第二章沉淀法

1、第二章第二章 沉淀法沉淀法1.什么是沉淀法？什么是沉淀法？2.沉淀法純化蛋白質(zhì)的優(yōu)點有哪些？沉淀法純化蛋白質(zhì)的優(yōu)點有哪些？3.常用的沉淀方法包括哪些？常用的沉淀方法包括哪些？4.何謂鹽析？其原理是什么？何謂鹽析？其原理是什么？5.常用的鹽是什么？影響鹽析的主要因素有哪些？常用的鹽是什么？影響鹽析的主要因素有哪些？6.有機溶劑沉淀法的原理是什么？有機溶劑沉淀法的原理是什么？7.影響有機溶劑沉淀的主要因素有哪些？影響有機溶劑沉淀的主要因素有哪些？8.等電點沉淀的原理是什么？等電點沉淀的原理是什么？通過本章學習應掌握以下內(nèi)容通過本章學習應掌握以下內(nèi)容1、沉淀：、沉淀：利用沉析劑使生化物質(zhì)在溶液中的溶

2、解度利用沉析劑使生化物質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。降低而形成無定形固體沉淀的過程。2、沉淀法的目的：、沉淀法的目的：(通過沉淀達到通過沉淀達到濃縮濃縮的目的；的目的；(沉淀法可有選擇地沉淀雜質(zhì)或有選擇地沉淀所需成沉淀法可有選擇地沉淀雜質(zhì)或有選擇地沉淀所需成分，分，初步純化初步純化 ；(將已純化的產(chǎn)品由將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進一，加以保存或進一步處理。步處理。沉淀法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法，目前沉淀法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法，目前仍廣泛應用在工業(yè)上和實驗室中。仍廣泛應用在工業(yè)上和實驗室中。一、概述(生物分子在水中形成穩(wěn)定的溶

3、液是有條件的，這些條件就生物分子在水中形成穩(wěn)定的溶液是有條件的，這些條件就是溶液的各種理化參數(shù)。任何能夠影響這些條件的因素都是溶液的各種理化參數(shù)。任何能夠影響這些條件的因素都會破壞溶液的穩(wěn)定性。會破壞溶液的穩(wěn)定性。(沉淀法基本原理沉淀法基本原理就是采用適當?shù)拇胧└淖內(nèi)芤旱睦砘瘏?shù)，就是采用適當?shù)拇胧└淖內(nèi)芤旱睦砘瘏?shù)，控制溶液中各種成分的溶解度，控制溶液中各種成分的溶解度，根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而達到分離的目的。溶解度不同而達到分離的目的。(溶劑組分的改變、改變?nèi)芤旱娜軇┙M分的改變、改變?nèi)芤旱膒HpH值、離子強度和極性都會值、離子強度和極性都會使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生

4、明顯的改變。使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改變。3 3、沉淀法的原理、沉淀法的原理n沉淀操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心（除去不沉淀操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心（除去不溶性雜質(zhì)及細胞碎片）以后進行，得到的沉淀溶性雜質(zhì)及細胞碎片）以后進行，得到的沉淀物可直接干燥制得成品或經(jīng)進一步提純，如透物可直接干燥制得成品或經(jīng)進一步提純，如透析、超濾、層析或結(jié)晶制得高純度生化產(chǎn)品。析、超濾、層析或結(jié)晶制得高純度生化產(chǎn)品。n操作方式可分連續(xù)法或間歇法兩種，規(guī)模較小操作方式可分連續(xù)法或間歇法兩種，規(guī)模較小時，常采用間歇法。不管哪一種方式操作步驟時，常采用間歇法。不管哪一種方式操作步驟通常按三步進行：通常按三步進行：4 4、

5、沉淀法的操作、沉淀法的操作 首先加入沉淀劑首先加入沉淀劑; ; 沉淀劑的沉化，促進粒子生長；沉淀劑的沉化，促進粒子生長； 離心或過濾，收集沉淀物。離心或過濾，收集沉淀物。加沉淀劑的方式和控制條件對產(chǎn)物的純度、加沉淀劑的方式和控制條件對產(chǎn)物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響收率和沉淀物的形狀都有很大影響。5 5、沉淀法的步驟、沉淀法的步驟沉淀法不僅可以用于實驗室中；沉淀法不僅可以用于實驗室中；也可廣泛用于生產(chǎn)的制備過程。也可廣泛用于生產(chǎn)的制備過程。因其不需專門設備，且易于放大，是分離純化生因其不需專門設備，且易于放大，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時最常用的方物大分子，特別是制備

6、蛋白質(zhì)和酶時最常用的方法。法。6 6、沉淀法的應用、沉淀法的應用7 7、沉淀法的優(yōu)缺點、沉淀法的優(yōu)缺點根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：（1 1）鹽析法；）鹽析法；（2 2）等電點沉淀法；）等電點沉淀法；（3 3）有機溶劑沉淀法；）有機溶劑沉淀法；（4 4）親和沉淀法；）親和沉淀法；（5 5）選擇性沉淀法。）選擇性沉淀法。（6 6）復合鹽沉淀法；）復合鹽沉淀法；（7 7）非離子型聚合物沉淀法；）非離子型聚合物沉淀法；（8 8）聚電解質(zhì)沉淀法；）聚電解質(zhì)沉淀法；8 8、沉淀法的分類、沉淀法的分類二、蛋白質(zhì)的溶解特性二、蛋白質(zhì)的溶解特性n蛋白質(zhì)是由

7、疏水性各不相同的蛋白質(zhì)是由疏水性各不相同的 20 20 種氨基酸組成的種氨基酸組成的兩性高分子電解質(zhì)，形成兩性高分子電解質(zhì)，形成荷電區(qū)荷電區(qū)。n在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內(nèi)部折疊的趨勢，形成向內(nèi)部折疊的趨勢，形成疏水區(qū)疏水區(qū)。疏水性氨基酸。疏水性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)大，疏水性強。含量高的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)大，疏水性強。n親水性氨基酸殘基分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構的外表親水性氨基酸殘基分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構的外表面，形成面，形成親水區(qū)親水區(qū)。n因此，蛋白質(zhì)由不均勻分布的荷電基團形成因此，蛋白質(zhì)由不均勻分布的荷電基團形成荷電荷電區(qū)區(qū)、親水區(qū)親

8、水區(qū)和和疏水區(qū)疏水區(qū)。蛋白質(zhì)的溶解行為蛋白質(zhì)的溶解行為n蛋白質(zhì)的溶解行為由其組成、構象以及蛋白質(zhì)的溶解行為由其組成、構象以及分子周圍溶液性質(zhì)所決定。分子周圍溶液性質(zhì)所決定。n蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，其蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，其外部大部分是親水的，內(nèi)部大部分是疏外部大部分是親水的，內(nèi)部大部分是疏水的。水的。n一般而言，小分子蛋白質(zhì)比在類似的大一般而言，小分子蛋白質(zhì)比在類似的大分子蛋白質(zhì)更易溶解。分子蛋白質(zhì)更易溶解。防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障u 蛋白質(zhì)周圍的水化層。蛋白質(zhì)周圍的水化層。保護了蛋白質(zhì)粒子，避免了相互碰撞，保護了蛋白質(zhì)粒子，避免了相互碰撞，使蛋使蛋

9、白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。u 蛋白質(zhì)兩性電解質(zhì)，分子間靜電排斥作蛋白質(zhì)兩性電解質(zhì)，分子間靜電排斥作用用（存在雙電層）。（存在雙電層）。蛋白質(zhì)粒子在水溶液中蛋白質(zhì)粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團的電離。蛋白質(zhì)表面的電荷離子或自身基團的電離。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反離子的電荷構成雙電層。與溶液中反離子的電荷構成雙電層。三、鹽析三、鹽析1 1、定義、定義鹽析是可逆的，而變性是不可逆的鹽析是可逆的，而變性是不可逆的早在早在18591859年，中性鹽鹽析法就用于從血液中分離蛋年，中性鹽鹽析法就用于從血液中分離

10、蛋白質(zhì)，隨后又在尿蛋白、血漿蛋白等的分離和分級白質(zhì)，隨后又在尿蛋白、血漿蛋白等的分離和分級中使用，得到了比較滿意的結(jié)果。中使用，得到了比較滿意的結(jié)果。 2 2、鹽析法機理、鹽析法機理（1 1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集， 將大量將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子有很強的水化鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子有很強的水化力，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，力，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質(zhì)分子因熱運動碰撞聚集。使蛋白質(zhì)分子因熱運動碰撞聚集。（2 2）破壞水化膜，暴露出憎水區(qū)域，）破壞水化膜，暴露出憎水區(qū)域，由于憎水由于憎水區(qū)域

11、間作用使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，憎水區(qū)域越多，越區(qū)域間作用使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，憎水區(qū)域越多，越易沉淀。易沉淀。（3 3）中和電荷，減少靜電斥力，）中和電荷，減少靜電斥力， 中性鹽加入蛋中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，靜電斥力白質(zhì)溶液后，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，靜電斥力降低，導致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集降低，導致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。而沉淀。在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價離子的鹽析作半徑小的高價離子的鹽析作用較強，半徑大的低

12、價離子作用較弱。用較強，半徑大的低價離子作用較弱。陰離子鹽析效果陰離子鹽析效果 ：檸檬酸檸檬酸POPO4 43- 3- SOSO4 42-2- CHCH3 3COOCOO- - ClCl- - NONO3 3- -陽離子鹽析效果：陽離子鹽析效果：NHNH4 4+ + K K+ +NaNa+ + 陰離子的影響大于陽離子陰離子的影響大于陽離子鹽析中常用鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉鹽析中常用鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑u（1 1） 價廉價廉 ；u（2 2） 溶解度大，溫度系數(shù)小，許多蛋白質(zhì)可以鹽析出來；溶解度大，溫度系數(shù)小，

13、許多蛋白質(zhì)可以鹽析出來；u（3 3） 硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好；硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好；u（4 4） 不易引起蛋白質(zhì)變性。不易引起蛋白質(zhì)變性。 6、鹽析操作(加鹽方式）硫酸銨的加入有以下幾種方法：硫酸銨的加入有以下幾種方法：1 1）加入固體鹽法）加入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應分批加入，況；工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應分批加入，并充分攪拌，使其完全溶解和防止局部濃度過高；并充分攪拌，使其完全溶解和防止局部濃度過高；2 2）加入飽和溶液法）加入飽和溶液法 用于要求飽

14、和度不高而原來溶液體積不大用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。3 3）透析平衡法）透析平衡法 先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達到設定濃度后，硫酸銨中進行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達到設定濃度后，目的蛋白析出。該法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析目的蛋白析出。該法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結(jié)晶。效果好，但程序煩瑣，故多用于結(jié)晶。u一般說來，離子強度越大，蛋白質(zhì)的

15、溶解度越低。一般說來，離子強度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。u在進行分離的時候，一般從低離子強度到高離子強在進行分離的時候，一般從低離子強度到高離子強度順次進行。度順次進行。u每一組分被鹽析出來后，經(jīng)過過濾或冷凍離心收集，每一組分被鹽析出來后，經(jīng)過過濾或冷凍離心收集，再逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質(zhì)組分再逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來。鹽析出來。 u組成相近的蛋白質(zhì)，分子量越大，沉淀所需鹽的量組成相近的蛋白質(zhì)，分子量越大，沉淀所需鹽的量越少；蛋白質(zhì)分子不對稱性越大，也越易沉淀。越少；蛋白質(zhì)分子不對稱性越大，也越易沉淀。7 7、鹽濃度對鹽析效果的影響、鹽濃度對鹽析效果的影

16、響 S=- S=-s sS S蛋白質(zhì)的溶解度，蛋白質(zhì)的溶解度，g/L; g/L; I I離子強度離子強度I=1/2mI=1/2mi iz zi i2 2 ,m ,mi i離子離子 i i的摩爾濃度；的摩爾濃度；ZiZi所帶電荷所帶電荷常數(shù)，常數(shù)，與溫度、與溫度、pHpH和蛋白質(zhì)種類有關，與鹽的種類無和蛋白質(zhì)種類有關，與鹽的種類無關；關；KsKs鹽析常數(shù)，鹽析常數(shù)，與溫度和與溫度和pHpH無關，但與蛋白質(zhì)和鹽的種類無關，但與蛋白質(zhì)和鹽的種類有關。有關。蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關系蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關系CohnCohn經(jīng)驗式經(jīng)驗式n有時為簡單計，也可以用濃度代替離子強度，有時為簡單計，也可以用濃

17、度代替離子強度，則上式成為則上式成為（用濃度代替離子強度）n式中式中m m為鹽的摩爾濃度為鹽的摩爾濃度. .8 8、用鹽析法分離蛋白質(zhì)的二種方法、用鹽析法分離蛋白質(zhì)的二種方法鹽析法分為兩類，鹽析法分為兩類，第一類叫第一類叫分段鹽析法，分段鹽析法，在一定離子強度下通過改在一定離子強度下通過改變變pHpH和溫度來實現(xiàn)，（固定離子強度，和溫度來實現(xiàn)，（固定離子強度，改變改變pHpH及及溫度溫度），由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度），由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，用于后期進一步分離純化小，因此分辨率更高，用于后期進一步分離純化和結(jié)晶；和結(jié)晶；第二種叫第二種叫KsKs分段鹽析法

18、，分段鹽析法，在一定在一定pHpH和溫度下通過改和溫度下通過改變離子強度實現(xiàn)，變離子強度實現(xiàn)，（固定固定pH, pH, 溫度，溫度，改變鹽濃改變鹽濃度度），），由于蛋白質(zhì)對離子強度的變化非常敏感，由于蛋白質(zhì)對離子強度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，用于早期的粗提液。用于早期的粗提液。l由于不同的蛋白質(zhì)溶解度不同，沉淀時由于不同的蛋白質(zhì)溶解度不同，沉淀時所需的離子強度也不相同。所需的離子強度也不相同。l改變鹽的濃度，可將混合液中的蛋白質(zhì)改變鹽的濃度，可將混合液中的蛋白質(zhì)分批鹽析分開。分批鹽析分開。分段鹽析原理分段鹽析原理n分段鹽析的條件先需要進行分段鹽析的條件先需要進行小實驗

19、探索小實驗探索。 先進行先進行0%-30%0%-30%的硫酸銨沉淀，再進行的硫酸銨沉淀，再進行30%-60%30%-60%的硫酸銨的硫酸銨沉淀，最后進行沉淀，最后進行60%-80%60%-80%的硫酸銨沉淀。的硫酸銨沉淀。 n每一段鹽析靜置之后都要離心獲得沉淀，每一段鹽析靜置之后都要離心獲得沉淀，透析并檢測活透析并檢測活性性。 比如實驗中的活性物質(zhì)主要在比如實驗中的活性物質(zhì)主要在60%-80%60%-80%鹽析出來，在以后鹽析出來，在以后的實驗中，就可以首先進行的實驗中，就可以首先進行0%-60%0%-60%的硫酸銨沉淀，這段的硫酸銨沉淀，這段沉淀物可以拋棄沉淀物可以拋棄（去除大多數(shù)雜質(zhì)）；然

20、后進行（去除大多數(shù)雜質(zhì)）；然后進行60%-60%-80%80%的硫酸銨沉淀，這段沉淀物含有的硫酸銨沉淀，這段沉淀物含有大量目的蛋白質(zhì)大量目的蛋白質(zhì)，將，將其收集進行下一步純化工作。其收集進行下一步純化工作。分分段段鹽鹽析析步步驟驟9 9、鹽析用鹽量的確定、鹽析用鹽量的確定-飽和度飽和度u目標蛋白質(zhì)的鹽析沉淀操作之前，所需的硫酸目標蛋白質(zhì)的鹽析沉淀操作之前，所需的硫酸銨濃度或飽和濃度可通過實驗確定。銨濃度或飽和濃度可通過實驗確定。u對多數(shù)蛋白質(zhì)，當達到對多數(shù)蛋白質(zhì)，當達到85%85%飽和度時，溶解度飽和度時，溶解度都小于都小于 0.l mg0.l mgL L，通常為兼顧收率與純度，通常為兼顧收率

21、與純度，飽和度的操作范圍在飽和度的操作范圍在40%-80%40%-80%之間。之間。調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表10、鹽析的影響因素1）pH值u一般來說，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，一般來說，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點時蛋白質(zhì)溶解凈電荷越少溶解度越小，在等電點時蛋白質(zhì)溶解度最小。度最小。u為提高鹽析效率，多將溶液為提高鹽析效率，多將溶液pHpH值調(diào)到目的蛋白的值調(diào)到目的蛋白的等電點處。等電點處。 u注意在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點與高鹽濃注意在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點與高鹽濃度下所測的結(jié)果是不同的，需根據(jù)實際情況調(diào)整度下所測

22、的結(jié)果是不同的，需根據(jù)實際情況調(diào)整溶液溶液pHpH值，以達到最好的鹽析效果。值，以達到最好的鹽析效果。pH值PH兩種蛋白質(zhì)的相對溶解兩種蛋白質(zhì)的相對溶解度會隨度會隨pHpH而變化很大；而變化很大； 等電點附近有極小值等電點附近有極小值pH在進行鹽折時，必在進行鹽折時，必須控制須控制pHpH圖中直線都相互平圖中直線都相互平行行KsKspH值2 2）溫度的影響）溫度的影響u在低離子強度或純水中，蛋白在低離子強度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加。增加而增加。u但在高鹽濃度下，蛋白質(zhì)、酶但在高鹽濃度下，蛋白質(zhì)、酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度和多肽類物質(zhì)的溶解度

23、隨溫度上升而下降。上升而下降。u在一般情況下，蛋白質(zhì)對鹽析在一般情況下，蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下溫度無特殊要求，可在室溫下進行，只有某些對溫度比較敏進行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在感的酶要求在0-40-4進行。進行。u隨溫度升高減小隨溫度升高減小uKsKs不隨溫度而變不隨溫度而變3 3）蛋白質(zhì)濃度）蛋白質(zhì)濃度 沉淀蛋白質(zhì)鹽的濃度范圍并不是固定的，而是和起始濃度沉淀蛋白質(zhì)鹽的濃度范圍并不是固定的，而是和起始濃度有關。有關。Z高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，若蛋白濃度過高，會高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，若蛋白濃度過高，會發(fā)生嚴重共沉淀作用，除雜蛋白的效果會明顯下降。發(fā)生嚴重

24、共沉淀作用，除雜蛋白的效果會明顯下降。Z在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉淀作在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉淀作用比較少，但回收率會降低。用比較少，但回收率會降低。Z因此需要在兩者之間進行適當選擇。因此需要在兩者之間進行適當選擇。Z分步分離提純時，寧可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液，多加一分步分離提純時，寧可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液，多加一點中性鹽，使共沉淀作用減至最低限度。點中性鹽，使共沉淀作用減至最低限度。Z一般認為一般認為2.5%-3.0%2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中。相當于的蛋白質(zhì)濃度比較適中。相當于25 25 mg/mLmg/mL30mg/mL30mg/m

25、L。u對起始濃度為對起始濃度為 30g/L30g/L的的COMbCOMb溶液，大部分蛋白質(zhì)在硫溶液，大部分蛋白質(zhì)在硫酸銨飽和度為酸銨飽和度為 58-6558-65之間沉淀出來；之間沉淀出來；u但對稀釋但對稀釋1010倍的倍的 COMbCOMb溶液，飽和度達到溶液，飽和度達到66%66%時才開始時才開始沉淀，而相應的沉淀范圍為沉淀，而相應的沉淀范圍為66-73%66-73%飽和度。飽和度。11 11、鹽析注意事項、鹽析注意事項(選擇適宜飽和度選擇適宜飽和度(采用分步鹽析采用分步鹽析(鹽析的成敗決定于溶液的鹽析的成敗決定于溶液的pHpH值與離子強度，穩(wěn)定值與離子強度，穩(wěn)定pH pH 用磷酸用磷酸緩

26、沖液緩沖液(在加入鹽時應該緩慢均勻，攪拌也要緩慢，越到后來速度應在加入鹽時應該緩慢均勻，攪拌也要緩慢，越到后來速度應該更注意緩慢，如果出現(xiàn)一些未溶解的鹽，應該等其完全溶該更注意緩慢，如果出現(xiàn)一些未溶解的鹽，應該等其完全溶解后再加鹽，以免引起局部的鹽濃度過高，導致酶失活。解后再加鹽，以免引起局部的鹽濃度過高，導致酶失活。(鹽析后最好緩慢攪拌一個小時而且再在冰浴中放置一段時間。鹽析后最好緩慢攪拌一個小時而且再在冰浴中放置一段時間。(為了避免鹽對酶的影響，一般脫鹽處理后再測酶活性。為了避免鹽對酶的影響，一般脫鹽處理后再測酶活性。(鹽析后的蛋白質(zhì)最好盡快脫鹽處理，以免變性，透析較慢，鹽析后的蛋白質(zhì)最好

27、盡快脫鹽處理，以免變性，透析較慢，一般可用超濾一般可用超濾鹽析注意事項鹽析注意事項硫酸銨的使用硫酸銨的使用硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對蛋白質(zhì)巰基有硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對蛋白質(zhì)巰基有敏感作用，使用前用敏感作用，使用前用H H2 2S S處理處理高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（pH=5.0pH=5.0左右），使左右），使用前也需要用氨水調(diào)節(jié)至所需用前也需要用氨水調(diào)節(jié)至所需pHpH。硫酸銨容易吸潮，計算飽和度需注意硫酸銨容易吸潮，計算飽和度需注意固體硫酸銨加入后體積變大固體硫酸銨加入后體積變大加入固體鹽后體積的變化加入固體鹽后體積的變化已考慮在表中；已考

28、慮在表中；鹽析后一般放置半小時至一小時，待沉淀完全后才過鹽析后一般放置半小時至一小時，待沉淀完全后才過濾或離心。過濾多用于高濃度硫酸銨溶液，因為此種濾或離心。過濾多用于高濃度硫酸銨溶液，因為此種情況下，硫酸銨密度較大，若用離心法需要較高離心情況下，硫酸銨密度較大，若用離心法需要較高離心速度和長時間的離心操作，耗時耗能。離心多用于較速度和長時間的離心操作，耗時耗能。離心多用于較低濃度硫酸銨溶液。低濃度硫酸銨溶液。1212、鹽析法特點、鹽析法特點1.成本低，不需要特別昂貴的設備。成本低，不需要特別昂貴的設備。2.操作簡單、安全。操作簡單、安全。3.不會引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析去鹽后，能得不會引起蛋白

29、質(zhì)變性，經(jīng)透析去鹽后，能得到保持生物活性的純化蛋白質(zhì)。到保持生物活性的純化蛋白質(zhì)。4.分離效果不理想，通常只是作為初步的分離分離效果不理想，通常只是作為初步的分離純化，還需要結(jié)合其它的純化方法。純化，還需要結(jié)合其它的純化方法。 四、等電點沉淀法等電點沉淀法 isoelectric point precipitation1 1、定義和原理、定義和原理在低的離子強度下，調(diào)在低的離子強度下，調(diào)pHpH至至等電點，使蛋白質(zhì)凈電荷為等電點，使蛋白質(zhì)凈電荷為零，降低了靜電斥力，而疏零，降低了靜電斥力，而疏水力能使分子間相互吸引，水力能使分子間相互吸引，形成沉淀。形成沉淀。不同的兩性電解質(zhì)具有不同不同的兩性

30、電解質(zhì)具有不同的等電點，以此為基礎可進的等電點，以此為基礎可進行分離。行分離。生產(chǎn)胰島素（生產(chǎn)胰島素（pI5.4pI5.4）時，）時，在粗提液中先調(diào)在粗提液中先調(diào)pH8.0pH8.0去除去除堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)pH3.0pH3.0去去除酸性蛋白質(zhì)。除酸性蛋白質(zhì)。pH=pI大豆蛋白的溶解度隨大豆蛋白的溶解度隨pH的變化情況的變化情況2 2、等電點沉淀法注意事項、等電點沉淀法注意事項F本法適用于憎水性較強的蛋白質(zhì)，例如酪蛋白在等電本法適用于憎水性較強的蛋白質(zhì)，例如酪蛋白在等電點時能形成較大的凝聚物。點時能形成較大的凝聚物。F但對一些親水性強的蛋白質(zhì)。則在低離子強度的溶液但對一些親水性強

31、的蛋白質(zhì)。則在低離子強度的溶液中，調(diào)中，調(diào)pHpH在等電點并不產(chǎn)生沉淀。在等電點并不產(chǎn)生沉淀。F在調(diào)節(jié)等電點時，如果采用強酸強堿，要注意防止酶在調(diào)節(jié)等電點時，如果采用強酸強堿，要注意防止酶的失活或蛋白變性。為了使的失活或蛋白變性。為了使pHpH緩慢變動，也可用乙酸緩慢變動，也可用乙酸等弱酸和碳酸鈉等弱堿。等弱酸和碳酸鈉等弱堿。F中性鹽濃度增大時，等電點向偏酸方向移動，同時最中性鹽濃度增大時，等電點向偏酸方向移動，同時最低溶解度會有所增大。低溶解度會有所增大。五、有機溶劑沉淀法五、有機溶劑沉淀法organic solvent precipitationorganic solvent precip

32、itationl概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，量親水的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。使其沉淀析出。l有機溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、有機溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。用，是較早使用的沉淀方法之一。1 1、有機溶劑沉淀法定義、有機溶劑沉淀法定義2 2、有機溶劑沉淀法機理、有機溶劑沉淀法機理*A 降低溶劑介電常數(shù)（介電常數(shù)降低溶劑介電常數(shù)（介電常數(shù)D有機有機 D水）水） 減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白

33、質(zhì)分子間作減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間作用力，增加了蛋白質(zhì)等帶電粒子相互吸引力，聚合沉淀。用力，增加了蛋白質(zhì)等帶電粒子相互吸引力，聚合沉淀。*B 破壞水化膜：破壞水化膜： 由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞水化層，蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞水化層，使蛋白質(zhì)沉淀。使蛋白質(zhì)沉淀。*C 相反力：相反力：疏水基團暴露并與有機溶劑疏水基團疏水基團暴露并與有機溶劑疏水基團結(jié)合形成疏水層結(jié)合形成疏水層3 3、常用的有機溶劑、常用的有機溶劑選擇依據(jù)：選擇依據(jù)：(水溶性

34、要好水溶性要好(介電常數(shù)要小介電常數(shù)要小(致變性作用要小致變性作用要小(毒性要小毒性要小(容易獲取，成本低容易獲取，成本低沉淀蛋白質(zhì)常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀蛋白質(zhì)常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸常用的是乙醇。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸常用的是乙醇。(乙醇：乙醇：沉析作用強，揮發(fā)性適中，無毒，沉析作用強，揮發(fā)性適中，無毒， 是最常用的有機沉淀劑；是最常用的有機沉淀劑；(丙酮丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用范圍不廣。范圍不廣。1 1、溫度、溫度使用有機溶劑沉淀時，操作必須在低溫下進行使用有機溶劑沉淀時，操作必須在低溫下進

35、行u有機溶劑與水混合時，會放出大量的熱量，使溶液的溫度顯有機溶劑與水混合時，會放出大量的熱量，使溶液的溫度顯著升高，增加有機溶劑對蛋白質(zhì)的變性作用，有機溶劑要緩著升高，增加有機溶劑對蛋白質(zhì)的變性作用，有機溶劑要緩緩加入，防止溶液局部升溫。緩加入，防止溶液局部升溫。u溫度還會影響有機溶劑對蛋白質(zhì)的沉淀能力，一般溫度越低，溫度還會影響有機溶劑對蛋白質(zhì)的沉淀能力，一般溫度越低，沉淀越完全。沉淀越完全。 因此，有機溶劑須預先冷卻到因此，有機溶劑須預先冷卻到-10-10-20-20；在使用有機溶劑；在使用有機溶劑沉淀生物高分子時，整個操作過程應在低溫下進行沉淀生物高分子時，整個操作過程應在低溫下進行 。

36、4 4、有機溶劑沉淀法的影響因素、有機溶劑沉淀法的影響因素 2 2、pHpH值：值： pHpH多控制在待沉蛋白質(zhì)的等電點附近。多控制在待沉蛋白質(zhì)的等電點附近。 3 3、樣品濃度：、樣品濃度：樣品較稀將增加有機溶劑投入量和樣品較稀將增加有機溶劑投入量和損耗；樣品太濃會增加共沉作用。蛋白質(zhì)的初濃度損耗；樣品太濃會增加共沉作用。蛋白質(zhì)的初濃度以以0.50.52 2為好，粘多糖則以為好，粘多糖則以1 12 2較合適。較合適。4 4、中性鹽濃度：、中性鹽濃度：較低濃度中性鹽有利于沉淀作用，較低濃度中性鹽有利于沉淀作用，減少蛋白質(zhì)變性減少蛋白質(zhì)變性, ,以以0.010.010.05M0.05M為好，常用為

37、醋酸為好，常用為醋酸鈉鈉/ /銨、氯化鈉等。銨、氯化鈉等。 5 5、某些金屬離子：、某些金屬離子：一些金屬離子如一些金屬離子如CaCa2+2+、ZnZn2+2+等可等可與蛋白質(zhì)形成復合物，溶解度降低而不影響生物活與蛋白質(zhì)形成復合物，溶解度降低而不影響生物活性，有利于沉淀形成。性，有利于沉淀形成。優(yōu)點：優(yōu)點：l分辨能力比鹽析法高，即某一種蛋白質(zhì)只在一個比較窄的分辨能力比鹽析法高，即某一種蛋白質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀；有機溶劑濃度下沉淀；l沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；缺點：缺點：u對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，對具有生物活性的大分子容易引起變性失活

38、，u操作要求在低溫下進行。操作要求在低溫下進行。u成本高成本高總體來說，蛋白質(zhì)和酶的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍?？傮w來說，蛋白質(zhì)和酶的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。5 5、有機溶劑沉淀法的特點、有機溶劑沉淀法的特點 舉例：固體發(fā)酵生產(chǎn)舉例：固體發(fā)酵生產(chǎn)-淀粉酶的提取淀粉酶的提取-淀粉酶（米曲霉）發(fā)酵固體淀粉酶（米曲霉）發(fā)酵固體 + 水水 過濾過濾 水抽提清液水抽提清液 加乙醇（加乙醇（70%）攪拌）攪拌 -淀粉酶淀粉酶 * pH影響影響 收率收率% 酶活酶活 收率收率 酶活酶活 6. pH * 適宜的適宜的pH 5.6 6.0 * 溫度影響溫度影響 收率收率% 酶活酶活 酶活酶活 收率收率

39、10 20 T * 適宜的溫度適宜的溫度10 20 六、六、 親和沉淀親和沉淀u親和沉淀是沉淀分離的一種，親和沉淀是沉淀分離的一種，將親和反應的高將親和反應的高度選擇性、低處理量特性與沉淀操作的大處理度選擇性、低處理量特性與沉淀操作的大處理量有機結(jié)合量有機結(jié)合形成了親和沉淀技術。形成了親和沉淀技術。u定義：定義：利用蛋白質(zhì)與特定的配基（免疫配體、利用蛋白質(zhì)與特定的配基（免疫配體、基質(zhì)、輔酶等）之間高度專一的相互作用而設基質(zhì)、輔酶等）之間高度專一的相互作用而設計出來的一種特殊選擇性的分離技術。計出來的一種特殊選擇性的分離技術。u其沉淀原理其沉淀原理與通常的沉淀方法有很大的不同：與通常的沉淀方法有

40、很大的不同：不是依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度差異，而是依據(jù)不是依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度差異，而是依據(jù)“吸附吸附” 蛋白質(zhì)的特殊聚合物溶解度的大小。蛋白質(zhì)的特殊聚合物溶解度的大小。1 1、定義和原理、定義和原理2 2、親、親 和和 沉沉 淀過程淀過程 配基與載體的選擇配基與載體的選擇將配基與可逆溶解載體偶聯(lián)后形成載體將配基與可逆溶解載體偶聯(lián)后形成載體- -配基復合物，配基復合物，將目標蛋白質(zhì)與鍵合在可溶性載體上的親合配基絡合將目標蛋白質(zhì)與鍵合在可溶性載體上的親合配基絡合形成復合體；形成復合體；改變?nèi)芤簵l件，使復合體沉淀析出；改變?nèi)芤簵l件，使復合體沉淀析出；所得沉淀物用一種適當?shù)木彌_溶液進行洗滌，洗去可所得沉淀物用一

41、種適當?shù)木彌_溶液進行洗滌，洗去可能存在的雜質(zhì)；能存在的雜質(zhì)；用一種適當?shù)脑噭⒛繕说鞍踪|(zhì)從配位體中離解出來。用一種適當?shù)脑噭⒛繕说鞍踪|(zhì)從配位體中離解出來。舉例：胰蛋白酶的親和沉淀舉例：胰蛋白酶的親和沉淀A.A.配基（大豆胰蛋白酶抑制劑）固定于載體配基（大豆胰蛋白酶抑制劑）固定于載體（聚合脂質(zhì)體（聚合脂質(zhì)體- -醇磷脂乙醇胺）醇磷脂乙醇胺）B.B.胰蛋白酶粗溶液加入一定量聚合物溶液進行胰蛋白酶粗溶液加入一定量聚合物溶液進行吸附；吸附；C.C.加入加入0.2MNaCl0.2MNaCl使復合體沉淀使復合體沉淀D.D.0.01 M NaOH0.01 M NaOH洗脫沉淀，釋放胰蛋白酶洗脫沉淀，釋放胰

42、蛋白酶七、選擇性變性沉淀法七、選擇性變性沉淀法n概念：概念：選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀下來，而與目的物分開。蛋白等雜質(zhì)變性沉淀下來，而與目的物分開。n原理：原理：利用蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子對利用蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子對某些物理或化學因素敏感性不同，有選擇地使某些物理或化學因素敏感性不同，有選擇地使之變性沉淀，以達到分離提純的目的。之變性沉淀，以達到分離提純的目的。n方法：方法：）利用對熱的不穩(wěn)定性）利用對熱的不穩(wěn)定性, ,加熱破壞某加熱破壞某些組分，而保存另一些組分；）酸堿變性。些組分，而保存另一些組分；）酸堿變性。 ）利

43、用表面活性劑）利用表面活性劑( (三氯乙酸三氯乙酸) )或有機溶劑引或有機溶劑引起變性；起變性；1 1、定義、原理和方法、定義、原理和方法選擇性變性沉淀法是使選擇性變性沉淀法是使雜質(zhì)雜質(zhì)變性沉淀，又對目的變性沉淀，又對目的物沒有明顯影響，所以在操作之前要對欲分離的物沒有明顯影響，所以在操作之前要對欲分離的物質(zhì)中的雜蛋白等雜質(zhì)的種類、含量及其物理化物質(zhì)中的雜蛋白等雜質(zhì)的種類、含量及其物理化學性質(zhì)等有比較全面的了解。學性質(zhì)等有比較全面的了解。例如對于例如對于-淀粉酶等熱穩(wěn)定性好的酶，可淀粉酶等熱穩(wěn)定性好的酶，可以通過加熱進行熱處理，使大多數(shù)雜蛋白以通過加熱進行熱處理，使大多數(shù)雜蛋白受熱變性沉淀而被除去。受熱變性沉淀而被除去。2 2、選擇性變性沉淀法、選擇性變性沉淀法u在核酸提取液中加入氯仿在核酸提取液中加入氯仿- -戊醇，振蕩一段時間、使蛋白戊醇，振蕩一段時間、使蛋白質(zhì)在氯仿質(zhì)在氯仿- -水的