第七章酶聯(lián)免疫法

1、第第七七章章 酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析法法第第七七章章 酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析法法 基本要求：基本要求： 了解免疫分析發(fā)展史，掌握抗原、抗體和免疫反應(yīng)的了解免疫分析發(fā)展史，掌握抗原、抗體和免疫反應(yīng)的原理，了解免疫分析法的分類，熟悉酶標(biāo)記免疫分析原理，了解免疫分析法的分類，熟悉酶標(biāo)記免疫分析法中使用的酶，熟悉法中使用的酶，熟悉ELISAELISA的原理，掌握的原理，掌握ELISAELISA的固相的固相載體、包被與封閉、稀釋液、洗滌液、酶反應(yīng)終止液載體、包被與封閉、稀釋液、洗滌液、酶反應(yīng)終止液及及ELISAELISA法常用酶的底物系統(tǒng)，掌握法常用酶的底物系統(tǒng)，掌握ELISAELISA的酶聯(lián)方法的

2、酶聯(lián)方法和試驗(yàn)方法，熟悉和試驗(yàn)方法，熟悉ELISAELISA反應(yīng)條件的選擇，掌握反應(yīng)條件的選擇，掌握ELISAELISA的定量計(jì)算，了解的定量計(jì)算，了解ELISAELISA的靈敏度提高途徑，熟悉的靈敏度提高途徑，熟悉ELISAELISA放大系統(tǒng)。了解化學(xué)發(fā)光分析的原理，熟悉化放大系統(tǒng)。了解化學(xué)發(fā)光分析的原理，熟悉化學(xué)發(fā)光劑的種類，熟悉化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常用的學(xué)發(fā)光劑的種類，熟悉化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常用的標(biāo)記酶和發(fā)光增強(qiáng)劑，熟悉生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常標(biāo)記酶和發(fā)光增強(qiáng)劑，熟悉生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常用的生物發(fā)光反應(yīng)體系。用的生物發(fā)光反應(yīng)體系。第第七七章章 酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析法法第一節(jié)第一節(jié)

3、酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述第二節(jié)第二節(jié) 光度酶聯(lián)免疫分析光度酶聯(lián)免疫分析第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述一、一、免疫分析免疫分析1 1、免疫分析發(fā)展史、免疫分析發(fā)展史 免疫分析免疫分析（ImmunoassayImmunoassay，IAIA）是利用）是利用待測(cè)物質(zhì)待測(cè)物質(zhì)（抗（抗原或抗體）與其原或抗體）與其相對(duì)應(yīng)物質(zhì)相對(duì)應(yīng)物質(zhì)（抗體或抗原）之間（抗體或抗原）之間專一專一特異性反應(yīng)特異性反應(yīng)而建立起來的一種而建立起來的一種高選擇性高選擇性分析方法。分析方法。 免疫分析主要基于用免疫分析主要基于用抗體抗體（或抗原）作為選擇性化學(xué)（或

4、抗原）作為選擇性化學(xué)試劑以分析試劑以分析測(cè)定抗原測(cè)定抗原（或抗體）及（或抗體）及半抗原半抗原。 宋代宋代 人工痘苗人工痘苗預(yù)防烈性傳染病天花預(yù)防烈性傳染病天花 19711971年年 第一屆國際免疫學(xué)會(huì)議第一屆國際免疫學(xué)會(huì)議 將免疫學(xué)與微生物將免疫學(xué)與微生物學(xué)分開發(fā)展成一門獨(dú)立的學(xué)科。學(xué)分開發(fā)展成一門獨(dú)立的學(xué)科。 “免疫（免疫（immunityimmunity）”一詞源于一詞源于 “ “immunitasimmunitas”，原，原意是免除稅賦和差役。意是免除稅賦和差役。 研究早期免疫學(xué)多集中在研究早期免疫學(xué)多集中在抗體抗感染能力抗體抗感染能力研究。研究。 2020世紀(jì)中期以后，人們逐漸世紀(jì)中期

5、以后，人們逐漸開始開始對(duì)各種抗原、微生物對(duì)各種抗原、微生物的作用進(jìn)行研究，發(fā)展的作用進(jìn)行研究，發(fā)展出出基礎(chǔ)免疫學(xué)、臨床免疫學(xué)、基礎(chǔ)免疫學(xué)、臨床免疫學(xué)、免疫學(xué)檢測(cè)、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)等多個(gè)分支。免疫學(xué)檢測(cè)、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)等多個(gè)分支。 現(xiàn)代免疫學(xué)將現(xiàn)代免疫學(xué)將“免疫免疫”定義為：定義為：機(jī)體機(jī)體對(duì)對(duì)“自己自己”和和“異己異己”識(shí)別識(shí)別、應(yīng)答過程中所產(chǎn)生的、應(yīng)答過程中所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)的總和生物學(xué)效應(yīng)的總和，正常情況下是，正常情況下是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種生理性功能。的一種生理性功能。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述2 2、抗原、抗體與免疫反應(yīng)、抗原、抗體與免疫反應(yīng) 抗原抗原是能夠引起

6、免疫反應(yīng)的分子。是能夠引起免疫反應(yīng)的分子。 免疫原性免疫原性（immunogenicityimmunogenicity）指指誘導(dǎo)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)誘導(dǎo)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。 具有免疫原性的物質(zhì)稱為具有免疫原性的物質(zhì)稱為免疫原免疫原（immunogenimmunogen）。 免疫反應(yīng)原性免疫反應(yīng)原性（immunoreactivityimmunoreactivity）或）或抗原性抗原性（antigenicityantigenicity），指能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)），指能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，引起免疫反應(yīng)的性能。生特異性結(jié)合，引起免疫

7、反應(yīng)的性能。 具備上述兩種特性的物質(zhì)為具備上述兩種特性的物質(zhì)為完全抗原完全抗原，僅具有免疫反，僅具有免疫反應(yīng)性的物質(zhì)被稱為應(yīng)性的物質(zhì)被稱為半抗原半抗原（haptenhapten）。）。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述 抗體抗體是能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的是能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白免疫球蛋白。 所有的抗體都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋所有的抗體都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白都是抗體白都是抗體。 例如例如無免疫活性的免疫球蛋白無免疫活性的免疫球蛋白（如（如骨髓瘤蛋白骨髓瘤蛋白）就不就不是抗體，是抗體，盡管盡管其結(jié)構(gòu)與抗體相似。其結(jié)構(gòu)與抗體相似。 抗體主要存在于血

8、清內(nèi)抗體主要存在于血清內(nèi)，但在其他體液及外分泌液中，但在其他體液及外分泌液中也有存在。也有存在。 抗原抗體分子抗原抗體分子之間存在著結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性和親和性之間存在著結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性和親和性，使得使得抗原與相應(yīng)抗體之間抗原與相應(yīng)抗體之間極極易發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，易發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，這種反應(yīng)這種反應(yīng)具具有有高特異性高特異性（即專一性即專一性）和）和可逆性可逆性。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述 抗原、抗體發(fā)生如下免疫反應(yīng)：抗原、抗體發(fā)生如下免疫反應(yīng)： Ag+Ab Ag-AbAg+Ab Ag-Ab 該免疫反應(yīng)遵循可逆生物大分子相互作用的熱動(dòng)力學(xué)該免疫反應(yīng)遵循可逆生物大分子相互作用的熱動(dòng)力學(xué)基本原理，其反應(yīng)

9、式為基本原理，其反應(yīng)式為 式中：式中：AbAb為游離的抗體結(jié)合位點(diǎn)的濃度；為游離的抗體結(jié)合位點(diǎn)的濃度；AgAg為游為游離的抗原結(jié)合位點(diǎn)的濃度；離的抗原結(jié)合位點(diǎn)的濃度；Ab-AgAb-Ag為抗原為抗原- -抗體復(fù)合抗體復(fù)合物的濃度；物的濃度；k k1 1為正反應(yīng)速率常數(shù)；為正反應(yīng)速率常數(shù)；k k2 2為負(fù)反應(yīng)速率常為負(fù)反應(yīng)速率常數(shù)；數(shù)；K K為為反應(yīng)平衡常數(shù)反應(yīng)平衡常數(shù)（親和常數(shù)親和常數(shù)）。Kkk21AbAgAg-Ab第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述 這種抗原這種抗原- -抗體反應(yīng)抗體反應(yīng)既既可發(fā)生于體內(nèi)（可發(fā)生于體內(nèi)（in vivoin vivo），也），也可發(fā)生于體外（可發(fā)生于

10、體外（in vitroin vitro）。）。 抗體主要存在于血清中，在抗原、抗體的檢測(cè)中多采抗體主要存在于血清中，在抗原、抗體的檢測(cè)中多采用血清做試驗(yàn)，所以用血清做試驗(yàn)，所以體外抗原體外抗原- -抗體反應(yīng)抗體反應(yīng)也稱為也稱為血清血清學(xué)反應(yīng)學(xué)反應(yīng)（serologic reactionserologic reaction）。）。 基于抗原基于抗原- -抗體反應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)主要應(yīng)用于以下幾個(gè)抗體反應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)主要應(yīng)用于以下幾個(gè)方面：方面：用已知抗原用已知抗原檢測(cè)未知抗體檢測(cè)未知抗體；用已知抗體用已知抗體檢測(cè)未知抗原檢測(cè)未知抗原；定性或定量定性或定量檢測(cè)檢測(cè)體內(nèi)體內(nèi)各種大分子物質(zhì)各種大分子物質(zhì)；用已知

11、抗體用已知抗體檢測(cè)檢測(cè)某些藥物、激素等各種某些藥物、激素等各種半抗原半抗原物質(zhì)。物質(zhì)。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述二、二、酶標(biāo)記免疫分析法及常用標(biāo)記酶酶標(biāo)記免疫分析法及常用標(biāo)記酶1 1、免疫分析法分類、免疫分析法分類免疫分析標(biāo)記免疫分析放射免疫分析法化學(xué)發(fā)光免疫分析法電化學(xué)免疫分析法熒光免疫分析法酶聯(lián)免疫分析法競(jìng)爭性酶聯(lián)免疫分析非競(jìng)爭性酶聯(lián)免疫分析均相酶聯(lián)免疫分析非均相酶聯(lián)免疫分析非標(biāo)記免疫分析沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、免疫電泳、免疫擴(kuò)散第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述2 2、酶標(biāo)記免疫分析法中使用的酶、酶標(biāo)記免疫分析法中使用的酶（1 1）酶聯(lián)免疫分析中使用的酶應(yīng)）酶

12、聯(lián)免疫分析中使用的酶應(yīng)符合下列條件符合下列條件：純度高純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化速率高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化速率高、專一性強(qiáng)專一性強(qiáng)；具有具有足夠的足夠的偶聯(lián)用偶聯(lián)用標(biāo)記基團(tuán)標(biāo)記基團(tuán)，與抗原、抗體蛋白分子，與抗原、抗體蛋白分子偶聯(lián)后仍保持較高的催化活性；偶聯(lián)后仍保持較高的催化活性；使用使用穩(wěn)定性穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性好好；測(cè)定測(cè)定酶活性的酶活性的方法簡便方法簡便、靈敏靈敏、快速快速；待測(cè)待測(cè)體液中不存在體液中不存在與標(biāo)記酶相同的酶；與標(biāo)記酶相同的酶；第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述待測(cè)溶液中待測(cè)溶液中應(yīng)該應(yīng)該無底物無底物、反應(yīng)抑制劑反應(yīng)抑制劑和其他與酶發(fā)生和其他與酶發(fā)生反應(yīng)的反應(yīng)的

13、干擾物質(zhì)干擾物質(zhì)；酶的來源、純化和供應(yīng)酶的來源、純化和供應(yīng)較方便較方便，價(jià)格，價(jià)格較低廉較低廉；均相酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定法中使用的酶，還要求當(dāng)抗體與半抗法中使用的酶，還要求當(dāng)抗體與半抗原原- -酶酶結(jié)合物結(jié)合結(jié)合物結(jié)合后，酶活性表現(xiàn)出后，酶活性表現(xiàn)出抑制或激活抑制或激活。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述（2 2）酶的評(píng)價(jià)指標(biāo)酶的評(píng)價(jià)指標(biāo) 通常通常用用RZRZ和和酶的比活酶的比活力評(píng)價(jià)力評(píng)價(jià)標(biāo)記標(biāo)記酶的質(zhì)量。酶的質(zhì)量。 RZRZ表示酶蛋白中表示酶蛋白中活性部分活性部分與與非活性部分非活性部分最大吸光度的最大吸光度的比值。比值。 酶的比活酶的比活力力指在特定條件下，每指在特定條件

14、下，每1mg1mg酶酶或或每每1ml1ml酶液所酶液所具有的酶活性單位數(shù)具有的酶活性單位數(shù)。（3 3）酶聯(lián)免疫分析中的常用酶酶聯(lián)免疫分析中的常用酶 下表下表列出了酶聯(lián)免疫列出了酶聯(lián)免疫分析中的常用酶。分析中的常用酶。其中其中ECEC編號(hào)編號(hào)是是根據(jù)國際酶學(xué)委員會(huì)根據(jù)國際酶學(xué)委員會(huì)的規(guī)定采用四碼編號(hào)法確定的每個(gè)酶的系統(tǒng)編號(hào)。的規(guī)定采用四碼編號(hào)法確定的每個(gè)酶的系統(tǒng)編號(hào)。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述酶酶來源來源EC編號(hào)編號(hào)辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶辣根辣根1.11.1.7酸性磷酸酶酸性磷酸酶動(dòng)植物動(dòng)植物3.1.3.2堿性磷酸酶堿性磷酸酶牛腸牛腸3.1.3.1-D-半乳糖苷酶半乳糖

15、苷酶大腸桿菌大腸桿菌3.2.1.23葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶曲霉菌曲霉菌1.1.3.4脲酶脲酶Jack豆豆3.5.1.5青霉素酶青霉素酶3.5.2.6過氧化氫酶過氧化氫酶肝肝1.11.1.6葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶根霉菌根霉菌3.2.1.3碳酸苷酶碳酸苷酶牛紅細(xì)胞牛紅細(xì)胞4.2.1.1乙酰膽堿酶乙酰膽堿酶3.1.1.7葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脫氫酶磷酸脫氫酶腸系膜明串細(xì)菌腸系膜明串細(xì)菌1.1.1.49溶菌酶溶菌酶雞卵白雞卵白3.2.1.17蘋果酸脫氫酶蘋果酸脫氫酶豬心線粒體豬心線粒體1.1.1.49無機(jī)焦磷酸酶無機(jī)焦磷酸酶大腸桿菌大腸桿菌3.6.1.1熒光素酶熒光素酶發(fā)光生物發(fā)光生物1.3.12

16、.7丙酮酸激酶丙酮酸激酶哺乳動(dòng)物組織哺乳動(dòng)物組織2.7.1.40酶聯(lián)免疫分析常用酶酶聯(lián)免疫分析常用酶第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶（horseradish peroxidasehorseradish peroxidase，HRPHRP）是是一種一種提取提取自自辣根中辣根中，相對(duì)，相對(duì)分子質(zhì)量為分子質(zhì)量為44kDa44kDa的的糖蛋糖蛋白白。 其酶學(xué)活性部分包括其酶學(xué)活性部分包括脫輔基蛋白脫輔基蛋白和和血紅素基團(tuán)血紅素基團(tuán)，輔基，輔基亞鐵血紅素在亞鐵血紅素在403nm403nm波長呈現(xiàn)最大光吸收值。波長呈現(xiàn)最大光吸收值。 HRPHRP的純度以的純度以R

17、ZRZ值即值即A A403nm403nm/A/A275nm275nm的值來衡量，高純度的值來衡量，高純度HRPHRP制劑的制劑的RZ3.0RZ3.0。 通常以能在通常以能在2020、pHpH為為6.06.0、20s20s的時(shí)間內(nèi)催化底物的時(shí)間內(nèi)催化底物鄰鄰苯三酚苯三酚產(chǎn)生產(chǎn)生1mg1mg紅桔酚紅桔酚（purpurogallinpurpurogallin）作為）作為HRPHRP酶酶的的1 1個(gè)活性單位。個(gè)活性單位。 用于標(biāo)記的用于標(biāo)記的HRPHRP比活性應(yīng)比活性應(yīng)大于大于250U/mg250U/mg。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述堿性磷酸酶堿性磷酸酶（alkaline phosp

18、hatasealkaline phosphatase，APAP）幾乎存在）幾乎存在于動(dòng)物和人體的所有組織中，尤其在肝臟、胎盤、白于動(dòng)物和人體的所有組織中，尤其在肝臟、胎盤、白細(xì)胞、腎小管中含量高。細(xì)胞、腎小管中含量高。 APAP是一種是一種磷酸酯磷酸酯的水解酶，它能夠催化磷酸單酯、的水解酶，它能夠催化磷酸單酯、磷磷酸核苷酸核苷及及6-6-磷酸糖類磷酸糖類等的水解，在釋放磷酸鹽的同時(shí)等的水解，在釋放磷酸鹽的同時(shí)產(chǎn)生有色的或熒光的產(chǎn)物。產(chǎn)生有色的或熒光的產(chǎn)物。 堿性磷酸酶的分子質(zhì)量為堿性磷酸酶的分子質(zhì)量為8080100kDa100kDa，最適，最適pHpH為為8.08.010.010.0，隨酶源和

19、底物的不同而變化。，隨酶源和底物的不同而變化。 APAP活性的測(cè)定以活性的測(cè)定以對(duì)硝基磷酸苯酯對(duì)硝基磷酸苯酯（PNPPNP）作為底物。）作為底物。 用作標(biāo)記的用作標(biāo)記的APAP比活比活力力應(yīng)應(yīng)大于大于1000U/mg1000U/mg。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（glucose oxidaseglucose oxidase，GODGOD）即即-D-D-葡葡萄糖氧化還原酶，一般由黑曲霉和青霉產(chǎn)生萄糖氧化還原酶，一般由黑曲霉和青霉產(chǎn)生。 它催化它催化O O2 2和和-D-D-葡萄糖的反應(yīng)形成葡萄糖的反應(yīng)形成H H2 2O O2 2和和D-D-葡萄糖酸葡萄糖

20、酸-內(nèi)酯，酯再與水反應(yīng)生成葡糖酸。內(nèi)酯，酯再與水反應(yīng)生成葡糖酸。 其反應(yīng)最適其反應(yīng)最適pHpH范圍為范圍為4.04.07.07.0，pH5.5pH5.5時(shí)，反應(yīng)速率時(shí)，反應(yīng)速率最大。葡萄糖氧化酶對(duì)最大。葡萄糖氧化酶對(duì)-D-D-葡萄糖的葡萄糖的-異頭碳有異頭碳有高高度專一性度專一性。 葡萄糖氧化酶的比活葡萄糖氧化酶的比活力力至少為至少為20U/mg20U/mg。 葡萄糖氧化酶在葡萄糖氧化酶在44下可穩(wěn)定存在下可穩(wěn)定存在6 61212個(gè)月。個(gè)月。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述-D-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶（-D-galactosidase-D-galactosidase，GalGa

21、l）即即乳乳糖酶（糖酶（-lactase-lactase），廣泛存在于植物、動(dòng)物器官、），廣泛存在于植物、動(dòng)物器官、細(xì)菌、酵母和真菌中。細(xì)菌、酵母和真菌中。 當(dāng)當(dāng)GalGal催化水解催化水解-D-D-半乳糖苷時(shí)，若得到的半乳糖殘半乳糖苷時(shí)，若得到的半乳糖殘基轉(zhuǎn)移到水分子受體，稱為基轉(zhuǎn)移到水分子受體，稱為水解水解；若受體是糖或醇時(shí)；若受體是糖或醇時(shí)，稱為，稱為轉(zhuǎn)半乳糖苷轉(zhuǎn)半乳糖苷。 GalGal催化催化-D-D-半乳糖苷水解反應(yīng)的最適半乳糖苷水解反應(yīng)的最適pHpH為為7.57.5，轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)化效率很高，且比化效率很高，且比HRPHRP易于標(biāo)記，背景值低，穩(wěn)定性易于標(biāo)記，背景值低，穩(wěn)定性好。好。 Ga

22、lGal比活比活力力應(yīng)不少于應(yīng)不少于30U/mg30U/mg，55能保存能保存1 12 2年。年。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法一、一、光度酶聯(lián)免疫分析光度酶聯(lián)免疫分析1 1、酶聯(lián)免疫吸附分析（、酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent enzyme-linked immunosorbent assayassay，ELISAELISA）原理）原理使抗原或抗體使抗原或抗體結(jié)合結(jié)合到某種到某種固相載體表面固相載體表面；抗原或抗體與某種酶聯(lián)結(jié)成抗原或抗體與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo)抗原酶標(biāo)抗原或或抗體抗體； 在測(cè)

23、定時(shí)，使在測(cè)定時(shí)，使受檢標(biāo)本受檢標(biāo)本和和酶標(biāo)抗原酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步或抗體按不同的步驟驟與固相抗原與固相抗原或固相抗體起或固相抗體起反應(yīng)反應(yīng)； 用用洗滌洗滌的方法使固相載體上形成的的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物抗原抗體復(fù)合物與與其他物質(zhì)分開，結(jié)合在固相載體上的其他物質(zhì)分開，結(jié)合在固相載體上的酶量與酶量與標(biāo)本中標(biāo)本中受受檢物質(zhì)的量成檢物質(zhì)的量成一定的一定的比例比例； 加入酶反應(yīng)加入酶反應(yīng)底物底物，底物被酶催化為，底物被酶催化為有色產(chǎn)物有色產(chǎn)物，產(chǎn)物量，產(chǎn)物量與與標(biāo)本中標(biāo)本中受檢物受檢物的的量相關(guān)量相關(guān)，用分光光度法進(jìn)行定量。，用分光光度法進(jìn)行定量。* *A Ag g是是酶標(biāo)志抗原酶標(biāo)

24、志抗原，A Ag g是是未標(biāo)志抗原未標(biāo)志抗原，A Ab b是特異性抗體是特異性抗體，(F)(F)表示游離型的表示游離型的* *A Ag g，(B)(B)表示結(jié)合型的表示結(jié)合型的* *A Ag g- -A Ab b。*( )( )gbgbggbAAAAFBAAA第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法2 2、ELISAELISA的固相載體的固相載體 良好的良好的ELISAELISA板應(yīng)該是板應(yīng)該是吸附性能好吸附性能好，空白值低空白值低，孔底，孔底透明度高透明度高，各板之間、同一板各孔之間，各板之間、同一板各孔之間性能相近性能相近。 最常用的是最常用的是聚苯乙烯聚苯乙烯。 聚氯乙烯對(duì)蛋白

25、質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。值也略高。 ELISAELISA載體的形式有載體的形式有小試管小試管、小珠小珠和和微量反應(yīng)板微量反應(yīng)板。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法3 3、固相載體的包被與封閉、固相載體的包被與封閉（1 1）包被包被（coatingcoating）指將）指將抗原抗原或抗體或抗體連接連接到到固相載體固相載體上的過程。上的過程。 以聚苯乙烯微量反應(yīng)板為例，通常先將抗原或抗體溶以聚苯乙烯微量反應(yīng)板為例，通常先將抗原或抗體溶于于pH 9.6pH 9.6的的碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液（或（或pH 7.2pH 7.

26、2的磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽緩沖液，pH 7pH 78 8的的Tris-HClTris-HCl緩沖液）中，緩沖液）中，加滿反應(yīng)孔加滿反應(yīng)孔，置，置44過夜過夜，洗滌即可。，洗滌即可。 包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。 一般蛋白質(zhì)的包被濃度為一般蛋白質(zhì)的包被濃度為0.10.120g/ml20g/ml。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法（2 2）封閉封閉（blockingblocking）指繼包被之后用）指繼包被之后用高濃度高濃度的的無關(guān)無關(guān)蛋

27、白質(zhì)蛋白質(zhì)溶液溶液再包被再包被的過程。的過程。 封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥排斥ELISAELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 所有的所有的ELISAELISA固相載體均需封閉固相載體均需封閉。 常用封閉劑有常用封閉劑有0.05%0.05%0.5% 0.5% BSABSA；10%10%小牛血清小牛血清或或1%1%明明膠膠；脫脂奶粉脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可高濃度使用（，比較價(jià)廉，可高濃度使用（5%5%）。）。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法4 4、稀釋液、洗滌液和酶反應(yīng)終止液、稀釋液

28、、洗滌液和酶反應(yīng)終止液（1 1）稀釋液稀釋液用于稀釋酶標(biāo)抗體及標(biāo)本。用于稀釋酶標(biāo)抗體及標(biāo)本。 常用常用中性中性PBSPBS或或Tris-HClTris-HCl緩沖液緩沖液，其中含有，其中含有無關(guān)高濃無關(guān)高濃度蛋白度蛋白（如（如1010動(dòng)物血清、動(dòng)物血清、1 1BSABSA（牛血清白蛋白）（牛血清白蛋白）、1 1明膠等）和明膠等）和非離子型表面活性劑非離子型表面活性劑（如（如0.050.05Tween 20Tween 20或或TritonX-100TritonX-100等）。等）。（2 2）洗滌液洗滌液一般與稀釋液相同，常用一般與稀釋液相同，常用PBSPBS或或Tris-HClTris-HCl緩

29、緩沖液。沖液。 四種常用的抗體稀釋液和三種常用的洗滌液列于表四種常用的抗體稀釋液和三種常用的洗滌液列于表7-7-2 2。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法編編號(hào)號(hào)吐溫吐溫20/%組成組成稀稀釋釋液液10.05PBS 0.01mol/L，pH 7.42PBS 0.05mol/L，pH 7.43PBS 0.05mol/L，pH 7.4，含，含EDTA 10mmol/L4PBS 0.05mol/L，pH 6.9，含，含EDTA 10mmol/L洗洗滌滌液液10.1PBS 0.01mol/L，pH 7.22PBS 0.01mol/L，pH 8.03Tris-HCl緩沖液緩沖液0.01m

30、ol/L，pH 8.0，NaCl 0.15mol/L表表7-2 常用的抗體稀釋液和洗滌液常用的抗體稀釋液和洗滌液第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法（3 3）酶反應(yīng)終止液）酶反應(yīng)終止液 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶（HRPHRP）反應(yīng)終止液為）反應(yīng)終止液為2mol/L2mol/L4mol/L 4mol/L H H2 2SOSO4 4（HRPHRP在酸性條件下喪失酶活性）。在酸性條件下喪失酶活性）。 很多很多ELISAELISA試劑采用試劑采用堿性磷酸酶堿性磷酸酶（APAP）作為標(biāo)記酶）作為標(biāo)記酶，用用3mol/L NaOH3mol/L NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一終止酶反應(yīng)

31、后，黃色可穩(wěn)定一段段時(shí)間。時(shí)間。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法5 5、ELISAELISA法常用酶的底物系統(tǒng)法常用酶的底物系統(tǒng) ELISAELISA法法對(duì)底物的要求對(duì)底物的要求： 價(jià)廉易得價(jià)廉易得、安全安全； 顯色性顯色性和和穩(wěn)定性穩(wěn)定性好好； 底物底物本身最好本身最好為為無色無色物質(zhì)物質(zhì)； 終止終止酶催化反應(yīng)后酶催化反應(yīng)后，底物底物不應(yīng)再不應(yīng)再繼續(xù)地繼續(xù)地自發(fā)性變性自發(fā)性變性； 其最終其最終產(chǎn)物可溶產(chǎn)物可溶、易于測(cè)定易于測(cè)定及及光吸收值高光吸收值高。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法（1 1）辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶的底物系統(tǒng)的底物系統(tǒng) 常見底物有常見

32、底物有鄰苯二胺鄰苯二胺（OPDOPD，產(chǎn)物橙紅色，測(cè)定波長，產(chǎn)物橙紅色，測(cè)定波長492nm492nm）、）、5-5-氨基水楊氨基水楊酸酸 （ 5 - A S5 - A S ， 產(chǎn) 物 橙 色 ， 測(cè) 定 波 長， 產(chǎn) 物 橙 色 ， 測(cè) 定 波 長 5 5 0 n m5 5 0 n m ） 、） 、3,3,5,5-3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺（TMBTMB，產(chǎn)物紅色，測(cè)定，產(chǎn)物紅色，測(cè)定波長波長450nm450nm）、）、2,2-2,2-連氮連氮- -二二（3-3-乙基苯并噻唑啉乙基苯并噻唑啉- -6-6-磺酸鹽磺酸鹽）（）（ABTSABTS）等。）等。 ABTSABTS的的反應(yīng)曲

33、線不好反應(yīng)曲線不好。 OPDOPD溶液具有溶液具有光敏性光敏性，相對(duì)來說不穩(wěn)定，且具有誘變，相對(duì)來說不穩(wěn)定，且具有誘變特性特性。 TMBTMB的的背景值低背景值低，溶液，溶液穩(wěn)定穩(wěn)定，沒有誘變沒有誘變特性。特性。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法（2 2）堿性磷酸酶堿性磷酸酶的底物系統(tǒng)的底物系統(tǒng) 常用的底物為常用的底物為對(duì)硝基磷對(duì)硝基磷酸苯酯酸苯酯（PNPPNP），水解的產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基苯酚，），水解的產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基苯酚，可在可在405nm405nm處檢測(cè)其吸光度的變化，該底物的轉(zhuǎn)化效處檢測(cè)其吸光度的變化，該底物的轉(zhuǎn)化效率高，線性關(guān)系好率高，線性關(guān)系好。 用用酚酞磷酸酯酚

34、酞磷酸酯為底物，水解生成的酚酞在堿性條件下為底物，水解生成的酚酞在堿性條件下呈紅色，可在呈紅色，可在530nm530nm處光度法測(cè)定處光度法測(cè)定。 此外還可以此外還可以百里酚酞單磷酸酯百里酚酞單磷酸酯等等為為底物。底物。 第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法（3 3）-D-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶的底物系統(tǒng)的底物系統(tǒng) 常見底物有常見底物有鄰硝基鄰硝基苯苯-D-D-半乳糖苷半乳糖苷（ONPGONPG），其水解的產(chǎn)物鄰硝基苯），其水解的產(chǎn)物鄰硝基苯酚在酚在405nm405nm處具有最大吸光度值處具有最大吸光度值。 其他的底物有其他的底物有對(duì)硝基苯對(duì)硝基苯-D-D-半乳糖苷半乳糖苷（P

35、NPGPNPG）、）、苯苯基基-D-D-半乳糖苷半乳糖苷、氯酚紅氯酚紅-D-D-半乳糖苷半乳糖苷（CPRGCPRG）、9-9-羥基羥基-3-3-異吩噁唑酮異吩噁唑酮-D-D-半乳糖苷半乳糖苷（RGRG）等。）等。（4 4）青霉素酶青霉素酶（PNCPNC）的底物系統(tǒng)）的底物系統(tǒng) 常用底物有常用底物有溴麝香溴麝香草酚藍(lán)草酚藍(lán)（BTBBTB）、）、青霉酮酸還原淀粉青霉酮酸還原淀粉- -碘復(fù)合物碘復(fù)合物（SICSIC）、）、溴甲酚紫溴甲酚紫（BCPBCP）和）和溴麝香草酚藍(lán)溴麝香草酚藍(lán)（2 21 1）等。）等。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法二、二、ELISAELISA酶聯(lián)方法和試驗(yàn)

36、方法酶聯(lián)方法和試驗(yàn)方法1 1、ELISAELISA酶聯(lián)方法酶聯(lián)方法 ELISAELISA酶聯(lián)方法主要有兩種，即酶聯(lián)方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法和和過碘過碘酸鹽氧化法酸鹽氧化法。 （1 1）戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法 戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以它可以聯(lián)結(jié)具有氨基的酶和蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)具有氨基的酶和蛋白質(zhì)。 戊二醛交聯(lián)法有戊二醛交聯(lián)法有一步法一步法、兩步法兩步法兩種。兩種。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法NH2+ HCCHOONH2+CCNHHNCCNHHNCCNHHN+圖圖7-2 戊二醛一步法反應(yīng)原理戊二醛一步法反應(yīng)原理一步法一步法 將戊二

37、醛將戊二醛直接直接加入加入酶與抗體的混合物酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。抗體。 該法操作該法操作簡便簡便、有效有效，重復(fù)性好重復(fù)性好。 缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)隨機(jī)的，酶與酶、抗體與抗的，酶與酶、抗體與抗體之間有可能交聯(lián)。體之間有可能交聯(lián)。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法HCCHOONH2+CCNOHHCCNHHNNH2圖圖7-3 戊二醛二步法反應(yīng)原理戊二醛二步法反應(yīng)原理兩步法兩步法 先將先將酶與戊二醛酶與戊二醛作用作用，透析透析除去多余的除去多余的戊二醛后，再與戊二醛后，再與抗體抗體作作用而形成酶標(biāo)抗體；用而形成酶標(biāo)抗體；或或先將

38、抗體與戊二醛作用先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。，再與酶聯(lián)結(jié)。 兩步法的產(chǎn)物中絕大部兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，的比例結(jié)合的，有助于有助于本底的改善本底的改善。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法（2 2）過碘酸鹽氧化法）過碘酸鹽氧化法 本法只適用于本法只適用于含糖量較高含糖量較高的酶。的酶。 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶（HRPHRP）的標(biāo)記常用此法。）的標(biāo)記常用此法。 反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)時(shí)，過碘酸鈉過碘酸鈉將將HRPHRP分子表面的多糖氧化為活潑分子表面的多糖氧化為活潑的的醛基醛基，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Sc

39、hiffSchiff氏堿氏堿而結(jié)合。而結(jié)合。 圖圖7-4 7-4 過碘酸鹽氧化法過碘酸鹽氧化法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法2 2、ELISAELISA試驗(yàn)方法試驗(yàn)方法 ELISAELISA法中有三個(gè)必要試劑：法中有三個(gè)必要試劑：固相抗原固相抗原或抗體；或抗體；酶標(biāo)記抗原酶標(biāo)記抗原或抗體；或抗體；酶反應(yīng)底物酶反應(yīng)底物。 根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具體條件，根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法?？稍O(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。 如如雙抗體夾心法雙抗體夾心法、間接法間接法、競(jìng)爭法競(jìng)爭法、異種動(dòng)物抗體雙異種動(dòng)物抗體雙夾心法夾心法、

40、抗酶抗體法抗酶抗體法、競(jìng)爭性抑制法競(jìng)爭性抑制法、雙夾心法雙夾心法和和抗抗原直接包被法原直接包被法等方法。等方法。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法（1 1）雙抗體夾心法雙抗體夾心法 雙抗體夾心法雙抗體夾心法（double antibody sandwichdouble antibody sandwich，DAS-DAS-ELISAELISA）由）由ClarkClark和和AdamsAdams于于19771977年建立，是最經(jīng)典的年建立，是最經(jīng)典的ELISAELISA檢測(cè)法檢測(cè)法。 該法的該法的靈敏度高靈敏度高，特異性強(qiáng)特異性強(qiáng)，但提純免疫球蛋白和制，但提純免疫球蛋白和制備酶標(biāo)記

41、物要求備酶標(biāo)記物要求技術(shù)性強(qiáng)技術(shù)性強(qiáng)，成本較高成本較高。 該法該法只適用于二價(jià)或二價(jià)以上較大分子抗原的檢出和只適用于二價(jià)或二價(jià)以上較大分子抗原的檢出和定量分析定量分析，而不能用于半抗原等小分子的測(cè)定。，而不能用于半抗原等小分子的測(cè)定。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法圖圖7-5 雙抗體夾心法雙抗體夾心法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法（2 2）間接法間接法 間接法間接法（indirect ELISAindirect ELISA）是最常用的）是最常用的ELISAELISA檢測(cè)方檢測(cè)方法，其原理是利用法，其原理是利用酶標(biāo)記的抗體酶標(biāo)記的抗體和已與和已與固相抗原固相

42、抗原結(jié)合結(jié)合的受檢的受檢抗體抗體相結(jié)合。相結(jié)合。 該法只要該法只要更換不同的固相抗原更換不同的固相抗原，就可以，就可以用一種酶標(biāo)抗用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。各種與抗原相應(yīng)的抗體。 該方法不必為每個(gè)待測(cè)抗體（或抗原）制備特異性的該方法不必為每個(gè)待測(cè)抗體（或抗原）制備特異性的酶標(biāo)抗抗體（或酶標(biāo)抗體），極大地酶標(biāo)抗抗體（或酶標(biāo)抗體），極大地簡化簡化了實(shí)驗(yàn)。了實(shí)驗(yàn)。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法圖圖7-6 間接法間接法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法（3 3）競(jìng)爭法競(jìng)爭法 競(jìng)爭法（競(jìng)爭法（competing ELISAcompeting E

43、LISA）是利用）是利用待測(cè)抗原待測(cè)抗原和和酶標(biāo)酶標(biāo)抗原抗原與與特異性抗體特異性抗體競(jìng)爭結(jié)合，競(jìng)爭結(jié)合，或或待測(cè)抗體和酶標(biāo)抗體待測(cè)抗體和酶標(biāo)抗體與特異性抗原競(jìng)爭結(jié)合而進(jìn)行測(cè)定的一種方法（圖與特異性抗原競(jìng)爭結(jié)合而進(jìn)行測(cè)定的一種方法（圖7-7-7 7）。）。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法圖圖7-7 競(jìng)爭法競(jìng)爭法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法（4 4）異種動(dòng)物抗體雙夾心法異種動(dòng)物抗體雙夾心法 異種動(dòng)物抗體雙夾心法異種動(dòng)物抗體雙夾心法（圖（圖7-87-8），又稱），又稱間接雙抗體間接雙抗體夾心法夾心法（indirect DAS-ELISAindirect DAS

44、-ELISA）或）或三抗體夾心法三抗體夾心法（triple antibodies sandwichtriple antibodies sandwich，TAS-ELISATAS-ELISA）。）。 此法可用此法可用通用的酶標(biāo)記抗體檢驗(yàn)多種病毒通用的酶標(biāo)記抗體檢驗(yàn)多種病毒，它不僅免，它不僅免去了標(biāo)記每種抗體，而且靈敏度有所提高。去了標(biāo)記每種抗體，而且靈敏度有所提高。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法圖圖7-8 異種動(dòng)物抗體夾心法異種動(dòng)物抗體夾心法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法（5 5）抗酶抗體法抗酶抗體法 抗酶抗體法抗酶抗體法（圖（圖7-97-9）是）是利用免

45、疫學(xué)反應(yīng)利用免疫學(xué)反應(yīng)而不是用化而不是用化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)來學(xué)交聯(lián)反應(yīng)來制備酶結(jié)合物制備酶結(jié)合物，常用，常用HRPHRP為標(biāo)記酶為標(biāo)記酶作為作為抗原抗原免疫動(dòng)物制備抗免疫動(dòng)物制備抗HRPHRP抗體抗體。 可用一種動(dòng)物（如可用一種動(dòng)物（如兔兔）制備）制備特異性抗體特異性抗體（第一抗體）（第一抗體）和和抗酶抗體抗酶抗體（第三抗體），再用另一種動(dòng)物（如（第三抗體），再用另一種動(dòng)物（如羊羊）制備制備抗第一種動(dòng)物抗第一種動(dòng)物（兔）（兔）IgGIgG的抗體的抗體（第二抗體）。（第二抗體）。 讓這種抗讓這種抗IgGIgG的的第二抗體第二抗體把把第一抗體第一抗體（兔（兔IgGIgG）和）和抗酶抗酶抗體抗體（也為兔（

46、也為兔IgGIgG）通過免疫學(xué)反應(yīng)連接起來。）通過免疫學(xué)反應(yīng)連接起來。 最后讓最后讓酶與抗酶抗體結(jié)合酶與抗酶抗體結(jié)合，通過對(duì)底物的作用而揭示，通過對(duì)底物的作用而揭示在固相載體上待測(cè)抗原的存在。在固相載體上待測(cè)抗原的存在。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):HRP:HRP通過免疫學(xué)反應(yīng)與抗體結(jié)合通過免疫學(xué)反應(yīng)與抗體結(jié)合，避免了用化學(xué)，避免了用化學(xué)方法交聯(lián)時(shí)抗體活性的改變，也避免了方法交聯(lián)時(shí)抗體活性的改變，也避免了HRPHRP與其他蛋與其他蛋白質(zhì)分子結(jié)合，白質(zhì)分子結(jié)合，防止防止標(biāo)記抗體和游離的未標(biāo)記抗體之標(biāo)記抗體和游離的未標(biāo)記抗體之間的間的競(jìng)爭競(jìng)爭，提高了標(biāo)記抗體的質(zhì)量提

47、高了標(biāo)記抗體的質(zhì)量。 在純化化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)制備的酶結(jié)合物的過程中，除去在純化化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)制備的酶結(jié)合物的過程中，除去未標(biāo)記抗體比較困難，而且該法未標(biāo)記抗體比較困難，而且該法僅在制備抗酶抗體時(shí)僅在制備抗酶抗體時(shí)用少量純用少量純HRPHRP作抗原作抗原，所以用較粗制的，所以用較粗制的HRPHRP與抗酶抗體與抗酶抗體形成免疫復(fù)合物，并不影響其質(zhì)量，這大大形成免疫復(fù)合物，并不影響其質(zhì)量，這大大節(jié)約節(jié)約了價(jià)了價(jià)格較昂貴的精制格較昂貴的精制HRPHRP。 因?yàn)橹苽淇姑缚贵w必須在動(dòng)物中進(jìn)行，故抗酶抗體法因?yàn)橹苽淇姑缚贵w必須在動(dòng)物中進(jìn)行，故抗酶抗體法多多適用于檢測(cè)動(dòng)物中的抗體適用于檢測(cè)動(dòng)物中的抗體。第二節(jié)第二節(jié)

48、 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法圖圖7-9 抗酶抗體法抗酶抗體法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法三、三、ELISA反應(yīng)條件的反應(yīng)條件的選擇選擇1 1、酶標(biāo)抗體濃度的選擇、酶標(biāo)抗體濃度的選擇 先用先用200200L L IgGIgG（100 100 mg/mlmg/ml）包被包被小孔，小孔，再再將將酶標(biāo)記抗體球蛋白酶標(biāo)記抗體球蛋白系系列稀釋并加入小孔中，列稀釋并加入小孔中，洗滌洗滌后，加后，加底物底物反應(yīng)反應(yīng)，終止終止后后測(cè)定測(cè)定吸光度。吸光度。 選擇選擇吸光度為吸光度為1 1的稀釋的稀釋度度作為酶標(biāo)抗體最適濃作為酶標(biāo)抗體最適濃度。度。圖圖7-10 酶標(biāo)抗體濃度的選擇酶標(biāo)

49、抗體濃度的選擇第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法2 2、包被濃度的選擇、包被濃度的選擇 當(dāng)包被抗原的當(dāng)包被抗原的濃度較濃度較低時(shí)低時(shí)，包被量，包被量隨隨抗原抗原濃度的增加濃度的增加而而增大增大；當(dāng)包被抗原當(dāng)包被抗原達(dá)到一定達(dá)到一定濃度后濃度后，包被量為定包被量為定值值，不再隨抗原濃度，不再隨抗原濃度的增加而增大的增加而增大。 此濃度稱為此濃度稱為抗原的飽抗原的飽和包被濃度和包被濃度。圖圖7-11 抗原包被量和抗原包被量和ELISA反應(yīng)的關(guān)系反應(yīng)的關(guān)系 第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法 表表7-3 SM-EDA-GA7-3 SM-EDA-GA包被法中鏈霉素包被質(zhì)

50、量濃度對(duì)包被法中鏈霉素包被質(zhì)量濃度對(duì)ELISAELISA實(shí)驗(yàn)誤差的影響實(shí)驗(yàn)誤差的影響包被質(zhì)量濃度（包被質(zhì)量濃度（mg/mlmg/ml）ELISAELISA測(cè)定結(jié)果（測(cè)定結(jié)果（A A492492SDSD）（n n=4=4）4 41.0981.0980.06280.06281 1* *1.0111.0110.03020.03020.50.50.9690.9690.08760.08760.250.250.7920.7920.10230.1023第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法3 3、酶、酶- -底物反應(yīng)時(shí)間的選擇底物反應(yīng)時(shí)間的選擇 抗原與抗體、抗體與酶標(biāo)抗體反應(yīng)一般在抗原與抗體、抗

51、體與酶標(biāo)抗體反應(yīng)一般在3737反應(yīng)反應(yīng)2 23h3h達(dá)到高峰。達(dá)到高峰。 時(shí)間太短，敏感性下降，時(shí)間太長，吸附的抗原或復(fù)時(shí)間太短，敏感性下降，時(shí)間太長，吸附的抗原或復(fù)合物（在這個(gè)溫度下）可能脫落。合物（在這個(gè)溫度下）可能脫落。 酶酶- -底物反應(yīng)時(shí)間一般采用底物反應(yīng)時(shí)間一般采用15min15min、30min30min或或45min45min，也，也可以標(biāo)準(zhǔn)陽性血清為準(zhǔn)可以標(biāo)準(zhǔn)陽性血清為準(zhǔn)，隨時(shí)測(cè)定其，隨時(shí)測(cè)定其ODOD值，當(dāng)值，當(dāng)達(dá)到規(guī)達(dá)到規(guī)定的定的ODOD值時(shí)，即終止反應(yīng)值時(shí)，即終止反應(yīng)。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法四、四、ELISAELISA的定量計(jì)算與靈敏度的定量

52、計(jì)算與靈敏度1 1、ELISAELISA的定量計(jì)算的定量計(jì)算 一般采用分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)合物中的酶量和抗體蛋白一般采用分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)合物中的酶量和抗體蛋白（IgGIgG）量，酶量和）量，酶量和IgGIgG計(jì)算方法如下。計(jì)算方法如下。 其中，其中，0.40.4表示酶的表示酶的A A403nm403nm值為值為1 1時(shí)，酶量為時(shí)，酶量為0.4mg/ml0.4mg/ml；0.420.42表示酶的表示酶的A A403nm403nm值為值為1 1時(shí)，其相應(yīng)時(shí)，其相應(yīng)A A280nm280nm值為值為0.420.42；0.620.62表示在表示在A A280nm280nm值為值為1 1時(shí)，時(shí)，IgGIgG

53、量為量為0.62mg/ml0.62mg/ml；0.940.94表示酶、戊二醛結(jié)合后，表示酶、戊二醛結(jié)合后，A A280nm280nm增加約增加約6 6。403/0.4nmmg mLA酶量（）62. 094. 0)42. 0(/IgG403280nmnmAAmLmg）量（第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法 酶結(jié)合物中結(jié)合的酶量、酶結(jié)合率計(jì)算方法酶結(jié)合物中結(jié)合的酶量、酶結(jié)合率計(jì)算方法： 以采用過碘酸鈉氧化法進(jìn)行酶聯(lián)為例，摩爾比值計(jì)算以采用過碘酸鈉氧化法進(jìn)行酶聯(lián)為例，摩爾比值計(jì)算方法方法： 酶量酶量為為1mg/ml1mg/ml，摩爾比值摩爾比值為為1.51.52.02.0，酶結(jié)合率酶

54、結(jié)合率在在30%30%以上以上時(shí)，可獲得較好的時(shí)，可獲得較好的ELISAELISA分析結(jié)果。分析結(jié)果。）結(jié)合物溶液量（）每毫升溶液中的酶量（）結(jié)合物中酶量（mLmLmgmg/%100%）標(biāo)志時(shí)加入的酶量（）結(jié)合物中酶量（酶結(jié)合率mgmgHRPHRP/HRPHRP/160000IgGIgG/IgGIgG/40000mg mLmg mLmg mLmg mL（）分子量（）（摩爾比）（）分子量（）第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法2 2、ELISAELISA的靈敏度與的靈敏度與ELISAELISA放大系統(tǒng)放大系統(tǒng)（1 1）ELISAELISA的靈敏度的靈敏度 ELISAELISA的檢出

55、限已經(jīng)達(dá)到的檢出限已經(jīng)達(dá)到1010-8-81010-12-12g g，但對(duì)某些測(cè)定仍需更高的靈敏度。，但對(duì)某些測(cè)定仍需更高的靈敏度。 傳統(tǒng)傳統(tǒng)ELISAELISA中顯色劑發(fā)色團(tuán)的吸光度是限制中顯色劑發(fā)色團(tuán)的吸光度是限制ELISAELISA靈敏靈敏度的主要因素度的主要因素。 改用熒光標(biāo)記改用熒光標(biāo)記或其他化學(xué)發(fā)光物標(biāo)記抗體替代酶標(biāo)記或其他化學(xué)發(fā)光物標(biāo)記抗體替代酶標(biāo)記抗體可以提高靈敏度?？贵w可以提高靈敏度。 改變改變傳統(tǒng)傳統(tǒng)ELISAELISA的的操作程序操作程序也可以提高靈敏度，如也可以提高靈敏度，如SIMITSIMIT技術(shù)。技術(shù)。 采用放大系統(tǒng)采用放大系統(tǒng)是提高是提高ELISAELISA靈敏度

56、的靈敏度的主要途徑主要途徑。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法（2 2）ELISAELISA放大系統(tǒng)放大系統(tǒng) 生物素生物素- -親和素放大系統(tǒng)親和素放大系統(tǒng)可可增增加抗體（或抗原）的標(biāo)記率。加抗體（或抗原）的標(biāo)記率。 生物素與親和素結(jié)合速率較快且結(jié)合物的穩(wěn)定性高（生物素與親和素結(jié)合速率較快且結(jié)合物的穩(wěn)定性高（K K=10=101515），不會(huì)在孵育和各種洗滌過程中脫落。），不會(huì)在孵育和各種洗滌過程中脫落。 生物素對(duì)抗體和酶的標(biāo)記率高（生物素對(duì)抗體和酶的標(biāo)記率高（1010個(gè)生物素分子個(gè)生物素分子/ /抗抗體分子）體分子），且，且生物素分子易于活化，生物素分子易于活化，標(biāo)記后標(biāo)記后

57、不影響抗不影響抗體和酶的活性。體和酶的活性。 每個(gè)親和素分子能結(jié)合每個(gè)親和素分子能結(jié)合4 4個(gè)生物素個(gè)生物素，因而可因而可偶聯(lián)更多偶聯(lián)更多的聯(lián)結(jié)生物素的酶分子，從而提高的聯(lián)結(jié)生物素的酶分子，從而提高ELISAELISA的敏感性。的敏感性。 生物素生物素- -親和素標(biāo)記體系有靈活多變的運(yùn)用方式，可親和素標(biāo)記體系有靈活多變的運(yùn)用方式，可以適應(yīng)不同的分析設(shè)計(jì)。以適應(yīng)不同的分析設(shè)計(jì)。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法微粒放大微粒放大。用適當(dāng)?shù)奈⒘４婷?。用適當(dāng)?shù)奈⒘４婷? -抗體結(jié)合物也可以抗體結(jié)合物也可以獲得放大效果。獲得放大效果。 每個(gè)微粒表面可以同時(shí)結(jié)合大量記酶和抗體分子。在每

58、個(gè)微粒表面可以同時(shí)結(jié)合大量記酶和抗體分子。在包含微粒放大的夾心包含微粒放大的夾心ELISAELISA法中，法中，微粒通過結(jié)合于其微粒通過結(jié)合于其上的第二抗體結(jié)合于抗原上的第二抗體結(jié)合于抗原。微粒上又結(jié)合著標(biāo)記酶，。微粒上又結(jié)合著標(biāo)記酶，其數(shù)量遠(yuǎn)比第二抗體能結(jié)合的標(biāo)記酶多，因此得以放其數(shù)量遠(yuǎn)比第二抗體能結(jié)合的標(biāo)記酶多，因此得以放大。大。 例如，微顆粒放大系統(tǒng)用例如，微顆粒放大系統(tǒng)用微顆粒硅膠微顆粒硅膠（直徑（直徑約約40nm40nm）作為中間體連接酶和抗體，避免酶和抗體直接連接作為中間體連接酶和抗體，避免酶和抗體直接連接。酶微顆粒硅膠可連接上千個(gè)酶分子，可使體系增敏，酶微顆粒硅膠可連接上千個(gè)酶分

59、子，可使體系增敏，已用于測(cè)定甲胎蛋白，靈敏度放大兩個(gè)數(shù)量級(jí)。已用于測(cè)定甲胎蛋白，靈敏度放大兩個(gè)數(shù)量級(jí)。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法五、五、ELISA法的應(yīng)用法的應(yīng)用 酶免疫測(cè)定具有高度的特異性和敏感性，幾乎所有的酶免疫測(cè)定具有高度的特異性和敏感性，幾乎所有的可溶性抗原可溶性抗原- -抗體系統(tǒng)均可用以檢測(cè)，它的最小可測(cè)抗體系統(tǒng)均可用以檢測(cè)，它的最小可測(cè)值達(dá)值達(dá)ngng甚至甚至pgpg水平。水平。 酶免疫測(cè)定在各應(yīng)用領(lǐng)域中的普及，應(yīng)歸功于商品試酶免疫測(cè)定在各應(yīng)用領(lǐng)域中的普及，應(yīng)歸功于商品試劑盒和自動(dòng)或半自動(dòng)檢測(cè)儀器的問世。劑盒和自動(dòng)或半自動(dòng)檢測(cè)儀器的問世。 目前應(yīng)用較廣的酶免

60、疫檢測(cè)項(xiàng)目一般有試劑盒出售。目前應(yīng)用較廣的酶免疫檢測(cè)項(xiàng)目一般有試劑盒出售。 完整的完整的ELISAELISA試劑盒試劑盒應(yīng)包含應(yīng)包含包被好的固相載體包被好的固相載體、酶結(jié)酶結(jié)合物合物、底物底物和和各種濃縮的稀釋液各種濃縮的稀釋液、緩沖液緩沖液等。等。 這些試劑在冰箱中可保存半年以上，因此實(shí)驗(yàn)室中只這些試劑在冰箱中可保存半年以上，因此實(shí)驗(yàn)室中只需要用蒸餾水稀釋全套試劑即可。需要用蒸餾水稀釋全套試劑即可。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法六、六、微量致敏性雜質(zhì)青霉噻唑蛋白的測(cè)定微量致敏性雜質(zhì)青霉噻唑蛋白的測(cè)定 基因工程藥品在生產(chǎn)過程中為防止污染，在細(xì)胞培養(yǎng)基因工程藥品在生產(chǎn)過程中為