cè)中 ELISA技術(shù)也廣泛地應(yīng)用于病毒病的鑒定和進(jìn)出口檢疫上。這種酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)是結(jié)合了酶的高效催化作用和抗原抗體的免疫反應(yīng)，酶與抗體通過化學(xué)方法相結(jié)合而形成酶標(biāo)抗體，酶標(biāo)記抗體直接與包被在固體支持物上的待測(cè)抗原或抗體特異性結(jié)合或通過免疫橋特異性結(jié)合，再在酶的作用下使底物產(chǎn)生有顏色或高電子密度的可溶性產(chǎn)物，結(jié)果通過肉眼或比色法來進(jìn)行定性的測(cè)定，從而得到抗體的性質(zhì)和數(shù)量。2.3.基于酶聯(lián)免疫吸附法的新技術(shù) 2.3.1組織印跡法此方法包括斑點(diǎn)免疫結(jié)合測(cè)定法(DIBA-ELI

8、SA 或 dot-ELISA)、直接組織斑點(diǎn)免疫測(cè)定(IDDTB-ELISA)等11。這些技術(shù)直接將組織印跡在膜上, 不僅保持了 ELISA 的靈敏性和特異性等特點(diǎn), 而且簡化了操作程序, 使病毒檢測(cè)更加快速、簡單、方便, 且印跡在硝酸纖維膜上的樣品保存時(shí)間較長, 檢測(cè)結(jié)果能直觀地顯示出病毒感染的部位, 適用于植物病毒的大規(guī)模普查。 2.3.2免疫毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù) 免疫技術(shù)與電泳技術(shù)結(jié)合發(fā)展出了免疫毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)(Immuno Capillary Zone Electrophoresis,I- CZE)。I-CZE 將血清學(xué)反應(yīng)的?；院兔?xì)管區(qū)帶電泳的靈敏、快速、可自動(dòng)檢測(cè)等特點(diǎn)結(jié)合起

9、來, 實(shí)時(shí)檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合體，I-CZE 可快速分析多個(gè)樣品, 因而在苗木帶毒檢測(cè)、植物檢疫等方面可發(fā)揮巨大作用, 有廣闊的應(yīng)用前景。2.3.3免疫 PCR技術(shù) 免疫技術(shù)與 PCR 技術(shù)結(jié)合發(fā)展出了免疫 PCR技術(shù)(I-PCR 或 IC-PCR)。免疫 PCR 是一種將抗原抗體反應(yīng)的高特異性與 PCR 的高靈敏度有機(jī)結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)先用抗體來捕獲病毒, 提取核酸后, 再進(jìn)行 PCR 或 RT-PCR 檢測(cè)。 將 PCR 技術(shù)和抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合，靈敏性非常高。因其對(duì)一個(gè)分子的抗原都可以進(jìn)行檢測(cè)而具有十分廣泛的應(yīng)用前景，是一種用于檢測(cè)微量抗原的 PCR 技術(shù)。該方法由于能去除抑制物質(zhì)而改

10、善檢測(cè)環(huán)境, 比標(biāo)準(zhǔn) PCR 方法更為靈敏、可靠。G. Harper 應(yīng)用 IC-PCR 檢測(cè)到香蕉條紋病毒12。 此外還有快速免疫濾紙法、免疫膠體金技術(shù)、免疫沉淀法、免疫電鏡、熒光免疫、放射免疫和 Ig 指示試紙法等13。3.顯微成像技術(shù) 病毒的很多特征如大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等必須借助電子顯微鏡進(jìn)行檢查。對(duì)于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型的病毒，可直接從感染組織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)收獲的材料作電子顯微鏡檢查，直接觀察病毒粒子。目前通常認(rèn)為運(yùn)用負(fù)染和超薄切片電鏡觀察能夠診斷和鑒別植物病毒, 一般可診斷到屬的水平。在植物病毒的診斷和形態(tài)鑒別中, 最有用的特征是病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)和寄主

11、病變, 有些細(xì)胞病變特征還能用于區(qū)分不同的病毒種甚至株系。 3.1超薄切片法和負(fù)染法 超薄切片法其優(yōu)點(diǎn)是可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過程，缺點(diǎn)是操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，但標(biāo)本可長時(shí)間保存；負(fù)染法是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強(qiáng)樣品外周的電子密度，使樣品顯示負(fù)的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小，其優(yōu)點(diǎn)是快速簡易（10-20min）、分辨率高，缺點(diǎn)是敏感性低，要求病毒量在107以上，且所有樣品應(yīng)處于懸浮狀態(tài)；T. Hatta 等用負(fù)染和超薄切片電鏡觀察區(qū)分了 CMV 的 6 個(gè)不同株系14。 3.2免疫吸附電鏡技術(shù) 1973 年, K.S. Derrick把電鏡與免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合, 發(fā)明了更為靈敏的免疫吸附電

12、鏡技術(shù), 該技術(shù)現(xiàn)已成為植物病毒研究的一個(gè)重要手段15。免疫電鏡技術(shù)是將免疫學(xué)原理與電鏡負(fù)染技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，在電鏡制樣過程中病毒顆粒不能集中的沉積在有效的電鏡視野內(nèi)，而容易造成電鏡觀察時(shí)的疏漏，免疫電鏡法利用了抗體、抗原的親和性與吸附性的這一特點(diǎn)，在電鏡制樣過程中，于銅網(wǎng)上先鋪展一層細(xì)胞色素A，稍后再添加一滴抗體，多余液滴用濾紙吸掉，最后點(diǎn)上一滴抗原和染液，由于細(xì)胞色素A的作用，減少了樣品即抗體、抗原的表面能力，能形成均勻的涂層，再加抗體、抗原的吸附作用使病毒能較集中地沉集在有效視野內(nèi)，從而便于電鏡下的觀察，大大提高了檢測(cè)幾率。D. Louro 等于1984 年在此基礎(chǔ)上建立了懸浮樣品的膠體

13、金標(biāo)記免疫修飾法16（也就是上述第二點(diǎn)免疫法中的免疫膠體金技術(shù)）。此方法利用一抗對(duì)病毒進(jìn)行免疫修飾, 再用膠體金標(biāo)記二抗或蛋白 A 處理, 形成病毒 抗體 金顆粒免疫復(fù)合物。由于在病毒表面的抗體 “暈圈”上結(jié)合了直徑 510 nm 的金顆粒, 該復(fù)合物的電鏡下的可見性好, 比單純免疫修飾法更易判斷。 3.3低溫電鏡技術(shù)以及一些局限性顯微檢測(cè)技術(shù) 低溫電鏡技術(shù)，結(jié)合了電鏡技術(shù)和低溫結(jié)晶觀察病毒的三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)，其不但有分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)病毒樣品的損傷和失真的概率都大大減小，常用于極微量和高保真要求的病毒觀察檢測(cè)17。 X-射線衍射技術(shù)，通過掃射病毒微晶得到的衍射圖像來分析還原原始的病毒結(jié)構(gòu)，

14、但為了保證衍射圖像的準(zhǔn)確性，往往對(duì)樣品的純度和顆粒完整性要求較高，所以這種技術(shù)的使用范圍相對(duì)受限。 核磁共振技術(shù)，對(duì)比前面提到的技術(shù)對(duì)操作的要求更低，運(yùn)用范圍也更廣，但是對(duì)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性判斷略低。此技術(shù)主要用于病毒短肽的分析以及蛋白小分子構(gòu)象變化的研究。4. 分子生物學(xué)檢測(cè)方法 寄生于宿主細(xì)胞的病毒有不同于宿主細(xì)胞的特異基因組序列，這是病毒的存在的證明。分子生物學(xué)檢測(cè)法就是通過檢測(cè)病毒核酸(DNA、RNA)來鑒定病毒的存在,由于是建立在核酸水平上,所以相對(duì)于血清學(xué)檢測(cè)法有更高的靈敏度(Piccotbetal, 1999),并且有更強(qiáng)的特異性,更廣的檢測(cè)范圍,還可以進(jìn)行大批量的樣本檢測(cè),甚至可以使

15、用粗提液檢測(cè)病毒。在植物病毒鑒定檢測(cè)方面, 目前應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)主要有核酸斑點(diǎn)雜交(Nucleic Acid Spot Hy-bridization, NASH)技術(shù)、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù)、dsRNA 電泳技術(shù)等18。 4.1.核酸分子雜交技術(shù)(Nucleic Acid Hybridization) 核酸分子雜交技術(shù)是20 世紀(jì) 70 年代發(fā)展起來的，它是以 DNA 分子堿基互補(bǔ)配為理論依據(jù)，與待測(cè)樣品的 DNA 或 RNA 用特異性的核酸探針形成雜交分子19-20。采用帶有放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的已知序列核酸單鏈作為探針,

16、在一定條件下與靶病毒的核酸單鏈退火形成雜交雙鏈。通過檢測(cè)雜交信號(hào), 檢測(cè)出樣本中病毒的基因組份。其優(yōu)點(diǎn)是可檢測(cè)同種病毒的不同株系, 還可檢測(cè)類病毒、衛(wèi)星 RNA 以及某些不能形成病毒粒體蛋白的病毒分離物; 缺點(diǎn)是同位素標(biāo)記有放射性污染。但是非同位素標(biāo)記不會(huì)造成環(huán)境污染，而且在信號(hào)放大和模板擴(kuò)增上有所發(fā)展，并在靈敏性上也有完善和提高。生物素、地高辛和熒光素是常用的非同位素標(biāo)記物21。對(duì)于 DNA 病毒、RNA 病毒及類病毒的檢測(cè)采用核酸雜交技術(shù)，不僅敏感性高，而且特異性強(qiáng)22-23。結(jié)合 PCR 和 NASH , 出現(xiàn)了PCR 微量板雜交技術(shù), 其靈敏度是 ELISA 的 1 萬倍, 特異性比普

17、通 PCR 強(qiáng)。王明霞成功應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)了馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)24。以此為基礎(chǔ), 還發(fā)展出了熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescent in situ hybridization, FISH), 它是用特異性的核酸重復(fù)序列作為探針,用一定方法將其進(jìn)行熒光標(biāo)記,然后與被測(cè)目標(biāo)進(jìn)行雜交,通過熒光顯微鏡下可以觀察到特異的熒光信號(hào),從而對(duì)其進(jìn)行分析處理。該技術(shù)能準(zhǔn)確檢測(cè)和定位一些基因組可以整合到寄主基因組的植物病毒。G. Harper 等應(yīng)用該技術(shù)將香蕉條紋病毒基因整合到香蕉基因組上, 這是植物病毒檢測(cè)方面的又一重大突破25。王金平等26對(duì)小濱麥易位系小麥山農(nóng)0096進(jìn)

18、行抗條銹病基因的定位研究,將導(dǎo)入的抗條銹病基因定位在了4A染色體上。 4.2.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Polymerase Chain Reaction，PCR) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）其原理即利用 DNA 半保留復(fù)制的特性，以原始 DNA 為模板合成兩條一樣的雙鏈，從而達(dá)到指數(shù)量擴(kuò)增，DNA 總量可檢測(cè)的目的。另外，由于病毒的核酸有的是 DNA，有的是RNA，所以常規(guī)的 PCR 以及反轉(zhuǎn)錄 PCR 即可針對(duì)不同的病毒基因進(jìn)行檢測(cè)。PCR 技術(shù)在病毒病原檢測(cè)中具有強(qiáng)大的靈敏性，最低可檢測(cè)的病毒含量為 fg 水平的病毒，比酶聯(lián)免疫法高出 1 000 倍27。在此基礎(chǔ)上衍生了越來越多的PCR方法。

19、4.2.1.復(fù)合 RT-PCR（多重PCR）此種 PCR 方法是在同一 RT-PCR 反應(yīng)體系中同時(shí)使用幾對(duì)引物擴(kuò)增多個(gè)目的基因片段同時(shí)檢測(cè)多個(gè)病毒。 4.2.2.實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR將 RT-PCR 和熒光技術(shù)相結(jié)合, 與傳統(tǒng)PCR基本相同，只是在體系中加入熒光基團(tuán)，反應(yīng)中利用 CCD 實(shí)時(shí)讀取熒光信號(hào)，檢測(cè)。不僅減少的污染和浪費(fèi)，也使定量快速而方便，可以實(shí)現(xiàn)多樣品和高通量的反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 還可避免假陽性的出現(xiàn)。國內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)檢測(cè)植物病毒28, 29。 4.2.3.定量PCRPCR 擴(kuò)增在某一特定擴(kuò)增時(shí)期，擴(kuò)增產(chǎn)物是呈指數(shù)增長的，最終 PCR 產(chǎn)物與模板量是直接相關(guān)的

20、，模板定量 PCR 就是利用這一特點(diǎn)進(jìn)行。PCR 定量關(guān)鍵是選擇好擴(kuò)增呈指數(shù)增長的最佳時(shí)機(jī)和內(nèi)部設(shè)置擴(kuò)增模板對(duì)照。PCR定量技術(shù)的產(chǎn)生使 RNA 定量所需模板量在極少的情況下也能進(jìn)行。 4.2.4.原位 PCR原位 PCR 結(jié)合了原為雜交技術(shù)和 PCR 技術(shù)，用于檢測(cè)低拷貝的 RNA 和 DNA，同時(shí)，可以用于確定細(xì)胞來源并進(jìn)行特異性的細(xì)胞內(nèi)定位。 4.2.5.巢式 PCR 巢式 PCR也稱套式 PCR (nested PCR)，設(shè)計(jì)兩套引物，先用第一套引物擴(kuò)增 15-30 個(gè)循環(huán)，再用設(shè)定好的第二套引物對(duì)第一次擴(kuò)增的 DNA 片段繼續(xù)擴(kuò)增15-30 個(gè)循環(huán)，比普通 PCR 技術(shù)有更好的特異性

21、。它可用于檢測(cè)微量的 DNA，尤其適用于單拷貝基因的擴(kuò)增和微量的生物檢測(cè)。 除以上幾種還有免疫PCR（在上述免疫法中已概述）、PCR-ELISA（用 ELISA 代替瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物）、生物素化引物模板捕捉 PCR 技術(shù)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增 PCR 技術(shù)(TAS-PCR)、半保留式復(fù)制 PCR 技術(shù)(3SR-PCR)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling cycle amplification,RCA)(可對(duì)未知病毒序列進(jìn)行擴(kuò)增，使用該方法可以檢測(cè)到含量較低的 DNAB 及 DNA分子，以及復(fù)合侵染中處于劣勢(shì)地位的病毒)。 4.2.6.序列非依賴性基因體外擴(kuò)增技術(shù)上述PCR方法不適用于對(duì)于未知序

22、列的病毒的鑒定檢測(cè)，序列非依賴性基因體外擴(kuò)增技術(shù)可以直接偵測(cè)未知的病毒，并且不需要預(yù)知病毒的基因序列30。目前主要發(fā)展出來的方法有：Sequence-Independent Single Primer Amplification（SISPA）、Virus Discovery cDNA AFLP（VIDISCA）、Random PCR（rPCR）、Representational Difference Analysis (RDA)、Differential Display、全基因體外擴(kuò)增（Whole Genome Amplification）、RNA 擴(kuò)增(RNA Amplification)。

23、4.3. dsRNA 技術(shù)（雙鏈 RNA 分析技術(shù)） 在植物體內(nèi)存在dsRNA（RNA 病毒、類病毒等在寄主體內(nèi)形成 ssRNA 的特異復(fù)制中間型），能夠證明RNA病毒和類病毒因子的存在，因?yàn)橹参锉旧聿淮嬖赿sRNA。在植物新病毒的鑒定中，某個(gè)病毒做為植物上新病原,或者檢測(cè)一種植物上存在多種病毒復(fù)合侵染都可以通過dsRNA技術(shù)來鑒定31，32；利用dsRNA技術(shù)還可以鑒別同一病毒內(nèi)的株系或分離物；該技術(shù)還可用于病毒衛(wèi)星 RNA 和亞基因組 RNA 的檢測(cè); 用提取到的 dsRNA 為模板, 還可進(jìn)行病毒的分子克隆和抗血清制備, 大大減少提取植物總 RNA 或病毒 RNA 的麻煩, 簡化程序；但

24、是此技術(shù)不能用于 DNA 病毒的檢測(cè)。萵苣巨脈病毒和萵苣小斑駁病毒就可以用dsRNA技術(shù)來鑒定檢測(cè)33，34。4.4. 芯片技術(shù)檢測(cè)法 芯片技術(shù)在植物病毒鑒定檢測(cè)中主要可用到的是基因芯片技術(shù)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)。其中基因芯片技術(shù)是 DNA 雜交技術(shù)與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的基因水平檢測(cè)方法, 具有靈敏度高和可靠性強(qiáng)的特點(diǎn)。其原理是將各種病毒樣品的基因片段或特征基因片段點(diǎn)樣, 制成基因芯片, 并以熒光標(biāo)記的待檢核酸與芯片進(jìn)行雜交, 雜交信號(hào)借助激光共聚焦顯微掃描技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)和分析,最后通過計(jì)算機(jī)分析結(jié)果。 蛋白芯片技術(shù)，可以直接測(cè)量生物分子的特異性結(jié)合所形成的生物分子復(fù)合物，并不需要象

25、酶聯(lián)免疫或放射免疫法那樣對(duì)生物分子作標(biāo)記，不會(huì)對(duì)待測(cè)生物分子活性造成任何擾動(dòng)和損傷；實(shí)時(shí)檢測(cè)生物分子相互作用的動(dòng)態(tài)過程。在此基礎(chǔ)上, 還發(fā)展出了基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行等質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)。5.電化學(xué)阻抗光譜法（Electrochemical Impedance Spectroscopy）35 基于電化學(xué)阻抗光譜對(duì)病毒特殊“信號(hào)”（“共振”頻率）的識(shí)別的原理，可使用微流控芯片裝置可對(duì)病毒進(jìn)行鑒定檢測(cè)和濃度定量。有兩種方法，第一種方法是基于微型裝置顯化識(shí)別所謂“共振”頻率以及監(jiān)控病毒的濃度變化，第二個(gè)方法則是依賴于測(cè)量在“共振”頻率阻抗親緣關(guān)系的變化。在最高“共振”頻率80赫茲

26、時(shí)獲得了病毒的影響象征，這是一個(gè)在測(cè)定純化病毒稀釋濃度上比傳統(tǒng)的斑塊鑒定濃度的估量方法更簡單，因?yàn)樗墙⒃陬l率測(cè)量的基礎(chǔ)上，所以在精確度測(cè)量上有更高的潛力。 植物病毒檢測(cè)在植物病毒研究中有著非常重要的意義。采用什么方法要根據(jù)病毒的種類、實(shí)際的設(shè)備條件、現(xiàn)有的技術(shù)掌握程度等。生物學(xué)鑒定方法比較直接和直觀，容易獲得相應(yīng)毒源，鑒定成本較低，但人工接種鑒定需要一定的時(shí)間，且不同的病毒感染寄主可能產(chǎn)生類似的癥狀， 需要積累一定的癥狀辨別經(jīng)驗(yàn)和嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真的觀察態(tài)度。電子顯微鏡技術(shù)可直接觀察到病毒粒子的形態(tài)特征，即使現(xiàn)在鑒定技術(shù)進(jìn)入了分子水平，電鏡仍有其不可替代的作用。但電鏡操作需要一定的技術(shù)技能，設(shè)備成本

27、昂貴，而且工作比較集中，不易對(duì)大量樣本進(jìn)行處理。血清學(xué)技術(shù)簡便、易操作，檢測(cè)時(shí)間短，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，適合大部分實(shí)驗(yàn)室操作，是目前病毒鑒定方法中最為常用的方法。血清學(xué)方法中常用的ELISA 方法，靈敏度高、特異性強(qiáng)，克服了常規(guī)血清學(xué)方法受病毒濃度、粒體形態(tài)和抗血清用量等限制的缺點(diǎn)。但ELISA 檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性受抗體的效價(jià)和特異性影響較大?；蚬こ碳夹g(shù)的興起給病毒的檢測(cè)手段帶來了新的飛躍，檢測(cè)水平已經(jīng)達(dá)到微克水平。其靈敏度和特異性是任何生化方法的檢測(cè)所不能比擬的， 同時(shí)可以省略大量的病毒提純和血清的制備工作。但分子生物學(xué)方法也有其局限性，如PCR 反應(yīng)絕大部分只能利用病原物的核酸或純培養(yǎng)

28、物作為模板， 若以受侵染植物組織的核酸粗提液或材料浸泡液作為模板，PCR 反應(yīng)將會(huì)受到嚴(yán)重抑制；另外，一些尖端的PCR 技術(shù)方法還需要特配的儀器。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，植物病毒的鑒定和檢測(cè)只會(huì)越來越精確簡便。參考文獻(xiàn)：1 李雪燕.玉米鼠耳病病原鑒定及檢測(cè)系統(tǒng)建立D.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2004.2楊本榮，馬巧月.玉米粗縮病的病毒寄主范圍研究J.植物病學(xué)報(bào)，1983，13(3)：18.3袁偉.番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定、遺傳多樣性分析及其誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因的分離D.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2012.4張愛紅,陳丹,田蘭芝等.我國玉米病毒病的種類和病毒鑒定技術(shù)J玉米科學(xué)2010，18(6)

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