醫(yī)學(xué)專業(yè) lncRNA KCNQ1OT1在人白色脂肪細(xì)胞分化過(guò)程及肥胖人群脂肪組織中的表達(dá)研究

1、目的探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）KCNQ1OT1在人白色脂肪前體細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)情況，以及在肥胖人群脂肪組織中的表達(dá)變化，明確KCNQ1OT1與肥胖的相關(guān)性，為闡明KCNQ1OT1在人脂肪細(xì)胞分化過(guò)程及肥胖中的潛在作用提供線索。方法通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，檢測(cè)KCNQ1OT1在兩種內(nèi)參基因（PPIA/GAPDH）標(biāo)準(zhǔn)化條件下，于人白色脂肪細(xì)胞分化第0，1，3，5，9，12天的表達(dá)水平；應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)KCNQ1OT1在肥胖和正常人群白色脂肪組織中的表達(dá)變化；采用Pearson相關(guān)分析探討KCNQ1OT1與人群體質(zhì)指數(shù)（Body ma

2、ss Index, BMI）、血清甘油三酯（Triglyceride，TG）及膽固醇(Cholesterol，CHOL)的相關(guān)性。 結(jié)果 1 KCNQ1OT1在脂肪細(xì)胞分化第1、3、5、9和12天的表達(dá)量分別為6.36E-050.00、1.88E-030.00、1.13E-030.00、4.91E-040.00、3.50E-040.00（PPIA）；3.94E-050.00、8.61E-040.00、8.61E-040.00、9.96E-040.00、3.12E-040.00、3.12E-040.00（GAPDH），與第0天相較，均呈上升趨勢(shì)，且變化差異有顯著性（p0.05）, 在分化前期（第

3、1天、第3天）增長(zhǎng)尤為明顯。2. KCNQ1OT1在肥胖人群內(nèi)臟脂肪組織中的表達(dá)量為3.37E-030.002（PPIA）/3.37E-030.002(GAPDH), 較正常人顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）；3. KCNQ1OT1與人群BMI呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=0.656（PPIA）和r=0.554（GAPDH），（P 0.05）。KCNQ1OT1與人血清甘油三酯呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=0.578（PPIA）和r=0.627（GAPDH），（P 0.05）。結(jié)論 1、KCNQ1OT1在白色脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中呈增高趨勢(shì)；2、KCNQ1OT1在肥胖人群脂肪組織中的表達(dá)增高；3、K

4、CNQ1OT1與BMI、血清TG等肥胖相關(guān)指標(biāo)呈正相關(guān)。提示其在人脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用以及作為肥胖防治的潛在靶標(biāo)。析 將收集的臨床樣本分為兩組，即正常組(n=8)和超重肥胖組(n=14)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1在超重肥胖組脂肪組織中的表達(dá)量顯著高于正常組（p0.05）其表達(dá)水平與BMI成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.656（PPIA）和r=0.554（GADPH），p0.05(圖4)，KCNQ1OT1表達(dá)水平與血清TG水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.578（PPIA）和r=0.627（GADPH），p0.05(圖5), 與血清CHOL水平的相關(guān)性分析顯示：以PPIA

5、為內(nèi)參的表達(dá)量呈正相關(guān)r=0.557，p0.05。3、不同內(nèi)參基因下，KCNQ1OT1表達(dá)量與BMI、血清TG、CHOL 的相關(guān)性分2. KCNQ1OT1在肥胖人群白色脂肪組織中的表達(dá)情況將收集的樣本分為兩組：正常組（n=8），超重/肥胖組（n=14）。提取兩組人群白色脂肪組織中的總RNA，并經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)其中KCNQ1OT1的表達(dá)。KCNQ1OT1在正常組人群中的表達(dá)水平（2-CT）為8.20E-030.003（PPIA）和1.90E-020.007（GAPDH），在肥胖超重人群中表達(dá)量的表達(dá)量分別為3.37E-030.002（PPIA）、3.37E-030.002（GAPDH），兩組

6、人群白色脂肪組織中KCNQ1OT1的表達(dá)量有顯著性差異。詳見表2和圖3。結(jié)果1 KCNQ1OT1在脂肪組織細(xì)胞分化不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量 KCNQ1OT1在脂肪細(xì)胞分化第0天的表達(dá)量（2-CT）為6.36E-05（內(nèi)參基因?yàn)槿薖PIA）和3.94E-05（內(nèi)參為人GAPDH），第1、3、5、9和12天的表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（與d0天相比），特別是分化前期（第1天、第3天）增長(zhǎng)趨勢(shì)更為明顯，差異有顯著性（P 0.05）。于分化第4天加入誘導(dǎo)劑，分化第5、9和12天，KCNQ1OT1的表達(dá)量與分化第1和3天相比，略有下降。（詳見表1和圖1、2）1.3.5定量PCR參照PowerUp SYBR Gree

7、n Master Mix PCR試劑盒說(shuō)明，以上述逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行KCNQ1OT1的qPCR 擴(kuò)增。采用2-CT法計(jì)算，以 人PPIA和GAPDH基因作為內(nèi)參，計(jì)算KCNQ1OT1的相對(duì)表達(dá)量。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差 (X SD) 表示，計(jì)量資料用t 檢驗(yàn)、分化不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量的總比較用ANOVA方差分析，；采用Pearson分析法對(duì)KCNQ1OT1表達(dá)量（2-CT）與BMI、血清甘油三酯和膽固醇水平進(jìn)行相關(guān)性分析。P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肥胖是指體內(nèi)脂肪組織過(guò)度沉積、達(dá)到損害健康的一種疾病狀態(tài)，目前已經(jīng)成為全球流行性最廣

8、的慢性非傳染性疾病之一1-3。肥胖不僅表現(xiàn)為體重超標(biāo)，通常還伴有胰島素抵抗 4，肥胖是與型糖尿病、高血壓、血脂代謝異常等有密切聯(lián)系，嚴(yán)重影響人體健康5。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt、不參與編碼蛋白的RNA分子4，在多種生理病理過(guò)程中扮演多種角色，其中在細(xì)胞增值、分化、凋亡過(guò)程中所發(fā)揮的作用4。 lncRNA KCNQ1OT1為位于人類染色體11p15.5 5，目前KCNQ1OT1的研究多集中在腫瘤方面，其水平在多種上皮細(xì)胞腫瘤、腺癌中呈上調(diào)趨勢(shì)，并有介導(dǎo)腫瘤惡變傾向的作用6，另有研究發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1可致機(jī)體對(duì)紫杉醇等

9、抗癌藥物的抗藥性增加7。在大鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1在高糖刺激下，可以加速心肌組織纖維化，進(jìn)一步提示糖脂代謝異常會(huì)改變?cè)搇ncRNA表達(dá)，進(jìn)而參與疾病的發(fā)生 8，目前KCNQ1OT1與肥胖的相關(guān)研究未見報(bào)道，因此，KCNQ1OT1是否在肥胖過(guò)程中發(fā)揮作用引起了我們的關(guān)注。本研究以人白色脂肪前體細(xì)胞為模型，分析了KCNQ1OT1在脂肪前體細(xì)胞分化過(guò)程的水平變化，初步明確了KCNQ1OT1在肥胖人群中的表達(dá)情況、并分析了其與BMI、血清甘油三酯及膽固醇的相關(guān)性，為進(jìn)一步探討KCNQ1OT1在人脂肪細(xì)胞分化及肥胖中的作用與機(jī)制提供線索。1、 材料與方法1.1樣本 內(nèi)臟脂肪組織取自江蘇省人民醫(yī)

10、院、南京市婦幼保健院的就診患者共28名。組織經(jīng)生理鹽水沖洗，RNAlaterer RNA穩(wěn)定試劑處理后，-80保存，排除嚴(yán)重心肺功能障礙、肝腎等疾病患者。分組：按照2003年中國(guó)肥胖工作組制定的中國(guó)成人超重和肥胖癥預(yù)防和控制指南8 建議，將BMI指數(shù)大于24kgm2納入超重、肥胖組/BMI指數(shù)介于18kgm2和24kgm2之間納入正常對(duì)照組。最終納入統(tǒng)計(jì)的病例共22例，其中：正常對(duì)照組8例；肥胖組中肥胖/超重14例，所有研究工作均經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市婦幼保健院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：寧婦倫字（2010）36號(hào)），并簽署知情同意書。1.2細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)材料 人前體脂肪細(xì)胞（Human pre

11、adipocyte from visceral fat, HPA-v）（Sciencell公司 美國(guó)）；DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素（Penicillin-Streptomycin Solution, P/S）（Gibco 公司 美國(guó)）；I型膠原酶、胰島素(Insulin)、地塞米松（DEX）、3-丁基-1-甲基次黃嘌呤（IBMX）(Sigma 公司 美國(guó))；PBS 緩沖液(維森特 中國(guó))； RNeasy mini 試劑盒(QIAGEN 德國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser

12、, TARAKA, Japan)；PCR試劑盒（PowerUp SYBR Green Master Mix，賽默飛公司 美國(guó)）；定量PCR儀(Biosystems ViiA 7 , life technologies, 美國(guó))。1.3 方法1.3.1 人前體脂肪細(xì)胞（HPA-v）的培養(yǎng)將人前體脂肪細(xì)胞 (HPA-v)按105/ml 密度接種于6孔板，加入含5%胎牛血清、PAM完全培養(yǎng)液，置37、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.3.2脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)基（誘導(dǎo)第0天）后，將PAM完全培養(yǎng)液換成誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基（DMEM+1%青鏈霉素+0.5 mmol/L IBMX+1 umol/L 地

13、塞米松+5 ug/ml胰島素），第四天后換成誘導(dǎo)劑（DMEM+1%青鏈霉素+5ug/ml 胰島素）直至分化成熟。收集d0、d1、d3、d5、d9、d12的細(xì)胞樣品。1.3.3 總 RNA 抽提及 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄 按TianGen試劑盒說(shuō)明書步驟提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄1.3.4引物設(shè)計(jì)通過(guò)加州大學(xué)基因數(shù)據(jù)庫(kù)（UCSC），生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Ensembl），RefSeq等數(shù)據(jù)庫(kù)查找KCNQ1OT1，PPIA，GAPDH等基因的正確序列，選擇人PPIA和GAPDH作為內(nèi)參。利用Primer blast (/tools/primer-blast

14、)在線設(shè)計(jì)引物并驗(yàn)證特異性，最后送銳真生物技術(shù)公司合成，引物序列如表：討論脂肪前體細(xì)胞分化是肥胖研究的重要方向10。肥胖是一種病理狀態(tài)，由于能量代謝失衡導(dǎo)致體內(nèi)脂肪細(xì)胞增多，脂肪細(xì)胞數(shù)量的增多是由脂肪前體細(xì)胞分化增加所致。前脂肪細(xì)胞與分化成熟的脂肪細(xì)胞相比，有近百個(gè)lncRNAs 的差異表達(dá)，在對(duì)這些lncRNAs 進(jìn)行干擾后發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞成熟標(biāo)記物表達(dá)水平也隨之發(fā)生了相應(yīng)改變14，說(shuō)明這些lncRNAs的表達(dá)水平可能和脂肪細(xì)胞的成熟過(guò)程密切相關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn)，有多個(gè)處于活躍狀態(tài)的lncRNAs在脂肪細(xì)胞的分化中起到非常重要的作用3，如SPA、U90926，和Gm15441等lncRNAs 1

15、1-13。除此之外，lncRNA-MIR31HG, HOXA11-AS1, lncRNA-ADINR，lncRNA-paral1和lncRNA-NEAT1等基因?qū)χ厩绑w細(xì)胞分化也起到一定的作用15-19。以上研究說(shuō)明：lncRNAs可能是脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子，可為肥胖的深入研究提供線索。 本研究采用Realtime PCR技術(shù)對(duì)小鼠脂肪前體細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，在脂肪前體細(xì)胞分化過(guò)程中，尤其在加入誘導(dǎo)劑I（分化早期）后，KCNQ1OT1水平顯著增加，加入誘導(dǎo)劑II后較之分化早期略有下降，就提示KCNQ1OT1有可能參與了脂肪細(xì)胞的早期分化。本研究對(duì)肥胖人

16、群白色脂肪組織中KCNQ1OT1的含量進(jìn)行檢測(cè)，其水平顯著高于正常人，且與BMI呈正相關(guān)，與血清脂類物質(zhì)（TG、CHOL）水平呈正相關(guān)。而脂肪在體內(nèi)代謝的生化過(guò)程主要分為甘油三酯、磷脂、膽固醇和脂蛋白等四類物質(zhì)的代謝，我們的研究證實(shí)，人白色脂肪組織中KCNQ1OT1水平與脂代謝密切相關(guān)。因此，我們認(rèn)為KCNQ1OT1在肥胖過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，提示，KCNQ1OT1可作為肥胖發(fā)生和脂代謝的重要調(diào)控因子做進(jìn)一步研究，今后將通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究中，肥胖人群KCNQ1OT1的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，且與脂類物質(zhì)水平呈正相關(guān)。本人前期研究中發(fā)現(xiàn)TG和TC兩種脂質(zhì)物質(zhì)水平和OGTT試驗(yàn)結(jié)果呈一定程度正相關(guān)，脂質(zhì)物質(zhì)代謝紊亂可導(dǎo)致機(jī)體呈現(xiàn)一定程度的胰島素抵抗14。Fan Yang等人的研究證實(shí)，在30mmol/L血糖作用下，人心肌纖維組織中KCNQ1OT1被大量激活，通過(guò)沉默糖尿病大鼠模型的KCNQ1OT1基因，可顯著改善病鼠心功能和心臟纖維化的程度，這也提示KCNQ1OT1水平可能與糖脂代謝、胰島素抵抗之間存在某種關(guān)聯(lián)。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，組織對(duì)血漿葡萄糖利用減少，刺激胰島Beta細(xì)胞釋放胰島素，繼而導(dǎo)致高胰島素血癥。高胰島素血癥又通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)