PCR擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒PPT課件

1、 乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我國(guó)發(fā)病率很高 ，HBV的檢測(cè)極其重要。 HBV DNA存在就可以引起乙肝的傳染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒復(fù)制的發(fā)動(dòng)機(jī) 。 第1頁/共19頁 PCR技術(shù)可以檢測(cè)出極微量的病毒，是判斷其傳染性最直接、最可靠的證據(jù)。PCR技術(shù)已成為公認(rèn)的對(duì)病毒性肝炎的診斷、療效觀察及預(yù)防研究工作最理想的方法之一。第2頁/共19頁一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握PCR技術(shù)擴(kuò)增的原理2.熟悉PCR擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒的基本操作過程。第3頁/共19頁二、實(shí)驗(yàn)原理 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction) 簡(jiǎn)稱PCR,是在體外條件下利用DNA聚合酶、催化一

2、對(duì)引物間的特異性DNA片段合成的基因體外擴(kuò)增技術(shù)，它包括三個(gè)基本過程：第4頁/共19頁1.變性：加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂?.退火：急速降溫使引物和互補(bǔ)模板 在局部形成雜交鏈 3.延伸：耐熱DNA聚合酶按5 3 方向催化以引物為起始點(diǎn)的 延伸反應(yīng)第5頁/共19頁模板DNA高溫變性低溫退火引物適溫延伸經(jīng)過25-35次循環(huán)后，目的片段擴(kuò)增2n倍兩條子代DNA一次循環(huán)Tap酶5335355353第6頁/共19頁三、主要器材及試劑1.主要器材：9700型PCR儀電泳槽、電泳儀第7頁/共19頁 紫外分析儀臺(tái)式高速離心機(jī)第8頁/共19頁2.主要試劑：HBV-PCR定性檢測(cè)試劑盒PCR反應(yīng)管HBV陽性標(biāo)本DN

3、A提取液第9頁/共19頁四、操作步驟1.標(biāo)本處理：取患者血清40l，加入DNA提取液40l，沸水浴10分鐘，10000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液4l做PCR反應(yīng)。第10頁/共19頁2.加樣：加入提取好的標(biāo)本4l，6000轉(zhuǎn)離心10秒。 取試劑盒中PCR反應(yīng)管 TapDNA聚合酶10擴(kuò)增緩沖液 4種dNTP混合物引 物(小分子DNA片段） Mg2+第11頁/共19頁 三個(gè)擴(kuò)增步驟溫度及時(shí)間 溫度溫度 時(shí)間時(shí)間變性變性 93 45（首次（首次5）退火退火 55 45延伸延伸 72 60（末次（末次5）循環(huán)次數(shù)：25次 儀上擴(kuò)增：第12頁/共19頁P(yáng)CR儀上擴(kuò)增加入標(biāo)本離心6000轉(zhuǎn)離心10秒第13頁/

4、共19頁4.電泳檢測(cè)：制備2%瓊脂糖凝膠 2%瓊脂糖的制備：電泳槽的準(zhǔn)備：稱取瓊脂糖40mlTBE電泳緩沖液（PH8.0)煮沸溶解加入冷卻60左右加入溴乙啶EB20l倒膠第14頁/共19頁加樣：取擴(kuò)增后的產(chǎn)物10 ul點(diǎn)樣于凝膠孔取樣點(diǎn)樣第15頁/共19頁電泳：點(diǎn)樣端接“-”，穩(wěn)壓，50V，電泳30分鐘。五、結(jié)果觀察：紫外分析儀下觀察，出現(xiàn)橙黃色條帶則為HBV陽性HBV陽性HBV陰性HBV陽性對(duì)照HBV陰性對(duì)照正極負(fù)極點(diǎn)樣孔第16頁/共19頁五、注意事項(xiàng)1. 試劑盒內(nèi)陽性標(biāo)本及DNA提取液使用前需充分融化離心。2. 反應(yīng)液的表面為固體封蓋劑，電泳取樣時(shí)從反應(yīng)管底部吸液。3. EB為強(qiáng)致癌物，操作過程應(yīng)注意防護(hù)。