WESTERN BLOT 實(shí)驗(yàn)介紹及流程

1、儀儀 器器 培培 訓(xùn)訓(xùn)Western blot Western blot 實(shí)驗(yàn)介紹實(shí)驗(yàn)介紹及流程及流程Bio-radBio-rad垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置 目的與要求目的與要求 掌握垂直電泳、電轉(zhuǎn)的基本原理與操作步驟 培訓(xùn)內(nèi)容培訓(xùn)內(nèi)容 熟悉western-blot 與SDS-PAGE的基本原理與實(shí)驗(yàn)流程 考核題目考核題目 電泳槽 玻璃板、梳子、加樣校準(zhǔn)架等 電轉(zhuǎn)移槽 切膠板、黑白夾板、海綿墊等 電泳儀 Bio-radBio-rad垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置用途：用途：用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中對(duì)特定目的蛋白質(zhì)的分離，定用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中對(duì)特定目的蛋白質(zhì)的分離，定性及定量的檢測(cè)分析，是

2、性及定量的檢測(cè)分析，是Western-blotWestern-blot（蛋白免疫印跡（蛋白免疫印跡）實(shí)驗(yàn)中非常重要的部分。）實(shí)驗(yàn)中非常重要的部分。 Western blot是利用已知的特異性抗體與抗原（即組織是利用已知的特異性抗體與抗原（即組織細(xì)胞中的目的蛋白）能特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反細(xì)胞中的目的蛋白）能特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記于結(jié)合后的特異性抗體上的顯示劑（如酶、金應(yīng)使標(biāo)記于結(jié)合后的特異性抗體上的顯示劑（如酶、金屬離子、同位素）顯示一定的顏色或發(fā)光來(lái)對(duì)組織細(xì)胞屬離子、同位素）顯示一定的顏色或發(fā)光來(lái)對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)目的蛋白定性及半定量的研究。內(nèi)目的蛋白定性及半定量的研究。West

3、ern blot 實(shí)驗(yàn)原理抗原抗原一抗一抗生物素標(biāo)記生物素標(biāo)記的二抗的二抗ECL發(fā)光試劑發(fā)光試劑Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)流程提取總蛋白蛋白濃度測(cè)定SDSSDS-聚丙烯聚丙烯酰胺凝膠電泳酰胺凝膠電泳ECL檢測(cè)檢測(cè)封閉二抗二抗一抗一抗洗滌洗滌掃描分析轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 SDS電泳技術(shù)首先在1967年由Shapiro建立,1969年由Weber和Osborn進(jìn)一步完善。 SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳，是在PAGE凝膠中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉，含有大量帶負(fù)電荷的SO32-），SDS能破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，在含有強(qiáng)還原劑的溶液中可與蛋白質(zhì)形成SDS-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物蛋

4、白質(zhì)復(fù)合物（電泳樣品加入樣品緩沖液后,要在沸水中煮3-5分鐘）。由于結(jié)合大量帶負(fù)電荷的SDS，好比蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的“外衣外衣”，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了，從而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用，蛋白質(zhì)在SDS-PAGE膠中的遷移率主要取決于其分子量的大小。遷移率主要取決于其分子量的大小。 SDS-PAGESDS-PAGE電泳的基本原理電泳的基本原理1 A protein sample is subjected to electrophoresis on an SDS-polyacrylamide gel. Western blot 實(shí)驗(yàn)流程SDS-PAGE電

5、泳操作步驟電泳操作步驟（1）配制分離膠）配制分離膠 注意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠后迅速灌膠（2）灌分離膠）灌分離膠 灌膠之上輕輕加一層水或正丁醇液（3）配制濃縮膠）配制濃縮膠 注意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠后迅速用滴管灌膠（4）灌濃縮膠）灌濃縮膠 倒掉分離膠上的水或正丁醇之后，倒置吸凈殘留溶液，灌注濃縮膠，將梳子插好,膠凝固好后有膠條的國(guó)產(chǎn)槽需要去掉膠條（濃縮膠與分離膠一般比例為1：3）（5）加）加Tris-甘氨酸電泳緩沖液甘氨酸電泳緩沖液 足量（6）上樣）上樣 蛋白質(zhì)含量要適量，上樣總體積要適量（7）電泳）電泳 50V1h, 100V2.5h，根據(jù)分子量的大小確定電壓和時(shí)間，一般溴酚藍(lán)

6、離膠下cm停止電泳，上槽上槽接負(fù)極，下槽接正極接負(fù)極，下槽接正極 2 Electroblotting transfers the separated proteins from the gel to the surface of a nitrocellulose membrane. Western blot 實(shí)驗(yàn)流程（1）剝膠）剝膠 用切膠板切去濃縮膠和多余的分離膠（2）準(zhǔn)備濾紙和硝酸纖維素膜）準(zhǔn)備濾紙和硝酸纖維素膜 切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，大小與膠一致 （3）浸泡濾紙、膜和海綿墊）浸泡濾紙、膜和海綿墊 用轉(zhuǎn)移液（含甲醇）浸泡，開(kāi)門通風(fēng)（4）制備）制備“三明治三明治” 制備每一層時(shí)注意趕氣泡

7、（5）電轉(zhuǎn)）電轉(zhuǎn) 75V，1.5h，在冰浴中進(jìn)行，黑板對(duì)黑極（），白板對(duì)白極（）黑板對(duì)黑極（），白板對(duì)白極（）電轉(zhuǎn)操作步驟電轉(zhuǎn)操作步驟4 An antibody that is specific for the protein of interest (the primary antibody - Ab1) is added to the nitrocellulose sheet and reacts with the antigen. Only the band containing the protein of interest binds the antibody, forming a

8、layer of antibody molecules Western blot 實(shí)驗(yàn)流程3 The blot is incubated with a generic protein (such as milk proteins or BSA) which binds to any remaining sticky places on the nitrocellulose. 5 Following several rinses for removal of non-specifically bound Ab1, the Ab1-antigen complex on the nitrocellu

9、lose sheet is incubated with a second antibody (Ab2), which specifically recognizes the Fc domain of the primary antibody and binds it. Ab2 is radioactively labeled, or is covalently linked to a reporter enzyme, which allows to visualize the protein-Ab1-Ab2 complex .Western blot 實(shí)驗(yàn)流程Western blot 實(shí)驗(yàn)流

10、程6 ECL detection ECL Kit is based on the enzyme-linked immunodetection of antigen-specific antibody using anti-IgG secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase ( HRP ), which reacts with a chemiluminescent substrate in the presence of a chemical enhancer. Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 c-fosactin62kD42kD將X-光片在凝膠圖像分析儀上進(jìn)行灰度掃描，比較目的蛋白與內(nèi)參照蛋白的灰度值，可得到蛋白表達(dá)半定量分析結(jié)果考核題目考核題目1. Bio-radBio-rad垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置的主要用途是什么？垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置的主要用途是什么？ 2. Bio-radBio-rad垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置主要由哪幾部分構(gòu)成？垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置主要由哪幾部分構(gòu)成？3. SDS-PAGE SDS-PAGE電泳中蛋白質(zhì)遷移速率的快慢取決于什么？電泳中蛋白質(zhì)遷移速率的快慢取決于什么？4. SDS-PAGE SDS-PAGE電泳的操作步驟