第三章 生物細(xì)胞培養(yǎng)基滅菌設(shè)備

1、發(fā)酵機(jī)械與設(shè)備發(fā)酵機(jī)械與設(shè)備n徐徐 明明 芳芳 博博 士士n教教 授授n暨暨 南南 大大 學(xué)學(xué) 生生 科科 院院n2015-09-25目錄緒論緒論第一篇第一篇 生物質(zhì)原料處理設(shè)備生物質(zhì)原料處理設(shè)備第二篇第二篇 生物反應(yīng)設(shè)備生物反應(yīng)設(shè)備第三篇第三篇 產(chǎn)物分離設(shè)備產(chǎn)物分離設(shè)備第四篇第四篇 其他設(shè)備其他設(shè)備第一篇第一篇 生物質(zhì)原料處理設(shè)備生物質(zhì)原料處理設(shè)備n第一章第一章 生物質(zhì)原料預(yù)處理設(shè)備生物質(zhì)原料預(yù)處理設(shè)備n第二章 生物細(xì)胞培養(yǎng)基制備設(shè)備本章內(nèi)容本章內(nèi)容生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器檢測(cè)控檢測(cè)控制儀表制儀表培養(yǎng)基培養(yǎng)基（）經(jīng)加工經(jīng)加工原料原料酶酶細(xì)胞細(xì)胞生物催化劑生物催化劑（游離或固定化）（游離或固定化）

2、機(jī)械能機(jī)械能除除菌菌空氣空氣產(chǎn)品提取純化產(chǎn)品提取純化副產(chǎn)品副產(chǎn)品產(chǎn)品產(chǎn)品廢物廢物熱能熱能營(yíng)養(yǎng)物營(yíng)養(yǎng)物典型工業(yè)生物技術(shù)過(guò)程典型工業(yè)生物技術(shù)過(guò)程培養(yǎng)基制備工藝過(guò)程：培養(yǎng)基制備工藝過(guò)程： 思考題n1.工業(yè)上防止雜菌污染的措施有哪些？n2.如何計(jì)算滅菌時(shí)間如何計(jì)算滅菌時(shí)間？n3.某發(fā)酵罐內(nèi)裝某發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度為培養(yǎng)基，采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度為1310C，原污染程度為每，原污染程度為每1ml含有含有2105個(gè)雜菌，已知個(gè)雜菌，已知1310C時(shí)滅時(shí)滅菌速度常數(shù)為菌速度常數(shù)為15min-1，求滅菌所需的維持時(shí)間，求滅菌所需的維持時(shí)間。n4、板式換熱器的結(jié)構(gòu)域工作原理、板式換熱

3、器的結(jié)構(gòu)域工作原理n5、噴淋冷卻連續(xù)滅菌主要設(shè)備與滅菌流程噴淋冷卻連續(xù)滅菌主要設(shè)備與滅菌流程6、噴射加熱連續(xù)滅菌噴射加熱連續(xù)滅菌主要設(shè)備與滅菌流程主要設(shè)備與滅菌流程7、薄板式換熱器連續(xù)滅菌、薄板式換熱器連續(xù)滅菌主要設(shè)備與滅菌流程主要設(shè)備與滅菌流程8、n9、發(fā)酵罐實(shí)罐滅菌操作要點(diǎn)？、發(fā)酵罐實(shí)罐滅菌操作要點(diǎn)？n10、發(fā)酵罐的滅菌操作步驟1、概述：染菌的危害染菌的危害3 3、實(shí)驗(yàn)室滅菌的常規(guī)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室滅菌的常規(guī)設(shè)備4、濕熱滅菌原理與計(jì)算1、概述染菌的危害：染菌的危害：。滅菌的定義滅菌的定義n定義： 滅菌與消毒的區(qū)別： 是用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有所有 微生物微生物，包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢

4、和孢子。用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器皿內(nèi)外的病源微生物病源微生物。 1n目的：n要求：n達(dá)到要求的達(dá)到要求的(雜菌污染降低到被處理的每雜菌污染降低到被處理的每1000罐中只殘留罐中只殘留1個(gè)活菌的程度個(gè)活菌的程度, ,）；n盡量減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞。盡量減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞。3、實(shí)驗(yàn)室滅菌的常規(guī)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室滅菌的常規(guī)設(shè)備 主要是因高溫使微生物體內(nèi)的一些重要蛋白質(zhì)，如蛋白質(zhì)，如酶等，發(fā)生凝固、變性，酶等，發(fā)生凝固、變性，從而導(dǎo)致微生物無(wú)法生存而死亡。n致死溫度與致死時(shí)間致死溫度與致死時(shí)間：n 蒸汽來(lái)源容易，操作費(fèi)用低，本身無(wú)毒；蒸汽來(lái)源容易，操作費(fèi)用低，本身無(wú)毒；n蒸汽有強(qiáng)的穿透力，滅菌易于徹

5、底；蒸汽有強(qiáng)的穿透力，滅菌易于徹底；n蒸汽有很大的潛熱；蒸汽有很大的潛熱；n操作方便，易管理。操作方便，易管理。n微生物營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的均相熱死滅動(dòng)力學(xué)符合化學(xué)反應(yīng)的一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，即： N-任一時(shí)刻的活細(xì)菌濃度，個(gè)/L； t-時(shí)間，min； K-比熱死速率常數(shù)，min-1，越小越耐熱 NkdtdN微生物的熱力致死動(dòng)力學(xué)方程微生物的熱力致死動(dòng)力學(xué)方程：取邊界條件取邊界條件t0=0，N=N0，對(duì)上式積分得，對(duì)上式積分得 或或 為理論滅菌時(shí)間的對(duì)數(shù)殘留規(guī)律公式為理論滅菌時(shí)間的對(duì)數(shù)殘留規(guī)律公式。0012.303lnlgttNNtKNKN0kttNeN問(wèn)題：能不能做到絕對(duì)無(wú)菌？ n升溫、冷卻兩階段也有一升溫

6、、冷卻兩階段也有一定的滅菌效果，考慮到定的滅菌效果，考慮到，故可以簡(jiǎn)單地利，故可以簡(jiǎn)單地利用式用式n (N/N0) =-kt 來(lái)粗略估算滅菌所需時(shí)間。來(lái)粗略估算滅菌所需時(shí)間。http:/ 解解：N0=401062105=81012(個(gè)) Nt=0.001(個(gè)) k=1.8(min-1) (Nt/N0)=-kt t=2.303/klg(N0/Nt)=2.303/1.8lg(81015) =20.34(min) 由于升溫階段就有部分菌被殺滅，特別是當(dāng)培由于升溫階段就有部分菌被殺滅，特別是當(dāng)培 養(yǎng)基加熱至養(yǎng)基加熱至1000C以上，這個(gè)作用較為顯著，以上，這個(gè)作用較為顯著， 故實(shí)際保溫階段時(shí)間比計(jì)算值

7、要短。故實(shí)際保溫階段時(shí)間比計(jì)算值要短。n n1、板式換熱器滅菌、板式換熱器滅菌n2、管道式換熱器滅菌、管道式換熱器滅菌一、板式換熱器滅菌一、板式換熱器滅菌 2009.09鄭裕國(guó) 王遠(yuǎn)山 汪釗 陳小龍 朱勍 徐建妙1、板式換熱器的組成滅菌滅菌三類連續(xù)滅菌（連消）三類連續(xù)滅菌（連消）n1.噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程n2.噴射加熱連續(xù)滅菌流程噴射加熱連續(xù)滅菌流程 n3.薄板式換熱器連續(xù)滅菌流程薄板式換熱器連續(xù)滅菌流程 (Ct/C0)=kt t=2.303/klg(C0/Ct) 式中：式中：C0、Ct分別為單位體積培養(yǎng)基滅菌前、后分別為單位體積培養(yǎng)基滅菌前、后 的含菌數(shù)。的含菌數(shù)。 n例

8、例2某發(fā)酵罐內(nèi)裝某發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，采用連續(xù)滅菌，滅菌溫培養(yǎng)基，采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度為度為1310C，原污染程度為每，原污染程度為每1ml含有含有2105個(gè)雜菌，已知個(gè)雜菌，已知1310C時(shí)滅菌速度常數(shù)為時(shí)滅菌速度常數(shù)為15min-1，求滅菌所需的維持時(shí)間。，求滅菌所需的維持時(shí)間。1、連續(xù)滅菌時(shí)間的估算、連續(xù)滅菌時(shí)間的估算解：解：C0=2105(個(gè)/ml) Ct=0.001/(40106)=2.510-11(個(gè)/ml) t=2.303/klg(C0/Ct)=2.303/15lg(2105)/(2.510-11) =2.37 min 配料罐 連消泵 連消塔 維持罐 冷卻罐 蒸汽 蒸汽

9、放汽 冷卻水 無(wú)菌培養(yǎng)基 進(jìn)發(fā)酵罐 加熱保溫冷卻2、連消塔連消塔-噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程（1）連消塔）連消塔設(shè)備構(gòu)造 。 圖2-8 連 消 器 的 構(gòu) 造出 料 口排 液 口蒸 汽 進(jìn) 口進(jìn) 料 口圖2-7 連 消 塔 的 構(gòu) 造 培 養(yǎng) 液蒸 汽培 養(yǎng) 液 圖2-9 維 持 罐 的 外 形出 料人 孔放 汽測(cè) 溫 口進(jìn) 料（2）維持罐）維持罐體積計(jì)算：V-維持罐容積，m3；v-料液體積流量，m3/h；- 維持時(shí)間，825min；充滿系數(shù)60vV（3 3）冷卻設(shè)備）冷卻設(shè)備 圖2-4 連續(xù)滅菌設(shè)備流程示意圖1-配料罐（拌料罐）2-蒸汽入口 3-連消塔 4-維持罐 5-培養(yǎng)基出

10、口 6-噴淋冷卻 7-冷卻水1234567 配料罐 連消泵 連消塔 維持罐 冷卻罐 蒸汽 蒸汽 放汽 冷卻水 無(wú)菌培養(yǎng)基 進(jìn)發(fā)酵罐 （4）連消塔）連消塔-噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程加熱保溫冷卻連消塔連消塔- -噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程（1 1）配料預(yù)熱罐配料預(yù)熱罐，將配好的料液預(yù)熱預(yù)熱到6070，以避免滅菌時(shí)由于料液與蒸汽溫度相差過(guò)大而產(chǎn)生水汽撞擊聲；（2）連消塔，是使高溫蒸汽與料液高溫蒸汽與料液迅速接觸混合，并使料液的溫度很快升高到滅菌溫度（126126132132）；）；（3 3）維持罐維持罐，維持料液溫度，延長(zhǎng)滅菌時(shí)間（4）冷卻管，生產(chǎn)上一般采用冷水噴淋冷卻

11、，冷水噴淋冷卻，冷卻到冷卻到40405050后后，輸送到預(yù)先已經(jīng)滅菌過(guò)的罐內(nèi)。 圖2-5 加熱-真空冷卻連續(xù)滅菌流程生培養(yǎng)液蒸汽噴射加熱器維持管膨脹閥急聚蒸發(fā)室滅菌好的培養(yǎng)液真空 。 圖2-10 噴射加熱器示意圖1-噴嘴 2-吸入口 3-吸入室 4-混合噴嘴 5-混合段 6-擴(kuò)大管料液已加熱料液 2 3 4 5 6 優(yōu)點(diǎn)：（2 2）、噴射加熱）、噴射加熱- -真空冷卻流程真空冷卻流程4、板式換熱器滅菌流程、板式換熱器滅菌流程。 圖2-6 薄板換熱器連續(xù)滅菌流程維持段蒸汽加熱段熱回收段水冷卻段生培養(yǎng)液冷卻水滅菌好的培養(yǎng)液1、板式換熱器的組成n在中進(jìn)行實(shí)罐滅菌實(shí)罐滅菌，是典型的分批滅菌。n全過(guò)程包

12、括升溫、保溫、升溫、保溫、降溫三個(gè)過(guò)程降溫三個(gè)過(guò)程N(yùn)kdtdNtKNN0lnNNNNNNNNNNNNNN22110221100lnlnlnlnln：n n n Kh-保溫階段的孢子比熱死亡速度常數(shù)1100/lntRTENNdteA1221lnttKhNNdteAttRTENN322/ln溫度隨滅菌時(shí)間的變化溫度隨滅菌時(shí)間的變化 培養(yǎng)基的間歇滅菌就培養(yǎng)基的間歇滅菌就是將配制好的培養(yǎng)基是將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他裝放在發(fā)酵罐或其他裝置中，通入蒸汽將培置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起養(yǎng)基和所用設(shè)備一起進(jìn)行加熱滅菌的過(guò)進(jìn)行加熱滅菌的過(guò) 程，程，通常也稱為實(shí)罐滅菌。通常也稱為實(shí)罐滅菌。 間歇滅

13、菌過(guò)程包括間歇滅菌過(guò)程包括升溫升溫、保溫保溫和和冷卻等冷卻等三個(gè)階段三個(gè)階段，圖，圖57為為培養(yǎng)基間歇滅菌過(guò)程培養(yǎng)基間歇滅菌過(guò)程中的溫度變化情況。中的溫度變化情況。某發(fā)酵罐內(nèi)裝培養(yǎng)基某發(fā)酵罐內(nèi)裝培養(yǎng)基40m3,在在121下進(jìn)下進(jìn)行分批滅菌，設(shè)每毫升培養(yǎng)基中含耐熱行分批滅菌，設(shè)每毫升培養(yǎng)基中含耐熱的芽孢為的芽孢為107個(gè)，求理論滅菌時(shí)間？個(gè)，求理論滅菌時(shí)間？（分批滅菌的滅菌常數(shù)（分批滅菌的滅菌常數(shù) lgk=-14845/T + 36.127） 解：N0= 40106107=41014 N=0.001 lgk=-14845/T + 36.127 =-14845/(273+121)+36.127 =

14、-1.55 k=0.0281 s -1 t= 1/k lnN0/N = 1/0.0281 ln41014/0.001 =1442.6 s =24 min 分空氣過(guò)濾器滅菌分空氣過(guò)濾器滅菌并用空氣吹干并用空氣吹干夾套或蛇管排冷水，開(kāi)啟夾套或蛇管排冷水，開(kāi)啟，也，也可夾套內(nèi)通蒸汽可夾套內(nèi)通蒸汽達(dá)達(dá)70左右左右取樣管取樣管放料管放料管汽汽120，1105pa保溫保溫保溫階段，凡液面以下各管保溫階段，凡液面以下各管道都應(yīng)通蒸汽，液面上其余道都應(yīng)通蒸汽，液面上其余各管道則應(yīng)排蒸汽，不留死各管道則應(yīng)排蒸汽，不留死角，維持壓力、溫度恒定角，維持壓力、溫度恒定罐壓接近空氣壓力罐壓接近空氣壓力向罐內(nèi)通無(wú)菌空氣向

15、罐內(nèi)通無(wú)菌空氣保溫結(jié)束，依次關(guān)閉保溫結(jié)束，依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥門各排汽、進(jìn)汽閥門夾套或蛇管中通冷水夾套或蛇管中通冷水 培養(yǎng)基降溫到所需溫度培養(yǎng)基降溫到所需溫度滅菌流程（三路進(jìn)氣、四路出氣）滅菌流程（三路進(jìn)氣、四路出氣）三路進(jìn)汽三路進(jìn)汽：直接蒸直接蒸汽從汽從進(jìn)入罐內(nèi)直接加進(jìn)入罐內(nèi)直接加熱，直到所規(guī)定的溫?zé)?，直到所?guī)定的溫度，并維持一定的時(shí)度，并維持一定的時(shí)間。這就是所謂的間。這就是所謂的“三路進(jìn)氣三路進(jìn)氣”。* ：直接蒸汽直接蒸汽從從排氣排氣分批滅菌設(shè)備示意圖分批滅菌設(shè)備示意圖 n總蒸汽管道壓力要求不低于0.3-0.35Mpa，使用壓力不低于0.2Mpa。n空消空消：n一般維持罐壓0.150.

16、2Mpa，圖2-11 實(shí)罐滅菌設(shè)備示意圖冷凝水冷卻水進(jìn)口排料管進(jìn)汽取樣管進(jìn)汽進(jìn)汽冷卻水出口排氣排氣排氣排氣消沫劑管出氣口接種管進(jìn)料口進(jìn)汽進(jìn)氣管三路進(jìn)氣三路進(jìn)氣n保溫階段保溫階段， 間歇滅菌間歇滅菌n是在所用的發(fā)酵罐或其他培養(yǎng)裝置中進(jìn)行的，它是是在所用的發(fā)酵罐或其他培養(yǎng)裝置中進(jìn)行的，它是在配制罐中配好培養(yǎng)基后，通過(guò)專用管道輸入發(fā)酵在配制罐中配好培養(yǎng)基后，通過(guò)專用管道輸入發(fā)酵罐等培養(yǎng)設(shè)備中，然后開(kāi)始滅菌。罐等培養(yǎng)設(shè)備中，然后開(kāi)始滅菌。n在進(jìn)行培養(yǎng)基的間歇滅菌之前，通常先將發(fā)酵罐等在進(jìn)行培養(yǎng)基的間歇滅菌之前，通常先將發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置的分空氣過(guò)濾器進(jìn)行滅菌，并且用培養(yǎng)裝置的分空氣過(guò)濾器進(jìn)行滅菌，并且用

17、 開(kāi)始滅菌時(shí)，應(yīng)先放去夾套或蛇管中的冷水，開(kāi)啟開(kāi)始滅菌時(shí)，應(yīng)先放去夾套或蛇管中的冷水，開(kāi)啟排氣管閥，通過(guò)空氣管向發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基通人蒸排氣管閥，通過(guò)空氣管向發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基通人蒸汽進(jìn)行加熱，同時(shí)，也可在夾套內(nèi)通蒸汽進(jìn)行間接汽進(jìn)行加熱，同時(shí)，也可在夾套內(nèi)通蒸汽進(jìn)行間接加熱。加熱。n當(dāng)培養(yǎng)基溫度升到當(dāng)培養(yǎng)基溫度升到70左右時(shí)，從取樣管和放料管左右時(shí)，從取樣管和放料管向罐內(nèi)通人蒸汽進(jìn)一步加熱，當(dāng)溫度升至向罐內(nèi)通人蒸汽進(jìn)一步加熱，當(dāng)溫度升至120C，罐壓為罐壓為1100Pa(表壓表壓)時(shí)，打開(kāi)時(shí)，打開(kāi)接種、補(bǔ)料、消泡接種、補(bǔ)料、消泡劑、酸、堿等管道閥門進(jìn)行排汽，劑、酸、堿等管道閥門進(jìn)行排汽，并調(diào)節(jié)好各

18、進(jìn)汽并調(diào)節(jié)好各進(jìn)汽和排汽閥門的排汽量，使罐壓和溫度保持在一定水和排汽閥門的排汽量，使罐壓和溫度保持在一定水平上進(jìn)行保溫。當(dāng)然在保溫過(guò)程中，應(yīng)注意凡在培平上進(jìn)行保溫。當(dāng)然在保溫過(guò)程中，應(yīng)注意凡在培養(yǎng)基液面下的各種進(jìn)口管道都應(yīng)通人蒸汽，而在液養(yǎng)基液面下的各種進(jìn)口管道都應(yīng)通人蒸汽，而在液面以上的其余各管道則應(yīng)排放蒸汽，這樣才能不留面以上的其余各管道則應(yīng)排放蒸汽，這樣才能不留死角，從而保證滅菌徹底。死角，從而保證滅菌徹底。n保溫結(jié)束后，依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥門，待罐內(nèi)保溫結(jié)束后，依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥門，待罐內(nèi)壓力低于空氣壓力后，向罐內(nèi)通入無(wú)菌空氣，在夾壓力低于空氣壓力后，向罐內(nèi)通入無(wú)菌空氣，在夾套或

19、蛇管中通冷水降溫，使培養(yǎng)基的溫度降到所需套或蛇管中通冷水降溫，使培養(yǎng)基的溫度降到所需的溫度，進(jìn)行下一步的發(fā)酵和培養(yǎng)。的溫度，進(jìn)行下一步的發(fā)酵和培養(yǎng)。n 培養(yǎng)基間歇滅菌過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題培養(yǎng)基間歇滅菌過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題分批滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)n優(yōu)點(diǎn)n缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：n對(duì)小型罐無(wú)優(yōu)勢(shì)，不方便，對(duì)設(shè)備要求高；對(duì)小型罐無(wú)優(yōu)勢(shì)，不方便，對(duì)設(shè)備要求高；n蒸汽波動(dòng)時(shí)滅菌不徹底；蒸汽波動(dòng)時(shí)滅菌不徹底；n當(dāng)培養(yǎng)基中含有固體顆粒或有較多泡沫時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)基中含有固體顆?；蛴休^多泡沫時(shí)，以分批滅菌好，防止滅菌不徹底。以分批滅菌好，防止滅菌不徹底。 分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較 分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較 n連續(xù)滅菌的優(yōu)點(diǎn)：（適