全人源炭疽保護性抗原中和抗體的研究

1、全人源炭疽保護性抗原中和抗體的研究炭疽芽胞桿菌 (Bacillus anthracis) 致死率極高 , 是人畜共患烈性傳染病 - 炭疽病(Anthrax)的病原體。并且炭疽芽胞桿菌來源廣泛、易于培養(yǎng),被作為一種 A類生物戰(zhàn)劑進行管理，其防生和反恐一直以來都具有重要的軍事意義和社會意 義。炭疽的防控手段包括預(yù)防和治療 , 二者分別主要依賴于炭疽疫苗和抗菌素 , 但是這兩種藥物均需在感染前或感染初期立即使用。 而炭疽毒素中和抗體在宿主 感染后 , 能快速有效中和體內(nèi)產(chǎn)生的炭疽毒素 , 同時發(fā)揮補體依賴細胞毒性作用 和抗體依賴細胞毒性作用 , 是目前最有前景的炭疽治療藥物。自從1975年雜交瘤技術(shù)

2、出現(xiàn)后 ,多年來單抗治療主要依賴于鼠源單抗。 但是 鼠源單抗半衰期短、毒副作用明顯 , 大大制約了其臨床應(yīng)用。全人源單克隆抗體應(yīng)用于人體時具有無免疫原性、半衰期長 , 國外大多數(shù)新 開發(fā)工程現(xiàn)已轉(zhuǎn)向全人源單抗的研發(fā)。 目前全人源單抗制備的方法主要是通過人 人雜交瘤技術(shù)、轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)、抗體庫技術(shù)和單細胞PCF技術(shù),其中通過單細胞PCF技術(shù)可直接從人單個B細胞中擴增抗體基因，無需細胞融合培養(yǎng)和抗體多輪 篩選的過程,能夠在最短 7天內(nèi)篩選獲得有效的全人源單抗 ,而其他幾種抗體制 備方法均需要數(shù)周甚至數(shù)月 , 建立這種快速高通量抗體篩選平臺 , 將有助于提升 我國新發(fā)突發(fā)傳染病的應(yīng)對能力；并且，單細胞

3、PCF技術(shù)完整保存了抗體重鏈輕 鏈在人體內(nèi)的天然配對方式 , 因此可在獲得治療抗體的同時更加直觀、深入地研 究人體免疫機制。但是,由于單個細胞內(nèi)基因拷貝數(shù)非常低,單細胞PCF技術(shù)的實現(xiàn)難度大,目 前國內(nèi)罕見成功通過該技術(shù)獲得單抗的研究團隊。 目前大局部炭疽單抗仍然是鼠 源單抗,少數(shù)研究者從大猩猩、 轉(zhuǎn)基因鼠和人體中篩選獲得了炭疽單抗 ,而我國仍 未見全人源的抗炭疽毒素單抗報道。鑒于炭疽毒素作用機制的復(fù)雜性 , 研發(fā)更多的針對不同中和表位的炭疽全人 源單抗,能夠有效防止炭疽毒素被人為突變帶來的生物恐怖威脅 , 為炭疽的治療 提供更多項選擇擇。鑒于此,本文目的在于建立流式分選-單細胞PCR快速高通

4、量的抗 體篩選技術(shù)平臺 , 并通過該技術(shù)平臺從重組炭疽保護性抗原 (protective antigen,PA)疫苗免疫的志愿者體內(nèi)，篩選獲得全人源PA中和抗體,并對單抗的 親和力、抗原結(jié)合表位、毒素中和機制、單抗聯(lián)合用藥效果等進行深入研究。首先對一名男性志愿者在第0天和28天兩次免疫了重組PA疫苗,并在第0、 28、35 天采集志愿者血液樣品。為確保能夠在適宜的時間點采集志愿者陽性的 血液樣品,從而提高后續(xù)PA抗體篩選的陽性率，本文通過ELISA和TNA的方法， 對不同時間點血清中PA結(jié)合和中和抗體滴度進行測量。結(jié)果說明,免疫第35天血清中PA結(jié)合抗體和中和抗體滴度均明顯升高。同 時, 通過

5、 ELISpot 的方法, 對不同時間點血液中抗體分泌細胞的數(shù)量變化進行檢 測。結(jié)果顯示抗PA抗體陽性的抗體分泌細胞占總Ig G陽性的抗體分泌細胞的比 例,從免疫后第28天的0.8%上升至免疫后第35天的23.8%,可見抗PA抗體陽性 的抗體分泌細胞個數(shù)大幅升高。說明重組PA疫苗在志愿者體內(nèi)有效激發(fā)了體液免疫反響 , 在免疫后第 35 天時體液免疫水平顯著升高 , 為后續(xù)抗體的分選提供保 證。為了實現(xiàn)單個B細胞的分選和抗體基因的單細胞 PCFT增，我們嘗試了多種細胞分選和單細胞PCM方法,在經(jīng)歷屢次失敗后，最終采用流式細胞分選抗體 分泌細胞,以及多重引物組合的單細胞反轉(zhuǎn)錄-巢式兩步PCR勺方法

6、,成功從人單 個B細胞中擴增獲得抗體基因。在單細胞 PCR條件優(yōu)化的過程中,我們發(fā)現(xiàn)引物 設(shè)計、酶的種類和模板量對于擴增效率的影響較大 , 而退火溫度對于擴增效果影 響甚微。在成功實現(xiàn)研究中抗體分選的關(guān)鍵性技術(shù) -流式分選單個抗體分泌細胞和單 細胞PCR技術(shù)后,采集了志愿者免疫后第35天的血液樣品,通過密度梯度沉降法 從血液樣品中別離外周血單個核細胞 (peripheral blood mononuclear cell,PBMC), 在對一組抗體分泌細胞外表特異的白細胞分化抗原簇 (cluster of differentiation,CD)分子進行熒光染色后,通過流式細胞分選儀從PBMC中分

7、選獲得2112個單個抗體分泌細胞克隆,通過單細胞PCRT增單個細胞中的抗體基因。 結(jié)果顯示，529個單細胞克隆重鏈和輕鏈同時擴增成功的比率,即單細胞PCM陽性率約為 25%。在硬件條件滿足的情況下 ，僅需 12天即可完成以上單細胞的分選和抗體基 因擴增的過程。 如果采用傳統(tǒng)的克隆方法 ，構(gòu)建529對抗體基因的表達質(zhì)粒 ，非常 耗時費力。為了快速、高通量表達抗體基因，我們設(shè)計了可直接通過PCF融合啟動子、 前導(dǎo)序列、抗體全長基因、多聚 A尾(poly(A)tail)的線性表達框。我們對線性表達框PCF條件進行優(yōu)化，并使用一株對照抗體驗證線性表達框所表達抗體的表 達量和功能。結(jié)果顯示,經(jīng)線性表達框

8、方法表達的抗體濃度可達 0.4卩g/m L,且良好保持 了抗體中和效果 ，能夠滿足后續(xù)抗體篩選實驗的要求 ，通過我們設(shè)計的線性表達框可在最短 3天內(nèi)表達供后續(xù)篩選用的抗體。在確保方法的可行性后 ，我們按照 優(yōu)化的重疊延伸PCR條件,構(gòu)建了 529對抗體重鏈和輕鏈線性表達框,并將配對的基因共轉(zhuǎn)染至HEK 293T細胞中進行表達。繼而,通過ELISA和TNA勺方法對529株全人源單抗進行PA吉合和中和活性 的檢測,并鑒定了單抗的特異結(jié)合的PA結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示，我們成功通過建立的 抗體篩選平臺技術(shù)獲得34株P(guān)A結(jié)合單抗，其中4株單抗(2A6、4A3 8H6 22F1) 具有PA中和活性。中和單抗22

9、F1與PA不結(jié)合,而是通過與PA的變構(gòu)體PA63結(jié)合發(fā)揮作用。 另外,研究發(fā)現(xiàn)PA結(jié)合單抗中有一種能夠加速細胞死亡的毒素增強抗體 (Toxin enhancing m Ab),占PA結(jié)合單抗的比例達 55.9%之多。為了進一步探究PA中和抗體和毒素增強抗體的特性，構(gòu)建4株P(guān)A中和抗體 和1株毒素增強抗體8A7的表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染并純化抗體蛋白；并從以下幾個方面對 抗體的功能進行研究:1)通過BLI技術(shù)測定了 5株重點研究的單抗的親和力，結(jié)果 顯示除22F1外單抗親和力均在納摩爾級；2)測定4株中和單抗在體內(nèi)和體外的中 和活性, 結(jié)果顯示 4株中和單抗中 22F1 單抗中和活性最強 , 其體外保護效

10、果較上 市PA單抗報道結(jié)果高出近一個數(shù)量級，而單抗2A6僅在體外具有保護活性；3)鑒 定中和單抗的中和機制，結(jié)果說明8H6單抗對PA呈現(xiàn)抗體濃度依賴的酶切抑制作 用,4A3單抗通過促進PA63的降解而抑制PA七聚體形成，4A3這種類似酶活作用 的毒素中和機制尚未見報道，提示本研究可能發(fā)現(xiàn)了一株新中和機制的 PA中和 單抗。毒素增強單抗8A7能促進PA七聚體的形成，并與PA七聚體結(jié)合，提示其毒 素增強作用的可能機制；4)分析單抗的聯(lián)合用藥效果，結(jié)果說明2A6和4A3 8H6 和22F1表現(xiàn)出較弱的協(xié)同作用;2A6和8H6 2A6和22F1表現(xiàn)出無關(guān)作用；4A3 和8H6 4A3和22F1表現(xiàn)出拮抗作用。而單抗聯(lián)合用藥協(xié)同效果最為顯著的，是毒素增強單抗8A7與僅在體外具有 中和活性的單抗2A6,二者聯(lián)合用藥能夠在體內(nèi)發(fā)揮高水平的毒素中和效果。結(jié) 果提示我們,在人體內(nèi)之所以大量產(chǎn)生毒素增強抗體的可能原因是 ,這種抗體在 血液中能夠輔助其他抗體發(fā)揮良好的機體保護效果。并且,8A7單抗針對的PA結(jié)構(gòu)域3是目前普遍認為的PA非中和位點，根據(jù)本 文所得結(jié)果推測針對PA結(jié)構(gòu)域3表位的單抗,在人體內(nèi)能夠通過與其他抗體協(xié)同 發(fā)揮重要的生物學(xué)功能 , 這種輔助性單抗在抗體篩選過程中容易被遺漏 , 但是其 在“雞尾酒治療中發(fā)揮的重要作用不容無視。綜上所述 , 本文建立了基于流式