SD大鼠肝癌模型建立及病理分析論文

1、 SD大鼠肝癌模型建立及病理分析學(xué)院名稱(chēng)： 生命科學(xué)學(xué)院 專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)： 生物科學(xué) 年級(jí)班別： 姓 名： 指導(dǎo)教師： SD大鼠肝癌模型建立及病理分析摘要：本實(shí)驗(yàn)采用灌胃的方法構(gòu)建誘發(fā)性腫瘤模型，將二乙基亞硝胺（Diethyl nitrosamine，DENA）配成1%水溶液，根據(jù)每只SD雄性大鼠稱(chēng)重結(jié)果確定灌藥量，70mg/kg，每周1次，灌胃14次之后正常飼養(yǎng)。從灌胃之日起，分別在第2、4、8、11、15、16周分六組處死大鼠，完整取其肝臟稱(chēng)其重量，計(jì)算肝體比；HE染色制作病理切片觀察癌變演進(jìn)中肝組織結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，大鼠肝體比實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，從第8周開(kāi)始二者呈顯著性差異（P0.05），第

2、11-16周二者呈極顯著性差異（P0.01）。病理切片結(jié)果表明成功獲得大鼠肝輕度變性壞死、重度變性壞死、結(jié)節(jié)性增生、肝硬變、肝癌（包括肝細(xì)胞癌及肝膽管癌）五個(gè)時(shí)期的組織材料，病理演變過(guò)程和人類(lèi)肝癌發(fā)生過(guò)程相似?？朔四壳皣?guó)內(nèi)外對(duì)肝癌研究多取材于臨床中晚期標(biāo)本的局限性，為更加全面系統(tǒng)地研究肝癌演進(jìn)的發(fā)生發(fā)展及分子機(jī)理奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：大鼠；肝癌動(dòng)物模型；誘發(fā)性腫瘤模型；二乙基亞胺SD Rat Hepatocarcinogenesis Model and Pathological AnalysisZHU Bao-minAbstract In this study, we use the

3、gavage method to construct induced tumor model, diethylnitrosamine (DENA) paired 1% solution, according to SD male rats each weight to determine irrigation dose, 70mg/kg, 1 week, after 14 times to conduct normal feeding . The rats were devided into six groups and killed on the 2th week, 4th week, 8t

4、h week 11th week, 15th week, 16th week respectively when the rats were piped drinking, and the liver of every rat was taken completely then weight them and calculate the hepatosomatic. Structural changes in liver tissue was observated by HE staining. The results showed that the hepatosomatic of the

5、experimental group compared to the control group, from the 8th week showed a significant difference (P0.05), 11-16th weeks showed significant differences (P0.01). According to the pathologic slices, liver degeneration and necrosis, severe degeneration and necrosis, nodular hyperplasia, cirrhosis, li

6、ver cancer (including hepatocellular carcinoma and liver bile duct) were got successfully, the evolution of pathology was similar process with human liver cancer. Overcome the limitations of the current domestic and international research on liver cancer taken from late clinical specimens, for a mor

7、e comprehensive and systematic study of the incidence of liver cancer development and evolution of the molecular mechanism has laid a solid foundation.Key words Rat; Liver cancer animal model; induced tumor model; DENA前 言肝癌起病隱匿、病程短、死亡率高，是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一1，而動(dòng)物模型是進(jìn)行肝癌實(shí)驗(yàn)研究的重要材料和手段，所以建立肝癌動(dòng)物模型有助于對(duì)肝癌的發(fā)生機(jī)制、診斷與

8、治療進(jìn)行深入的研究。自20世紀(jì)初獲得小鼠自發(fā)性肝癌模型以來(lái)，人們對(duì)肝癌動(dòng)物模型的研究不斷深入，逐步建立了動(dòng)物自發(fā)性肝癌模型、誘發(fā)性肝癌模型、移植性動(dòng)物肝癌模型、人類(lèi)肝癌的異種移植模型以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物肝癌模型2。對(duì)于動(dòng)物腫瘤模型的建立來(lái)說(shuō)，自發(fā)性肝癌模型的優(yōu)點(diǎn)是腫瘤發(fā)生學(xué)和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)與人類(lèi)腫瘤較接近，腫瘤的形成周期長(zhǎng)，便于進(jìn)行慢性治療實(shí)驗(yàn)，但是它的不足表現(xiàn)在自發(fā)性腫瘤模型的發(fā)生情況參差不齊，而且在短時(shí)間內(nèi)無(wú)法獲得大量的腫瘤材料，耗時(shí)，耗資；移植性肝癌模型雖便于重復(fù)實(shí)驗(yàn)，但與人體腫瘤的不同點(diǎn)較多，如腫瘤生長(zhǎng)速度快，增殖比率高，體積倍增時(shí)間短等，特別是與人的實(shí)體瘤差別較大；人體肝癌的異種移植性腫瘤

9、模型，移植后雖有一定比例的成活率，但因腫瘤生長(zhǎng)緩慢又受植入部位包膜的限制，難以傳代，無(wú)法滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)研究（要求病源較多）的需要。其中誘發(fā)性腫瘤模型是以物理的、化學(xué)的或生物的致癌因素處理動(dòng)物，使動(dòng)物產(chǎn)生類(lèi)似于人類(lèi)腫瘤的肝癌。此類(lèi)動(dòng)物模型操作方法簡(jiǎn)單，在短期內(nèi)可大量復(fù)制，并能?chē)?yán)格控制各種條件，使復(fù)制出的肝癌模型適用于不同的研究要求。本實(shí)驗(yàn)即采用誘發(fā)性腫瘤模型的方法構(gòu)建不同時(shí)期的肝癌動(dòng)物模型，其中二乙基亞硝胺（Diethyl nitrosamine，DENA）誘導(dǎo)大鼠肝癌模型被認(rèn)為是較符合人類(lèi)肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程的。二乙基亞硝胺（Diethyl nitrosamine，DENA）為亞硝胺類(lèi)化合物，水溶性。誘

10、發(fā)動(dòng)物肝癌模型時(shí)，多采用灌胃法3-7，將DENA配成一定濃度（以1%最為常用）的水溶液。每周一次，連續(xù)12周以上。自由飲水的方法也較多見(jiàn)8-11。DENA誘發(fā)肝癌的特點(diǎn)是：誘癌成功率高；具有較強(qiáng)的致癌力，較小劑量即能啟動(dòng)致癌；有器官親和性，尤對(duì)肝臟有較強(qiáng)的親和力；肝癌多彌漫型，肝細(xì)胞性肝癌有較高比例,多為分化I級(jí)和II級(jí)，分化III級(jí)很少；整個(gè)誘癌過(guò)程一般分為非特異性藥物反應(yīng)、非癌性增生性反應(yīng)和肝癌發(fā)生三個(gè)階段，是迄今應(yīng)用最廣泛的一種誘發(fā)性肝癌模型12-15。1 實(shí)驗(yàn)部分1.1 主要試劑(1)DENA：購(gòu)自Sigma(2)0.02MPBS：NaH2PO42H2O 0.6gNa2HPO412H2

11、O 5.8 g NaCl 18 g 加雙蒸水至5000ml.(3)Harris蘇木精染液：甲液：0.25克蘇木精溶于2.5ml 95酒精中；乙液：將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水中，加熱使其溶解。甲液與乙液混合煮沸后加入0.25克氧化汞，玻璃棒攪勻，待冷卻后過(guò)濾。用前加入幾滴冰醋酸。(4)伊紅染液：0.5克伊紅溶于100ml 95%酒精中。(5)10%福爾馬林：100ml福爾馬林加入900ml蒸餾水，再加入磷酸二氫鈉4g，磷酸氫二鈉16.23g。1.2主要儀器設(shè)備紫外分光光度儀（UV-1800，北京瑞利）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州蘇凈安泰公司）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-X100，哈爾濱東聯(lián))；

12、移液槍 （德國(guó)Eppenddorf）1.3 大鼠肝癌模型的建立(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠60只，清潔級(jí)，（10520）g，6-8周齡，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。(2)誘癌藥物：二乙基亞硝胺。(3)給藥方式及劑量：將DENA配成1%水溶液灌胃，70mg/kg，每周1次，灌胃14次之后正常飼養(yǎng)。(4)模型建立方法 隨機(jī)分為10籠。隨機(jī)選擇3籠為對(duì)照組，其余7籠為實(shí)驗(yàn)組。按清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度212，相對(duì)濕度555%，光照時(shí)間12h/d（8:00-20:00），喂以普通顆粒飼料，自由飲水。計(jì)算灌藥量：根據(jù)每只大鼠稱(chēng)重結(jié)果確定灌藥量。給藥時(shí)間及次數(shù)：見(jiàn)表1-1。表1-1 大鼠肝癌模型建立方法處死時(shí)

13、間（w）實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組灌DENA次數(shù)數(shù)量（只）灌生理鹽水次數(shù)數(shù)量（只）227234474388783111171131514614316145143取樣與處理：脊椎脫臼法處死大鼠。取材時(shí)，完整取出大鼠肝臟并稱(chēng)其重量，計(jì)算肝體比。1.4 大鼠肝組織病理學(xué)切片制作與觀察1.4.1 蓋玻片與載玻片的處理蓋玻片直接用95%乙醇浸泡24h即可使用。待清潔處理的載玻片逐張放入清潔液中浸泡24h以上，撈出后自來(lái)水和蒸餾水沖洗以徹底除去清潔液，然后放入95%乙醇浸泡24h，烘干即可使用。1.4.2病理切片的制作(1)取材：組織塊的大小既要保證組織的完整性，又要力求小而薄，一般以1.0cm1.0cm0.5 cm為

14、好，迅速?zèng)_洗固定。(2)固定：10%福爾馬林中固定16-20 h。在投入固定液3-4 h后需要將組織取出進(jìn)行修整，用手術(shù)刀片將組織塊不規(guī)則的部分切去后，再次投入固定液中固定至16-20 h。(3)沖洗：將固定好的材料置于干凈的標(biāo)本缸中用自來(lái)水沖洗24 h；(4)脫水：將沖洗好的材料依次置于50%酒精、70%酒精、80%酒精、95%酒精、100%酒精（）、100%酒精（）各2-4 h；(5)透明：將上述脫過(guò)水的材料依次置于1/2二甲苯（二甲苯、酒精各半）、100%二甲苯（）、100%二甲苯（）各2-4 h；(6)浸蠟：將上述透明過(guò)的材料依次置于1/2石蠟（石蠟、二甲苯各半，3-4h）、石蠟（，3

15、0-40min）、石蠟（，30-40min）、石蠟（，30-40min），浸蠟在高于石蠟熔點(diǎn)3左右的融蠟箱中進(jìn)行；(7)包埋：用金屬包埋框盒包埋上述浸蠟材料，材料切面朝下，位置擺正，倒蠟時(shí)避免冷卻不均；(8)修塊：包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的梯形或方形，確保蠟塊的上下邊平行，蠟邊約1-2cm；(9)切片：以少許熱蠟液將修好的蠟塊底部迅速貼附于小木塊上，夾在輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)的蠟塊鉗內(nèi)，使蠟塊切面與切片刀刃平行，切片厚度為7m，切出連續(xù)的蠟帶，用毛筆輕托置于紙上（切片刀的銳利與否、蠟塊硬度適當(dāng)都直接影響切片質(zhì)量，可用熱水或冷水等方法適當(dāng)改變蠟塊硬度）；(10)展片：滴兩滴蒸餾水于載玻片（已涂抹鉻礬明膠

16、）上，再將單個(gè)蠟片置于水滴上，略加溫（此處可在水浴鍋上擱置兩塊玻璃，將載玻片置于玻璃之上實(shí)現(xiàn)加溫過(guò)程）使蠟片展開(kāi)，最后用濾紙吸取多余水分；(11)烤片：貼好片后，將載玻片放入45烘箱中干燥；(12)脫蠟：將烤好的載玻片依次置于100%二甲苯（，15min）、100%二甲苯（,10min）、1/2二甲苯（同上第5步，2min）；(13)水化：將脫蠟后的玻片依次置于100%酒精（）、100%酒精（）、95%酒精、80%酒精、70%酒精、50%酒精和蒸餾水各2min；(14)蘇木精染色：將玻片置于蘇木精染液中1-5min，染色后，細(xì)胞核被蘇木精染成紫藍(lán)色；(15)蒸餾水洗1min；(16)自來(lái)水藍(lán)化

17、5 min；(17)蒸餾水洗1min；(18)伊紅染色及脫水：將玻片置于50%酒精、70%酒精（其中溶有0.5%的伊紅，染色后，多數(shù)細(xì)胞質(zhì)及非細(xì)胞成分被伊紅染成粉紅色）、80%酒精、95%酒精、100%酒精（）、100%酒精（）各2min；(19)透明：將玻片置于1/2二甲苯（同上第5步）、100%二甲苯（）、 100%二甲苯（）各2min；(20)封片：透明后，擦去材料周?chē)嘤嘁后w，滴加適量中性樹(shù)膠，將潔凈蓋玻片呈45度傾斜放下。(21)鏡檢：光學(xué)顯微鏡下檢查制備完畢的玻片，挑選染色效果好、沒(méi)有裂紋的，以備觀察大鼠肝組織結(jié)構(gòu)變化情況。2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1 大鼠體征變化結(jié)果正常大鼠皮毛光滑，活潑

18、好動(dòng)。2、4周實(shí)驗(yàn)組大鼠外觀與對(duì)照組相似，但較對(duì)照組生長(zhǎng)緩慢。8周實(shí)驗(yàn)組大鼠皮毛蓬亂、發(fā)黃、無(wú)光澤，食欲不振，體重開(kāi)始下降。11周實(shí)驗(yàn)組大鼠飲食減少，活動(dòng)較少，有大鼠死亡。15、16周實(shí)驗(yàn)組大鼠虛弱消瘦，行動(dòng)遲緩，病態(tài)明顯，死亡率明顯增加。見(jiàn)圖2-1。2.2 大鼠體重變化結(jié)果由表2-1和圖2-2可見(jiàn)，對(duì)照組大鼠體重在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)呈持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)；而實(shí)驗(yàn)組大鼠從8周起，體重增長(zhǎng)緩慢。經(jīng)SPSS 15.0軟件分析表明：大鼠體重實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，第8周呈顯著性差異（P0.05），第11-16周呈極顯著性差異（P0.01）。表2-1 大鼠肝癌癌變進(jìn)程中對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組體重變化時(shí)間(周)體重(g)對(duì)照

19、組實(shí)驗(yàn)組2131.498.78132.134. 854251.1514.53249.788.538362.143.91338.238.89*11397.1520.55365.7414.05*15439.0012.35385.2118.15*16448.008.16376.4917.35*表示與對(duì)照組相比呈顯著性差異，P0.05；*表示與對(duì)照組相比呈極顯著性差異，P0.01。 圖2-2 大鼠肝癌演進(jìn)中體重變化*2.3 大鼠肝臟組織表觀觀察結(jié)果正常大鼠肝臟表面光滑，顏色紅潤(rùn)，邊緣銳利，質(zhì)地柔軟。2、4周，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟基本與正常相似，但顏色較暗。8周，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟表面尚光滑，顏色微黃，部分大鼠肝

20、葉表面出現(xiàn)米粒狀黃色斑點(diǎn)。11周，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟表面略粗糙，質(zhì)地較硬，邊緣變鈍，出現(xiàn)大小不一的灰白色圓形結(jié)節(jié)。15、16周，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟表面更加粗糙，顏色較黃，同時(shí)出現(xiàn)散在的深褐色斑點(diǎn)，結(jié)節(jié)數(shù)量增多；整個(gè)肝臟皺縮且與周?chē)M織粘連嚴(yán)重，有局部區(qū)域出現(xiàn)空泡。并見(jiàn)多數(shù)肝葉表面出現(xiàn)深紅色充血塊狀物，有白色包膜。見(jiàn)圖2-3。2.4 大鼠肝體比變化結(jié)果如表2-2和圖2-4所示，對(duì)照組大鼠肝體比在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)變化趨勢(shì)平緩；而實(shí)驗(yàn)組大鼠肝體比，自第8周起變化明顯增大，并持續(xù)升高，至16周達(dá)到最大。經(jīng)SPSS15.0軟件分析表明：大鼠肝體比實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，第8周呈顯著性差異（P0.05），第11-16周

21、呈極顯著性差異（P0.01）。表2-2 大鼠肝癌癌變進(jìn)程中肝體比變化時(shí)間(周)肝體比(HIS)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組24.170.0794.220.18144.450.1544.530.17985.110.2255.401.009*115.200.1618.070.381*155.190.1358.400.618*165.250.1029.631.237*表示與對(duì)照組相比呈顯著性差異，P0.05；*表示與對(duì)照組相比呈極顯著性差異，P0.01。圖2-4 大鼠肝癌演進(jìn)中肝體比變化*2.5 病理切片的顯微觀察結(jié)果對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝板排列整齊，肝竇正常，肝細(xì)胞間界限清晰，肝細(xì)胞大小基本一致，胞質(zhì)均勻，

22、核大而圓，核仁清晰。依據(jù)前人對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物肝癌模型組織病理學(xué)分類(lèi)16-19的研究，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中大鼠肝臟的病理變化特點(diǎn)，將其組織變化分為五種類(lèi)型，見(jiàn)圖2-5：(1)輕度變性壞死：肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，可見(jiàn)少數(shù)肝細(xì)胞水變性、壞死，并伴有輕度的脂肪變性，肝竇擴(kuò)張，匯管區(qū)周?chē)休p度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，此種病理變化2周出現(xiàn)。(2)重度變性壞死：肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞水變性嚴(yán)重，并有不同程度的脂肪變性。肝竇擴(kuò)張充血加重。炎細(xì)胞浸潤(rùn)范圍擴(kuò)大，由匯管區(qū)向周?chē)M織浸潤(rùn)，并逐漸出現(xiàn)纖維組織增生。此種病理變化4周出現(xiàn)。(3)結(jié)節(jié)性增生：肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，匯管區(qū)周?chē)橛胁煌潭嚷褕A細(xì)胞及纖維組織增生，向肝小葉內(nèi)延伸，出現(xiàn)大小

23、不等的假小葉結(jié)構(gòu)。假小葉由排列紊亂異常增生的肝細(xì)胞細(xì)胞構(gòu)成，其中包括嗜酸性、嗜堿性及透明細(xì)胞。同時(shí)伴有膽管上皮增生，數(shù)量增多。此種病理變化8周出現(xiàn)。(4)肝硬變：肝小葉結(jié)構(gòu)完全被破壞，出現(xiàn)典型的假小葉結(jié)構(gòu)。結(jié)節(jié)內(nèi)肝細(xì)胞異型增生明顯，病理性核分裂較多。依然伴有不同程度的膽管上皮增生。此種病理變化，11周全部出現(xiàn)。(5)肝癌：主要是肝細(xì)胞癌，同時(shí)伴有膽管細(xì)胞癌。表現(xiàn)為細(xì)胞異型，核圓形或卵圓形，核內(nèi)染色質(zhì)凝集。細(xì)胞排列為索狀、腺狀、實(shí)片狀向周?chē)M織浸潤(rùn)。此種病理變化15周有3例出現(xiàn)，16周全部出現(xiàn)。3 討論肝癌是嚴(yán)重危害人類(lèi)的疾病，其早期診斷及治療對(duì)改善患者存活率具有重要意義。但是由于肝癌早期癥狀常

24、不明顯，一旦形成便會(huì)迅速擴(kuò)散，所以臨床上一旦確診，大多都為中晚期癌，要獲得癌前病變時(shí)期的材料非常困難，給研究帶來(lái)了極大障礙，無(wú)法達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的目的。實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型的引入為肝癌的研究提供了新的途徑。目前已經(jīng)建立并應(yīng)用的肝癌模型種類(lèi)較多，自發(fā)性、誘發(fā)性和移植性肝癌模型三種，其中使用較多的為誘發(fā)性肝癌模型，本實(shí)驗(yàn)用 DENA作為誘癌劑，DENA具有很強(qiáng)的化學(xué)毒性，所含的亞硝胺基因具有誘癌劑和中毒劑的雙重效應(yīng)，它的特性為誘癌率高，對(duì)肝臟的致癌性專(zhuān)一，肝細(xì)胞癌所占比例大，是迄今應(yīng)用最廣泛的一種肝癌模型。本實(shí)驗(yàn)采用二乙基亞硝胺（Diethylnitrosamine，DENA，DEN）作為誘變

25、劑建立了SD大鼠肝癌變各時(shí)期的動(dòng)物模型，成功的獲得了輕度變性壞死、重度變性壞死、結(jié)節(jié)性增生、肝硬變和肝細(xì)胞癌及肝膽管癌五個(gè)不同癌變時(shí)期的組織學(xué)材料。病理形態(tài)觀察顯示，誘癌早期肝臟發(fā)生中毒性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞變性、壞死；誘癌中期，出現(xiàn)肝纖維化和肝細(xì)胞的異常增生等現(xiàn)象，誘癌晚期在結(jié)節(jié)性增生和肝硬變后形成肝癌。病理演變過(guò)程和人類(lèi)肝癌發(fā)生過(guò)程相似。本次造模結(jié)果較為滿(mǎn)意，病理演變過(guò)程和人類(lèi)肝癌發(fā)生過(guò)程基本相似，這為后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和結(jié)果的實(shí)用性提供了良好的前提。4 結(jié) 論本實(shí)驗(yàn)成功建立大鼠肝癌變各時(shí)期的動(dòng)物模型并獲得大鼠肝癌輕度變性壞死、重度變性壞死、結(jié)節(jié)性增生、肝硬變、肝癌（包括肝細(xì)胞癌及肝膽

26、管癌）五個(gè)時(shí)期的組織材料，克服了目前國(guó)內(nèi)外對(duì)肝癌研究多取材于臨床中晚期標(biāo)本的局限性，為更加全面系統(tǒng)地研究肝癌變的發(fā)生發(fā)展及分子機(jī)理奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1袁利超，黨雙鎖，程延安肝癌的靶向治療J 世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2003，2（6）：881-8832陳華，趙德明，肝癌動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理， 2005，9（4）：32-343陳惠黎，吳興中，湯華，等誘發(fā)肝癌過(guò)程中脂類(lèi)和磷脂酶動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)性J生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1999，29（5）：489-4954韋偉，龔建平，裘法祖正常和異常肝組織增生中細(xì)胞增殖與凋亡的關(guān)系J中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2001，18（2）：156-1585盛學(xué)仕，方肇勤

27、，管冬元，等DEN誘發(fā)大鼠肝癌過(guò)程中肝組織基因表達(dá)譜的演變J 中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2005，11（10）：737-7466敖紅，黃愛(ài)民，管生，等大鼠肝臟誘癌模型的建立J上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)，2004，24（40）：243-2447白咸勇，賈秀紅，成令忠，等大鼠肝癌發(fā)生過(guò)程中p53的突變和甲胎蛋白的表達(dá)J中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，1997，6（2）：195-1998蔣澤生，方石崗，張?jiān)粕?，等二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝細(xì)胞癌發(fā)生過(guò)程中的基質(zhì)金屬蛋白酶動(dòng)態(tài)變化J中華肝膽外科雜志，2003，9（1）：32-359馬曾辰，湯釗猷可供臨床研究的常用鼠肝癌模型J國(guó)外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè)，1982，1(1) ：13-16

28、10梁曉俐，鐘光漢，左聲鶴二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌的病理形態(tài)學(xué)研究J第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，13(1) ：32-3711Rodney J. Scott, Subhendu Chakraborty, Stewart Sell , et al. Change in the Ploidy State of Rat Liver Cells during Chemical Hepatocarcinogenesis and Its Relationship to the Increased Expression of a-FetoproteinJ. Cancer Research, 1989, 49(

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30、3(3) ：167-17215姜幼純，董奇男，肖邦良，等非壞死劑量二乙及亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌模型的研究華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，32(4) ：555-55816陳華，趙德明肝癌動(dòng)物模型J實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，2005，22（4）：32-3517高進(jìn)腫瘤學(xué)基礎(chǔ)與研究方法M第一版.北京:人民衛(wèi)生出版社，199918A Javier Lopez. Alternative splicing of pre-mRNA: developmental con-sequences and mechanisms of regulation. Annu Rev Genet, 1998, 32:279-305.19Gr

31、abowski PJ, Black DL. Alternative RNA splicing in he nervous system J.Prog Neurobiol, 2001,65(3):289.致 謝本論文是在導(dǎo)師張紅緒教授的悉心指導(dǎo)下完成的。從選題、試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)施、論文撰寫(xiě)到論文的完成都傾注著張老師大量的心血和汗水。幾個(gè)月來(lái)，導(dǎo)師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、廣博的知識(shí)、敏銳的洞察力、開(kāi)闊型的思維方式、執(zhí)著的追求精神和寬厚隨和的處世方式時(shí)刻影響著我，也必將使我受益終身。感謝王莉師姐，在我論文的完成過(guò)程中給予鼓勵(lì)，指導(dǎo)建議和無(wú)私的幫助，在此對(duì)師姐表示深深的感謝！感謝曹靜師姐，段如冰師姐，李林師姐，趙鵬

32、師兄對(duì)我的幫助！也感謝我的搭檔豐勝磊，劉琪，蘇運(yùn)章等的熱心幫助！感謝培養(yǎng)我的母校河南師范大學(xué)，感謝我求知、成長(zhǎng)的沃土生命科學(xué)學(xué)院！感謝我的父母和家人一直對(duì)我的關(guān)愛(ài)和無(wú)私的照顧！最后，再次衷心感謝所有關(guān)心支持幫助過(guò)我的人！祝你們工作順利、身體健康、生活美滿(mǎn)、萬(wàn)事如意！圖 版 誘癌11周對(duì)照組誘癌8周誘癌4周誘癌2周誘癌16周 圖2-1 大鼠體征變化對(duì)照組誘癌16周誘癌11周誘癌15周誘癌8周誘癌2周誘癌4周 圖2-3 大鼠肝臟組織表觀變化正常肝組織（100） 正常肝組織（400）輕度變性壞死（100） 輕度變性壞死（400）重度變性壞死（100） 重度變性壞死（400） 肝硬變 （100） 肝硬變（400）肝細(xì)胞癌（100） 肝細(xì)胞癌（400）結(jié)節(jié)性增生（100） 結(jié)節(jié)性