實驗3PEG介導的動物細胞融合技術

1、中 國 海 洋 大 學 實 驗 報 告 姓名：常天易 系年級：海洋生命學院2012級 專業(yè)：生物科學 科目：分子細胞生物學實驗 學號：12050011006peg 介導的動物細胞融合技術一、實驗目的（）、通過實驗，對體細胞融合有一個清醒的認識（）、通過介導雞血細胞融合，初步掌握利用介導動物細胞融合的實驗技術。二、實驗原理真核細胞通過介導和培養(yǎng)，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核的細胞的過程稱為細胞融合，通過此技術可以實現(xiàn)不同種類的細胞的融合?；蛐拖嗤募毎诤戏Q為同核體（），基因型不同的細胞融合稱為異核體（）目前，誘導細胞融合的技術主要有三種：病毒，聚乙二醇（），電激。第一種方法是通過生物病

2、毒的方式，誘導細胞與細胞之間的融合。后兩種方法通過化學物理的手段使得細胞膜的膜脂類分子的排列發(fā)生變化，去掉作用因素后，質(zhì)膜分子的排列恢復原有的形態(tài)，在恢復的過程中，可以誘導相接觸的細胞發(fā)生融合。介導的細胞融合，其融合效果受到以下幾個因素的影響、的分子量與濃度的分子量及其濃度越大，細胞融合效果越明顯，但對細胞的毒性也越大。本實驗使用的分子量為，濃度為、的值經(jīng)驗證，的濃度在.時，融合效果最好、處理時間處理實驗越長，融合效果越好，但對細胞的毒性也越大。故一般將處理時間限制在分鐘以內(nèi)。本實驗不涉及后續(xù)的細胞培養(yǎng)，所以處理時間可適當放寬至數(shù)分鐘、融合時的溫度溫度越高，細胞膜脂質(zhì)的流動性越好，故在細胞可以

3、承受的范圍內(nèi)，適當?shù)奶岣邷囟扔欣诩毎娜诤先?、實驗材料新鮮雞血. 生理鹽水液液四、實驗步驟取出雞血懸液1ml，加入0.85%生理鹽水，4ml，混勻。1200r/min離心5分鐘，移除上清液加入4ml 0.85%生理鹽水，重懸細胞，1200r/min，離心5min，移除上清加入4ml 0.85%生理鹽水，重懸細胞，1200r/min，離心10min，移除上清向離心沉淀中加入2mlgkn，使之成為10%的細胞懸液取血球懸液1ml，加入0.5ml 50%的peg液，混勻，開始計時從計時開始，到蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察為止。將處理1、2、3、4分鐘的細胞樣品，顯微鏡下觀察計數(shù)視野內(nèi)融合細胞的核數(shù)和視

4、野內(nèi)細胞的總核數(shù)，從而計算融合率計數(shù)視野內(nèi)融合細胞的核數(shù)和視野內(nèi)細胞的總核數(shù)，從而計算融合率五、實驗結果本實驗分為四個實驗組，經(jīng)peg處理的時間分別為：1,2,3,4分鐘，各個實驗組中視野內(nèi)融合的細胞的核數(shù)，視野內(nèi)細胞核的總數(shù)，融合率如下：處理時間 項目視野內(nèi)融合的細胞的核數(shù)視野內(nèi)細胞核的總數(shù)融合率（%）1min9313767.92min13418672.03min19825677.34min25832080.6處理2min效果六、思考題：、細胞融合方法主要有哪幾種，各有何優(yōu)缺點？答：目前主要由三種方法，、病毒法、電激法。、介導的細胞融合優(yōu)點：細胞融合率較高，廉價，操作簡便缺點：對細胞有一定的

5、毒性，不適用于對卵細胞的細胞融合，可重復性差。、病毒法,使用副念病毒科的病毒誘導細胞融合優(yōu)點：病毒體外易于培養(yǎng)缺點：使用病毒誘導的細胞融合效果不穩(wěn)定、電激法： 優(yōu)點：可重復性強，對細胞無毒害 缺點：成本高、法誘導細胞融合的因素有哪些？答：、的分子量與濃度的分子量及其濃度越大，細胞融合效果越明顯，但對細胞的毒性也越大。本實驗使用的分子量為，濃度為、處理時間處理實驗越長，融合效果越好，但對細胞的毒性也越大。故一般將處理時間限制在分鐘以內(nèi)。本實驗不涉及后續(xù)的細胞培養(yǎng)，所以處理時間可適當放寬至數(shù)分鐘、的值經(jīng)驗證，的濃度在.時，融合效果最好、融合時的溫度溫度越高，細胞膜脂質(zhì)的流動性越好，故在細胞可以承受

6、的范圍內(nèi)，適當?shù)奶岣邷囟扔欣诩毎娜诤?、 本實驗中所用的peg融合方法是否適用于植物細胞，為什么？答：不適用。因為植物細胞存在細胞壁，使用融合方法使得細胞的細胞膜的脂類分子層結構發(fā)生暫時的改變，從而介導細胞的融合。由于細胞壁的存在，組織了植物細胞的融合，融合方法所以不適用于植物細胞的融合。、 本實驗的本實驗的材料為什么不用兔子或小鼠的血細胞？如果因實驗需要必須選用小鼠血細胞作為實驗材料，應如何對融合細胞進行鑒別？答：因為兔子或小鼠等哺乳動物成熟的紅細胞沒有細胞核，在普通光學顯微鏡下，不利于計數(shù)，所以不適用它們的血細胞進行細胞融合的實驗。、可以對細胞表面保守的蛋白進行或免疫熒光染色等處理，分

7、析信號的強度，進行分析。、可以通過化學基團標記細胞，進行分析。、可以測定細胞的呼吸強度等生理特性，代謝強的，為融合的細胞。、融合實驗前對細胞進行熒光標記，后可以通過流式細胞術將融合程度不同的細胞分離開來。七、總結與討論1、peg液要現(xiàn)配現(xiàn)用，因為對人體有害，所以在配置和使用時應當特別注意。2、實驗中所用的液的作用是、為細胞提供營養(yǎng)、防止血液的凝固3、實驗所用的溶液是一種緩沖液而且也可以為細胞提供營養(yǎng)4、因為在的存在下就可以使細胞膜的結構發(fā)生變化，peg處理的時間應該掌握到蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察為止。因為加上蓋玻片可以相對限制細胞相對位置，使得細胞融合速度減慢。但是不能保證細胞絕對不融合，所以觀察到的樣品經(jīng)處理的時間一般都比預計的時間長。5、本實驗開始計數(shù)時，計數(shù)規(guī)則出錯，計算融合率應用視野內(nèi)融合細胞的核數(shù)視野內(nèi)細胞的總核數(shù)；而不是視野內(nèi)融合的細胞數(shù)視野內(nèi)的細胞總數(shù)，原因是：a、前一種方法被除數(shù)是融合的細胞的核數(shù)可以代表融合的細胞的個數(shù)，后一種方法被除數(shù)是視野內(nèi)融合的細胞數(shù)不能代表融合的細胞的個數(shù)。b、前一種方法除數(shù)是視野內(nèi)細胞的總核數(shù)可以代表實