利用SSR標(biāo)記對(duì)高粱重組自交系進(jìn)行抗蚜性鑒定本科畢業(yè)論文

1、編號(hào)no：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文論文題目 利用ssr標(biāo)記對(duì)高粱重組自交系進(jìn)行抗蚜性鑒定學(xué)生姓名 陳再軍 學(xué)號(hào) 2009014010215 成績(jī) 89 學(xué)院 農(nóng)學(xué)院 專業(yè)班級(jí) 農(nóng)學(xué)0902班 指導(dǎo)教師姓名 常金華 指導(dǎo)教師職稱 教授 材料目錄：1、任務(wù)書(shū) （1）份2、開(kāi)題報(bào)告 （含文獻(xiàn)綜述） （1）份3、指導(dǎo)教師評(píng)閱書(shū) （1）份4、答辯記錄表 （1）份5、論文正文 （1）份6、其它材料河北農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文任務(wù)書(shū)學(xué) 院： 農(nóng)學(xué)院 教師姓名： 常金華 職 稱： 教授 二零一二 年 五 月 四 日專業(yè)名稱農(nóng)學(xué)院，農(nóng)學(xué)專業(yè)論文題目利用ssr標(biāo)記對(duì)高粱重組自交系進(jìn)行抗蚜性鑒定題目來(lái)源通過(guò)對(duì)田間高粱對(duì)

2、蚜蟲(chóng)的觀察以及前人在實(shí)驗(yàn)室利用分子標(biāo)記在高粱抗蚜的鑒定方面的成果目的意義：1、高粱蚜蟲(chóng)嚴(yán)重危害高粱，通過(guò)對(duì)高粱抗蚜的研究可以有效控制田間高粱蚜蟲(chóng)。2、通過(guò)對(duì)高粱抗蚜基因的鑒定，可以大大縮減田間育種的年限，對(duì)育種工作具有指導(dǎo)性的意義。3、在抗蚜基因的研究可以從生物自身抵御高粱蚜蟲(chóng)，可以避免化學(xué)藥劑抗蚜蟲(chóng)造成的環(huán)境污染?？尚行苑治觯?、研究條件： 高粱具有抗蚜性的基因，對(duì)蚜蟲(chóng)表現(xiàn)為抗蚜和感蚜兩種性狀。其中高粱的抗蚜基因?qū)Ω醒粱虮憩F(xiàn)顯性，受主效單基因控制。在對(duì)高粱抗蚜田間觀察中，發(fā)現(xiàn)具有抗蚜性基因的植株明顯比不具有抗蚜性基因的植株受到危害小，因此可以利用分子標(biāo)記對(duì)高粱的抗蚜基因進(jìn)行定位，從而指導(dǎo)田

3、間育種工作，前人也曾利用分子標(biāo)記對(duì)高粱蚜基因進(jìn)行定位并取得突破性的成果，因此本實(shí)驗(yàn)是可行的。2、預(yù)期結(jié)果 通過(guò)利用凝膠電泳對(duì)一些與抗蚜相關(guān)的ssr標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選出6對(duì)具有多態(tài)性的引物，并對(duì)高粱品種“河農(nóng)16”和“千三”的f8重組自交系進(jìn)行ssr多態(tài)性分析，從而觀察篩選出的6對(duì)具有多態(tài)性引物在群體中的抗感情況，通過(guò)對(duì)群體電泳條帶的觀察，并結(jié)合對(duì)群體抗感表型的調(diào)查來(lái)找到與目的性狀相連鎖的基因。預(yù)計(jì)實(shí)驗(yàn)所用的分子標(biāo)記與抗蚜基因是相連鎖。3、可能存在的問(wèn)題 由于時(shí)間的原因，田間試驗(yàn)的重復(fù)數(shù)較少，所得到的結(jié)論可能存在一定問(wèn)題，需要多次重復(fù)進(jìn)行驗(yàn)證。進(jìn)度安排：2012年5-6月：查閱資料，設(shè)計(jì)試

4、驗(yàn)內(nèi)容，選擇大豆品種。2012年6-12月：撰寫(xiě)課程論文，開(kāi)展試驗(yàn)內(nèi)容，完成試驗(yàn)內(nèi)容。2013年1-6月：整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，完善試驗(yàn)內(nèi)容，撰寫(xiě)畢業(yè)論文，準(zhǔn)備答辯材料，進(jìn)行畢業(yè)答辯。專家意見(jiàn)：論文選題針對(duì)性強(qiáng)，依據(jù)充分，設(shè)計(jì)合理，路線可行，進(jìn)度安排合理，預(yù)期結(jié)果明確，同意按計(jì)劃執(zhí)行。專家簽字：2012年 5月10日學(xué)院意見(jiàn): 院長(zhǎng)： 年 月 日 農(nóng)學(xué) 學(xué)院 農(nóng)學(xué) 專業(yè) 陳再軍 學(xué)生現(xiàn)把 2012-2013 學(xué)年，第 2 學(xué)期的畢業(yè)論文安排下達(dá)給你，你本學(xué)期承擔(dān)的畢業(yè)論文任務(wù)如下：1、依據(jù)本任務(wù)書(shū)中論文題目、目的意義、可行性分析的內(nèi)容完成開(kāi)題報(bào)告。2、按照開(kāi)題報(bào)告的要求按期完成畢業(yè)論文各項(xiàng)工作的實(shí)施。

5、3、完成畢業(yè)論文的撰寫(xiě)。4、完成畢業(yè)論文的答辯。 請(qǐng)按相關(guān)要求完成畢業(yè)論文任務(wù)。教師簽字：2012年 5 月 4 日河北農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文開(kāi)題報(bào)告題 目： 利用ssr標(biāo)記對(duì)高粱重組自交系進(jìn)行抗蚜性鑒定 學(xué) 院： 農(nóng)學(xué)院 學(xué)生姓名： 陳再軍 專 業(yè)： 農(nóng)學(xué) 班級(jí)學(xué)號(hào)： 2009014010215 指導(dǎo)教師姓名： 常金華 指導(dǎo)教師職稱： 教授 二零一二年六月五日學(xué)生姓名陳再軍專業(yè)班級(jí)農(nóng)學(xué)0902班學(xué) 號(hào)2009014010215指導(dǎo)教師常金華職 稱教授所在學(xué)院農(nóng)學(xué)院論文名稱利用ssr標(biāo)記對(duì)高粱重組自交系進(jìn)行抗蚜性鑒定選題依據(jù)理論依據(jù)：高粱具有抗蚜性的基因，對(duì)蚜蟲(chóng)表現(xiàn)為抗蚜和感蚜兩種性狀。其中高粱

6、的抗蚜基因?qū)Ω醒粱虮憩F(xiàn)顯性，受主效單基因控制。在對(duì)高粱抗蚜田間觀察中，發(fā)現(xiàn)具有抗蚜性基因的植株明顯比不具有抗蚜性基因的植株受到危害小，并且前人在實(shí)驗(yàn)室也進(jìn)行過(guò)分子標(biāo)記對(duì)高粱抗蚜蟲(chóng)基因進(jìn)行過(guò)定位，因此可以利用分子標(biāo)記對(duì)高粱的抗蚜基因進(jìn)行定位，從而指導(dǎo)田間育種工作。目的意義：1、高粱蚜蟲(chóng)嚴(yán)重危害高粱，通過(guò)對(duì)高粱抗蚜的研究可以有效控制田間高粱蚜蟲(chóng)。2、通過(guò)對(duì)高粱抗蚜基因的鑒定，可以大大縮減田間育種的年限，對(duì)育種工作具有指導(dǎo)性的意義。3、在抗蚜基因的研究可以從生物自身抵御高粱蚜蟲(chóng)，可以避免化學(xué)藥劑抗蚜蟲(chóng)造成的環(huán)境污染。文獻(xiàn)綜述：王富德等(1993)對(duì)3799份中國(guó)高粱品種資源進(jìn)行了抗高粱蚜鑒定,結(jié)果

7、表明,高抗的1份,抗的4份,占總數(shù)的0.13%;中感的441份,占總數(shù)的11.61%;其余88.26%的高粱資源對(duì)蚜蟲(chóng)的為害都很敏感。唯一1份高抗高粱蚜資源是恢復(fù)5-27(國(guó)家編號(hào)8432) ,在它的系譜中有抗高粱蚜的外國(guó)高粱品種tam428。對(duì)高粱蚜表現(xiàn)抗的4 份中國(guó)高粱品種分別是緊穗高粱(忻縣)、紅殼散碼(鹿邑) 、粘高粱(輝南)和大鑼錘高粱(沾化)。潘景芳等(1996) 報(bào)道,從1986年開(kāi)始,利用抗蚜源tam428等與非抗蚜材料雜交,從分離后代中選育出11份恢復(fù)系,并利用這些恢復(fù)系與6個(gè)不育系選配一批雜交種,又通過(guò)人工接蚜鑒定、產(chǎn)量鑒定和主要農(nóng)藝性狀鑒定,從中篩選出幾個(gè)較為優(yōu)良的抗蚜恢

8、復(fù)系及其高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗雜交種。1996-2000 年,在田間采用人工接菌法進(jìn)行高粱抗病性鑒定和利用田間自然發(fā)生的害蟲(chóng)種群與人工輔助接蟲(chóng)相結(jié)合的方法進(jìn)行高粱抗蟲(chóng)性鑒定,對(duì)1282 份高粱種質(zhì)資源進(jìn)行了高粱絲黑穗病、高粱靶斑病、高粱蚜蟲(chóng)和玉米螟等4種病蟲(chóng)害的抗性同步鑒定。劃清了被鑒定資源對(duì)不同病蟲(chóng)害的抗性等級(jí),篩選出兼抗2種病蟲(chóng)害的雙抗性資源93份,兼抗3種病蟲(chóng)害的多抗性資源9份。通過(guò)對(duì)抗蚜的河農(nóng)16和感蚜品系tx623b、tx622b、tx3197b、千三、晉五及雜交種的物理特性、組織結(jié)構(gòu)、生理生化特性的對(duì)比分析,研究了不同基因型高粱理化特性與抗蚜性的相關(guān)性。結(jié)果表明,高粱抗蚜品系葉片表面較感

9、蚜品系的細(xì)胞排列整齊、致密、表皮細(xì)胞直徑較感蚜品系小、葉片薄、葉片表面光滑、葉片顏色淺感蟲(chóng)后各品系過(guò)氧化物酶(pod)、多酚氧化酶(ppo)活性均有升高,與蚜蟲(chóng)的誘導(dǎo)存在相關(guān)性,但不同品系感蚜前后均不存在趨勢(shì)性變化;苯丙氨酸解氨酶(pal)酶活性感蟲(chóng)前在抗蟲(chóng)的河農(nóng)16及雜交種中具有高水平表達(dá),并與其他感蚜品系存在顯著差異;蚜蟲(chóng)侵害誘導(dǎo)后pal酶活性均有上升,但抗蚜品系中表現(xiàn)穩(wěn)定,酶活性變化幅度與葉片損傷程度存在相關(guān)性,pal酶活性與高粱的抗蚜性存在明顯的相關(guān)性。感蟲(chóng)前后氨基酸含量及其變化與高粱品系抗蚜性間無(wú)相關(guān)性;在感蚜蟲(chóng)前,抗蚜品系及其雜交種可溶性糖含量顯著高于感蚜品系,接蟲(chóng)后感蚜品系可溶性

10、糖含量升高顯著。1997年進(jìn)行大面積藥效試驗(yàn),70%高巧拌種即可有效控制蚜蟲(chóng)在高粱抽穗期(即為害盛期)的為害,結(jié)果表明70%高巧干種衣劑對(duì)高粱出苗期、出苗率及生育期無(wú)不良影響, 且有一定的壯苗促長(zhǎng)作用。對(duì)高粱苗期蚜蟲(chóng)控制效果明顯,并可控制蚜蟲(chóng)的危害到高粱抽穗期;即一次拌種就解決蚜害, 同時(shí)對(duì)地老虎還有一定的抑制作用。頭水進(jìn)地要及時(shí),避免高粱受旱,防蚜效果更佳。1982年，徐守珍等于田間和室內(nèi)鑒定了500余份國(guó)內(nèi)外種質(zhì)資源的抗蚜性, 從中發(fā)現(xiàn)tam428和dubor 2高抗高粱蚜。研究方法、內(nèi)容： 通過(guò)利用凝膠電泳對(duì)一些與抗蚜相關(guān)的ssr標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選出6對(duì)具有多態(tài)性的引物，并對(duì)高粱品

11、種“河農(nóng)16”和“千三”的f8重組自交系進(jìn)行ssr多態(tài)性分析，從而觀察篩選出的6對(duì)具有多態(tài)性引物在群體中的抗感情況，通過(guò)對(duì)群體電泳條帶的觀察，并結(jié)合對(duì)群體抗感表型的調(diào)查來(lái)找到與目的性狀相連鎖的基因。dna提?。褐饕抢胏tab法提取高粱葉片組織的dna。1）ctab提取緩沖液（2%ctab，1m tris-hclph8.0，0.5medta ph8.0，1.4 mmol/l nacl，2-巰基乙醇），65提前水??；剪取高粱葉片于研缽中加入800ulctab提取液研磨，將研磨液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中65水浴40min。（2）將離心管取出冷卻至室溫，加入等體積的氯仿:異戊醇（24:1），充分混勻

12、，配平后10,000 rpm離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中。 （3）加入2倍體積的預(yù)冷過(guò)的無(wú)水乙醇，輕輕顛倒數(shù)次即可見(jiàn)成團(tuán)白色dna絮狀沉淀析出(可以置于-20放置30 min)，10,000 rpm離心10 min，棄上清。（4）加1 ml 70乙醇進(jìn)行洗滌，10,000rpm離心5 min，重復(fù)本步驟2次。（5）去掉乙醇后室溫下風(fēng)干dna，加入50ul的dd h2o使之完全溶解。（6）紫外分光分度計(jì)檢測(cè)dna濃度，1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)dna完整性。pcr擴(kuò)增：pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5預(yù)變性 5min, 循環(huán) 95變性 30s、退火1min、72延伸 2min, 共 35個(gè)循環(huán),

13、最后在 72延伸 10min。pcr產(chǎn)物用8%的凝膠工作液電泳分離, 銀染顯色。統(tǒng)計(jì)分析：首先利用excel表統(tǒng)計(jì)田間表型觀察結(jié)果以及實(shí)驗(yàn)室鑒定結(jié)果，然后用mapmaker對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行計(jì)算, 用kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為遺傳圖距。進(jìn)度安排： 2012年5-6月：查閱資料，設(shè)計(jì)試驗(yàn)內(nèi)容，選擇高粱品種并進(jìn)行田間種植。2012年6-12月：撰寫(xiě)課程論文，開(kāi)展試驗(yàn)內(nèi)容，完成試驗(yàn)內(nèi)容。2013年1-6月：整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，完善試驗(yàn)內(nèi)容，撰寫(xiě)畢業(yè)論文，準(zhǔn)備答辯材料，進(jìn)行畢業(yè)答辯。指導(dǎo)教師意見(jiàn)：論文以測(cè)定利用ssr標(biāo)記對(duì)高粱重組自交系進(jìn)行抗蚜性鑒定為題，立題依據(jù)較充分，具有一定的理論和實(shí)用價(jià)值。試驗(yàn)方案

14、設(shè)計(jì)合理，科學(xué)可行，進(jìn)度安排合適，預(yù)期結(jié)果明確，同意開(kāi)題，并進(jìn)入下一階段試驗(yàn)內(nèi)容。指導(dǎo)教師：2012年6月 5 日審 核 小 組 成 員姓 名職 稱備 注姓 名職 稱備 注開(kāi)題報(bào)告記錄：1、pcr擴(kuò)增時(shí)需要注意什么？答：保證模板、使用物品的無(wú)污染和操作規(guī)范，針對(duì)不同作物的不同試驗(yàn)要求，建立相適應(yīng)的pcr反應(yīng)體系，又是取得試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。pcr反應(yīng)有幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：模板dna的純度和數(shù)量；引物的質(zhì)量與特異性；酶的質(zhì)量與數(shù)量；buffer（mg2+）數(shù)量；pcr循環(huán)條件。2、影響高粱蚜大發(fā)生的主要條件是什么？答：主要是受空氣濕度和溫度影響，根據(jù)前人相關(guān)報(bào)道，自6月中旬至7月中旬，平均氣溫在22-29

15、，旬平均相對(duì)濕度在55%-75%，溫度系數(shù)（旬雨量/旬平均氣溫）大多在1以下，是大發(fā)生的主要條件。審核小組評(píng)語(yǔ)：選題依據(jù)比較充分，試驗(yàn)安排合理，研究方法可行，同意開(kāi)題并進(jìn)入下一階段試驗(yàn)工作。審核小組組長(zhǎng)：（簽字）年 月 日學(xué)院意見(jiàn)：院長(zhǎng)：年 月 日河北農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文指導(dǎo)教師評(píng)閱書(shū)學(xué)生姓名：陳再軍 學(xué)號(hào)：2009014010215專業(yè)班級(jí)：農(nóng)學(xué)0902班級(jí)所在學(xué)院：農(nóng)學(xué)院論文題目：利用ssr標(biāo)記對(duì)高粱重組自交系進(jìn)行抗蚜性鑒定 指導(dǎo)教師評(píng)語(yǔ)： 陳再軍在本課題組開(kāi)展畢業(yè)論文工作期間，能夠遵守學(xué)校和學(xué)院的各項(xiàng)規(guī)章制度，較好的完成論文涉及研究任務(wù)，具有較扎實(shí)的基礎(chǔ)理論和專業(yè)知識(shí)。論文以高粱抗蚜基因

16、的定位研究?jī)?nèi)容。選題針對(duì)性較強(qiáng)，依據(jù)充分，具有一定的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排合理，技術(shù)路線可行，工作量較大，符合本科畢業(yè)論文要求。論文寫(xiě)作格式比較規(guī)范，文獻(xiàn)參考得當(dāng)，符合一般科技論文寫(xiě)作要求。論文不足之處在于：（1）文中討論部分應(yīng)著重討論本研究與前人研究的異同與創(chuàng)新性。（2）英文摘要尚需進(jìn)一步的推敲斟酌。（3）文中表格注意采用三線表。成 績(jī) 評(píng) 定：89是否同意答辯： 指導(dǎo)教師（簽名）： 2012年6 月2日河北農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文答辯評(píng)分表評(píng)分指標(biāo)分 值評(píng) 價(jià) 內(nèi) 容得 分論文選題10選題有重要理論意義或?qū)嵱脙r(jià)值。立題依據(jù)充分。文獻(xiàn)引用12閱讀、引用文獻(xiàn)資料較廣泛，較全面了解本領(lǐng)域?qū)W

17、術(shù)動(dòng)態(tài)，綜合分析能力較強(qiáng)。論文難度及工作量14難度較大，工作量大。論文成果的創(chuàng)新性12有獨(dú)到見(jiàn)解，有較大的創(chuàng)新性成果。理論基礎(chǔ)與科研能力16具有堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)理論和系統(tǒng)的專門知識(shí)，具有較強(qiáng)的獨(dú)立從事科研工作的能力，研究方法和技術(shù)體系得當(dāng)。寫(xiě)作能力16條理清楚，層次分明，說(shuō)理透徹，文筆流暢，表格、繪圖準(zhǔn)確規(guī)范，中外文摘要簡(jiǎn)明扼要，語(yǔ)句通順，語(yǔ)法正確，符合科技寫(xiě)作規(guī)范。答辯報(bào)告10能簡(jiǎn)明扼要、重點(diǎn)突出地闡述論文或設(shè)計(jì)的主要內(nèi)容，有新見(jiàn)解，結(jié)論明確；時(shí)間掌握恰當(dāng)?；卮饐?wèn)題10思維敏捷，邏輯性強(qiáng)，準(zhǔn)確流利地回答各種問(wèn)題?？?分10089注：本表為答辯小組成員評(píng)分用表，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照河北農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文質(zhì)量評(píng)

18、定參考標(biāo)準(zhǔn)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)2013 屆本科畢業(yè)論文答辯記錄表所在學(xué)院：農(nóng)學(xué)院 專業(yè)班級(jí)：農(nóng)學(xué)0902班 時(shí)間：2013 年 6 月 7 日學(xué) 生 姓 名陳再軍學(xué) 號(hào)2009014010215指導(dǎo)教師姓名常金華職 稱教授畢業(yè)論文題目：利用ssr標(biāo)記對(duì)高粱重組自交系進(jìn)行抗蚜性鑒定答 辯 小 組 成 員姓 名職 稱成 績(jī)姓 名職 稱成 績(jī)答辯小組評(píng)語(yǔ)：論文的立題依據(jù)較充分，試驗(yàn)數(shù)據(jù)比較可靠，工作量較大。論文寫(xiě)作格式比較規(guī)范，符合一般科技論文寫(xiě)作要求。在論文答辯過(guò)程中重點(diǎn)突出，回答問(wèn)題基本正確。答辯小組組長(zhǎng)：（簽字）2013年 6 月 7 日答 辯 成 績(jī)：89注：本表與學(xué)生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）一同在學(xué)院存檔

19、（必須用鋼筆書(shū)寫(xiě)）農(nóng)學(xué)院 本 科 畢 業(yè) 論 文題 目：利用ssr標(biāo)記對(duì)高粱重組自交系進(jìn)行抗蚜性鑒定 專業(yè)班級(jí)： 農(nóng) 學(xué) 0902 班 學(xué) 號(hào)： 2009014010215 學(xué)生姓名： 陳再軍 指導(dǎo)教師： 常金華 職 稱： 教 授 2013年5月20日利用ssr標(biāo)記對(duì)高粱重組自交系進(jìn)行抗蚜性鑒定陳再軍（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)0902班071001）摘要：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用凝膠電泳對(duì)一些與抗蚜相關(guān)的ssr標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選出6對(duì)具有多態(tài)性的引物，并對(duì)高粱品種“河農(nóng)16”和“千三”的f8重組自交系進(jìn)行ssr多態(tài)性分析，從而觀察篩選出的6對(duì)具有多態(tài)性引物在群體中的抗感情況，通過(guò)對(duì)群體電泳條帶的觀察，并

20、結(jié)合對(duì)群體抗感表型的調(diào)查來(lái)找到與目的性狀相連鎖的基因。結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)所用的分子標(biāo)記與抗蚜基因是相連鎖。關(guān)鍵詞：高粱；抗蚜性；ssr標(biāo)記；遺傳分析identification of the aphid resistance of sorghum bicolor with ssr markerchen zaijun (agriculture univercity of hebei,class agronomy of 0902,071001)abstract: this experiment by using gel electrophoresis for some ssr marker polym

21、orphism analysis associated with resistance to aphid, screened 5 pairs of polymorphic primers, and sorghum varieties “hn- 16” and qian san f8 recombinant inbred lines for ssr polymorphism analysis, in order to observe the screen for 5 polymorphic primers sense of resistance in the community, through

22、 the observation of the groups electrophoresis bands, and combining the survey of group feeling phenotypic resistance to find the traits and purpose in a chain of genes. results show that the molecular markers used in the experiment with aphid resistant gene is chain. key words: sorghum bicolor；aphi

23、d resistance；ssr marker; genetic analysis0引言【本實(shí)驗(yàn)意義】高粱作為世界上最重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量和質(zhì)量受到世界的關(guān)注和研究，它具有抗旱、耐澇及抗鹽堿等不良環(huán)境的特性。高粱蚜（melanaphis sacchari）主要危害高粱又可危害甘蔗、小麥、大麥、玉米等作物，是一種間歇性發(fā)生的猖獗害蟲(chóng)，每3-4年突發(fā)一次。蚜蟲(chóng)除直接從植物體內(nèi)吸收營(yíng)養(yǎng)外，還大量分泌蜜露等物質(zhì)污染作物，影響了植物的光合作用，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)1。通過(guò)對(duì)高粱抗蚜性的鑒定，對(duì)高粱研究育種方面具有一定的指導(dǎo)性意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展介紹】2008年，常金華2等人通過(guò)對(duì)抗蚜的河農(nóng)16和感蚜

24、品系tx623b、tx622b、tx3197b、千三、晉五及雜交種的物理特性、組織結(jié)構(gòu)、生理生化特性的對(duì)比分析,研究了不同基因型高粱理化特性與抗蚜性的相關(guān)性。結(jié)果表明,高粱抗蚜品系葉片表面較感蚜品系的細(xì)胞排列整齊、致密、表皮細(xì)胞直徑較感蚜品系小、葉片薄、葉片表面光滑，并且在所有的供試材料中，感蚜前后抗蟲(chóng)和感蟲(chóng)品系的pal酶存在規(guī)律性的變化。2010年，鄒劍秋等采用ssr技術(shù)，應(yīng)用分離群體分組分析法，分別利用恢復(fù)系分離群體（2381r矮四）和保持系分離群體（tx622b7050b），篩選抗絲黑穗病菌3號(hào)生理小種基因的分子標(biāo)記，最后在所用的ssr引物中篩選出4個(gè)，位于b染色體上，xtxp145位于

25、i染色體上，與抗病基因的重組率分別為9.6%和10.4%，距離抗病基因的遺傳圖距分別約為9.6cm和10.4cm3。2010年，余傳漲等人采用自行開(kāi)發(fā)的52個(gè)ssr標(biāo)記對(duì)41個(gè)高粱品種進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明, 52對(duì)ssr引物在3%瓊脂糖凝膠上共檢測(cè)出277個(gè)等位變異,平均每個(gè)位點(diǎn)有5-3個(gè)等位變異。通過(guò)聚類分析將41個(gè)高粱品種分為2個(gè)類群8 ?！颈緦?shí)驗(yàn)切入點(diǎn)】分子標(biāo)記能在dna水平上反映植物遺傳基礎(chǔ)的差異，是植物遺傳育種領(lǐng)域內(nèi)的一項(xiàng)新興技術(shù)。ssr（simple sequence repeat,簡(jiǎn)單重復(fù)序列）是當(dāng)今四大分子標(biāo)記技術(shù)之一。簡(jiǎn)單序列重復(fù)( simple sequence r

26、epeat , ssr) 又稱微衛(wèi)星( microsatellite) , 它是基于pcr 基礎(chǔ)上的一種分子標(biāo)記, 最早在人類基因組研究中發(fā)現(xiàn), 而后被應(yīng)用于植物、動(dòng)物等研究中。它是一種由1-5個(gè)核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的序列5。與形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記這3種標(biāo)記比較，分子標(biāo)記具有準(zhǔn)確度比較高、信息量大、遺傳多態(tài)性高、穩(wěn)定性、重復(fù)性好等特點(diǎn)6。因此ssr標(biāo)記在基因組研究中廣泛地應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、比較基因組和系統(tǒng)研究中,同時(shí)也是在分子水平上研究遺傳多樣性的有力工具。近年來(lái)隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,高粱的利用價(jià)值被逐步發(fā)掘出來(lái), 廣泛用于飼料, 燃料乙醇,

27、 制糖等產(chǎn)業(yè)。合理開(kāi)發(fā)利用高粱, 對(duì)我國(guó)糧食安全, 緩解能源危機(jī)具有重要意義。對(duì)高粱抗蚜性在分子方面的研究，一方面有助于高粱的產(chǎn)量的提高，另一方面，有利于緩解能源與糧食危機(jī)?！颈緦?shí)驗(yàn)的目的】本實(shí)驗(yàn)利用河農(nóng)16和千三的雜交組合，對(duì)高粱抗蚜性鑒定方法，抗性遺傳和ssr分子標(biāo)記等進(jìn)行了一些調(diào)查了解。其目的在于：了解高粱抗蚜性的遺傳鑒定方法，充分了解高粱抗蚜性的遺傳特點(diǎn)，建立一套適合高粱蚜抗性的ssr體系找到與高粱蚜抗性基因連鎖的分子標(biāo)記，為最終掌握高粱蚜抗性遺傳規(guī)律，克隆高粱蚜抗性基因奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1供試材料河農(nóng)16（ hn-16） 來(lái)源于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)利用從優(yōu)質(zhì)雜交種nk22 的分離后代

28、中獲得, 對(duì)高粱蚜表現(xiàn)免疫,是優(yōu)質(zhì)糧飼兼用型品種。千三( q s) 由千晉紅和三尺三的雜交后代選育, 是河北農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的一個(gè)豐產(chǎn)性較好的恢復(fù)系, 但對(duì)高粱蚜表現(xiàn)高感。1.2儀器與藥品實(shí)驗(yàn)儀器：試管若干、錐形瓶、離心管、研缽、剪刀、水浴鍋、離心機(jī)等。藥品：硝酸銀、氫氧化鈉、1.4 mmol/l nacl，2% ctab，1m tris-hclph8.0，0.5medta ph 8.0，1.4 mmol/l nacl，氯仿:異戊醇（24:1）、無(wú)水乙醇、70乙醇等。1.3方法1.3.1 dna的提取通過(guò)使用ctab法提取高粱葉片組織dna，具體步驟如下：（1）ctab提取緩沖液（2%ctab，1

29、m tris-hclph8.0，0.5medta ph8.0，1.4 mmol/l nacl，2-巰基乙醇），65提前水??；剪取高粱葉片于研缽中加入800ulctab提取液研磨，將研磨液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中65水浴40min。（2）將離心管取出冷卻至室溫，加入等體積的氯仿:異戊醇（24:1），充分混勻，配平后10,000 rpm離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中。 （3）加入2倍體積的預(yù)冷過(guò)的無(wú)水乙醇，輕輕顛倒數(shù)次即可見(jiàn)成團(tuán)白色dna絮狀沉淀析出(可以置于-20放置30 min)，10,000 rpm離心10 min，棄上清。（4）加1 ml 70乙醇進(jìn)行洗滌，10,000rpm離

30、心5 min，重復(fù)本步驟2次。（5）去掉乙醇后室溫下風(fēng)干dna，加入50ul的dd h2o使之完全溶解。（6）紫外分光分度計(jì)檢測(cè)dna濃度，1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)dna完整性。1.3.2 ssr擴(kuò)增 ssr引物序列見(jiàn)下表：引物名稱堿基序列（5端到3端）退火溫度/sb6m3174ftag cgg att caa tgt tgc52.74sb6m3174rtcc aca tca tct tcc aca a53.25sb6m3500ftcg tgc tgc ttg cct tca57.3sb6m3500rccg agc gtt gtt gtc ttc a57.56sb6m3610fgaa aag gtt

31、 gct tcg taa50.47sb6m3610rgaa cat ccg tcc cat aaa52.74sb6rj2880fatc gag cca tcc atc tca ac57.8sb6rj2880rtgg tcg aaa ttt acg aga caa a54.48g5-q-5-fatt gacg tac cga tgt ctc ta55g5-q-5-rtca gtc cat aaa aca tgt aca g55本實(shí)驗(yàn)中ssr擴(kuò)增采用10lpcr反應(yīng)體系。pcr體系（10l）模板dna 1.5l引物 0.5l10buffer 1ldntp 0.2ltaq酶 0.1ldd 水 6.2

32、 l反應(yīng)循環(huán)參數(shù)參照劉國(guó)慶7的方法，略作改動(dòng)：pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5預(yù)變性 5min, 循環(huán) 95變性 30s、退火1min、72延伸 2min, 共 35個(gè)循環(huán), 最后在 72延伸 10min。pcr產(chǎn)物用8%的凝膠工作液電泳分離, 銀染顯色（其8%的凝膠工作液和銀染試劑的配制見(jiàn)表1、2）。8%的凝膠工作液配制成分/溶液體積 20406080100超純水/ml 142842567010tbe/ml 24681040%貯液/ml 48121620temed/l 2040608010010%ap/l 2004006008001000（注：temed作用是促進(jìn)凝固，應(yīng)先加，ap作用是凝固，應(yīng)后加）

33、銀染過(guò)程藥品配制成分/溶液體積ml100150200250300硝酸銀/g0.20.30.40.50.6顯色液氫氧化鈉/g1.52.2533.754.5甲醛40%/ml11.522.531.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)ssr擴(kuò)增產(chǎn)物以0、1、2建立數(shù)據(jù)庫(kù)，在相同的標(biāo)記位置上， 抗蚜的條帶標(biāo)記為1，感蚜的條帶標(biāo)記為0，具有雙親的雜合體條帶標(biāo)記為2，沒(méi)有條帶或者模糊不清的條帶忽略不計(jì)（記為*），其中鑒定結(jié)果b表示感蚜， a表示抗蚜。根據(jù)趙雪梅，劉太峰，李云靜等人用人工去雄方法，利用抗蚜x感蚜、耐蚜x感蚜、感蚜x感蚜等組合的雜交后代和回交后代，對(duì)高粱品種抗蚜的遺傳規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果表明，高粱的抗蚜基因?qū)Ω醒粱?/p>

34、表現(xiàn)顯性，受主效單基因控制8。因此在存在雜合體的引物中，以抗蚜為表現(xiàn)性狀。2結(jié)果與分析2.1 模板 dna 質(zhì)量檢測(cè)用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的 dna 進(jìn)行檢測(cè), od260/od280的比值處于 1.691.92 之間, 表明提取的 dna樣品純度比較高, 少部分 dna 樣品有輕微的蛋白質(zhì)或 rna 污染。2.2 多態(tài)性引物的篩選圖1：親本引物條帶電泳結(jié)果根據(jù)上述兩親本間多態(tài)性引物的篩選結(jié)果和觀察，表明：所擴(kuò)增的條帶清晰、分辨率高、重現(xiàn)性好、多態(tài)性強(qiáng)，是較適宜的擴(kuò)增體系（見(jiàn)下圖1）。2.3數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)株系編號(hào)sb6m3174sb6m3500sb6m3610sb6rj2776sb6rj2880

35、引物g5-q-5表型調(diào)查鑒定結(jié)果1000200aa2000000bb3111111aa402*000aa50002*0aa6000000bb7000011aa811*111ba9220220aa11111111ba12220220ba13000200ba1410*111ba15010000aa16010000aa17000000bb18000000ab19111111aa20111111ba21000000ab22020200ba23000200aa24220222ba25110110aa26000000ab27000000bb28111111aa29212212aa30111111ba310

36、00200ba32220220aa33111111aa34111111aa35000200aa36000200ba37111112ba38111111aa39000000ab40000000ab41000000bb42000200ba43111111aa44000200aa45101110ba46101220ba4720*2*0aa48111110aa49200200ba50000000ab51020200ba52000000bb53000000bb54210210aa56000000bb57110000aa58000000bb59000000ab601*111aa61000000bb6210

37、*111aa63000000bb64210000ba65010000ba66010000aa670*1*ba68000000bb690001*0ba701011*1aa71110000ba720100*0aa73000000bb74000000ab75000000ab76111111ba77200220aa78111111aa79210220aa80000000bb8200*2*0ba8300*000ab84111111ba8511*111aa86111111aa87000000bb88000220aa89000000bb90210220aa910000*0bb92000011ba94*002

38、10ba96000000bb98000000bb99000000bb1000000*0bb101000000bb102000000bb103000000ab104000200ba108000000bb109111111aa110111211ba111000000bb112000000bb113000000bb114000000bb115111111aa116000000bb117220220aa118000000bb121000000bb122111111ba123000000ab124000000bb12520022*aa1270000*0bb128000200ba129200220aa13

39、0200220aa13211111*aa133000200ba134000000bb135000000bb137200222aa138000000bb139000000bb140111111aa141000000bb142000000bb143000000bb144000000bb2.4 抗蚜鑒定結(jié)果通過(guò)對(duì)高粱中這5對(duì)引物以及對(duì)高粱群體田間表型的調(diào)查，田間表型調(diào)查結(jié)果中有表現(xiàn)抗蚜的有59株，感蚜的有85株。在對(duì)引物進(jìn)行凝膠電泳后的結(jié)果鑒定中，可以發(fā)現(xiàn)其中植株表現(xiàn)為抗蚜的有79株，感蚜的65株。用mapmaker對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行計(jì)算, 用kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為遺傳圖距(見(jiàn)圖4)。結(jié)果顯示

40、, 表型抗蚜具有與抗親一致的分子標(biāo)記，能夠用分子標(biāo)記對(duì)高粱重組自交系群體進(jìn)行抗蚜性鑒定。圖4：分析連鎖圖圖2：田間調(diào)查時(shí)觀察到高粱葉片的抗感情況圖3：凝膠電泳結(jié)果條帶3討論在凝膠電泳的結(jié)果和田間表型調(diào)查作比較，發(fā)現(xiàn)一些存在有抗性基因的植株，在表型上卻表現(xiàn)為感蚜，而另外一些具有感蚜引物的植株，卻表現(xiàn)為抗蚜，其可能原因分析如下：3.1高粱植株的物理性狀與抗蚜性的關(guān)系通過(guò)田間調(diào)查和室內(nèi)分析 ,研究了不同基因型高粱對(duì)高粱蚜的抗性及其與高粱物理性狀間的關(guān)系。結(jié)果表明 ,高粱的抗蚜性屬顯性遺傳。高粱抗、感基因型間的蠟質(zhì)含量、葉片顏色、葉片表面結(jié)構(gòu)均存在差異?？寡疗废档南炠|(zhì)含量和葉綠素含量均低于感蚜品系 ,

41、并且葉片表面光滑 ,細(xì)胞排列整齊致密12。因此某些葉片蠟質(zhì)層含量高的3.2 不同溫度下對(duì)高粱植株抗蚜性的影響在高粱蚜蟲(chóng)大發(fā)生時(shí)期，由于蚜蟲(chóng)繁殖量較大，會(huì)對(duì)高粱植株造成嚴(yán)重危害，某些抗蚜的植株也可能會(huì)由收到危害。隨著氣溫的升高，從5月下旬開(kāi)始田間高粱苗陸續(xù)出土并見(jiàn)長(zhǎng)。同時(shí)在越冬寄主上的有翅蚜向高粱田遷移，遷移時(shí)間能一直持續(xù)到7月上旬，但尚有一部分高粱蚜居留于狄草上。在東北地區(qū)，高粱蚜是高溫干旱條件下發(fā)生嚴(yán)重的害蟲(chóng)，自6月中旬至7月中旬，平均氣溫在22-29，旬平均相對(duì)濕度在55%-75%，溫度系數(shù)（旬雨量/旬平均氣溫）大多在1以下，是大發(fā)生的主要條件。3.3 高粱抗蚜性基因的表達(dá)受環(huán)境的影響性狀

42、表現(xiàn)是遺傳因素和環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果，用cry1ab/cry1ac板式試劑盒測(cè)定了不同光照時(shí)間、不同溫度和不同水平氮肥處理下,cry1ab蛋白在轉(zhuǎn)基因高粱中的表達(dá)水平。結(jié)果表明,不同光照長(zhǎng)度處理的cry1ab蛋白含量有較大差異,其順序?yàn)?2 h16 h18 h14 h10 h;不同溫度處理對(duì)cry1ab蛋白含量也有較大差異,為2530203540;不同施肥水平下對(duì)cry1ab蛋白量也有較大影響,作基肥的以300 kg.hm-2純氮效果最佳15。3.4 人為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也具有很大方面的影響ssr標(biāo)記包括pcr和電泳檢測(cè)。安全進(jìn)行pcr的前提是保證模板、使用物品的無(wú)污染和操作規(guī)范，針對(duì)不同作物

43、的不同試驗(yàn)要求，建立相適應(yīng)的pcr反應(yīng)體系，又是取得試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。pcr反應(yīng)有幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：模板dna的純度和數(shù)量；引物的質(zhì)量與特異性；酶的質(zhì)量與數(shù)量；buffer（mg2+）數(shù)量；pcr循環(huán)條件9。因此在進(jìn)行抗性鑒定實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一定要特別注意這些步驟的操作。而且實(shí)驗(yàn)材料的選擇是在株系群體中選擇的，應(yīng)避免試驗(yàn)材料間dna的交叉污染或外來(lái)dna的污染。使用冷凍干燥葉片法，可以將每個(gè)樣品在單獨(dú)的離心管中研磨，研磨使用的小鋼珠最好是一次性的，如果是反復(fù)使用小鋼球，必須徹底清洗干凈。使用液氮和研缽研磨葉片組織時(shí)，必須在每次研磨前徹底清理干凈研缽和研磨棒10。以及在使用液氮研磨時(shí)，要先將研缽用液氮冷卻，在加入液氮后，要先將葉片壓碎，研磨時(shí)要快