金免疫分析技術(shù)課件

1、金免疫分析技術(shù)1金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)21、膠體金的制備原理、方法、注意事項(xiàng)、質(zhì)量鑒定、膠體金的制備原理、方法、注意事項(xiàng)、質(zhì)量鑒定、膠體金保存膠體金保存2、免疫金的制備原理、技術(shù)要點(diǎn)免疫金的制備原理、技術(shù)要點(diǎn)3、免疫金免疫金 測(cè)定技術(shù)測(cè)定技術(shù)3金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù) 膠體金（colloidal gold）也稱金溶膠（goldsol），是金鹽被還原成原子金后形成的金顆粒懸液。什么叫膠體金什么叫膠體金4金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)zeta電位可以使膠體金顆粒之間相互排斥，以維持膠體金的穩(wěn)定狀態(tài)。 基礎(chǔ)金核雙離子 內(nèi)層負(fù)離子（auc12） zeta電位 外層離子層 h+分散在膠體間的溶液

2、中5金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)膠體金的制備膠體金的制備制備原理制備原理還原法還原法：用一定量的還原劑把一定濃度的金用一定量的還原劑把一定濃度的金鹽溶液還原成金離子。鹽溶液還原成金離子。常用的金鹽是氯金酸常用的金鹽是氯金酸還原劑是枸櫞酸鈉、鞣酸、維生素還原劑是枸櫞酸鈉、鞣酸、維生素c、白磷、白磷、硼氫化鈉硼氫化鈉6金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)膠體金的制備膠體金的制備制備方法制備方法氯金酸水溶液加熱沸騰攪拌著加入枸櫞酸鈉水溶液 金黃色的氯金酸水溶液在2min內(nèi)變?yōu)樽霞t色 再煮沸15min冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積7金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)膠體金的制備膠體金的制備注意注意事項(xiàng)事項(xiàng)1 1）、玻璃

3、容器的清潔容器使用前必須酸洗和硅化）、玻璃容器的清潔容器使用前必須酸洗和硅化硅化的一般過(guò)程硅化的一般過(guò)程 用用5%5%的二氯二甲硅烷的氯仿溶液浸泡玻璃容器的二氯二甲硅烷的氯仿溶液浸泡玻璃容器1min1min，室溫干燥后，用蒸餾水沖洗，在干燥備用。，室溫干燥后，用蒸餾水沖洗，在干燥備用。2 2）、試劑、水質(zhì)和環(huán)境）、試劑、水質(zhì)和環(huán)境 使用氯金酸時(shí)不能用金屬藥匙，避使用氯金酸時(shí)不能用金屬藥匙，避免接錯(cuò)天平秤盤雙蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室盡量無(wú)塵免接錯(cuò)天平秤盤雙蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室盡量無(wú)塵phph值值3.03.05.85.8的的檸檬酸磷酸鹽、檸檬酸磷酸鹽、ph5.8ph5.88.38.3的的tris-hcltris-

4、hcl和和phph值值8.58.510.310.3的硼酸的硼酸氫氧化鈉等緩沖容量大的緩沖系統(tǒng)，但應(yīng)控制濃度不要太高氫氧化鈉等緩沖容量大的緩沖系統(tǒng)，但應(yīng)控制濃度不要太高8金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)膠體金的制備膠體金的制備質(zhì)量鑒定和膠體金保存質(zhì)量鑒定和膠體金保存質(zhì)量鑒定外觀檢查質(zhì)量鑒定外觀檢查 清亮透明懸液清亮透明懸液顆粒大小與均一性檢查顆粒大小與均一性檢查 肉眼觀察或肉眼觀察或分光光度計(jì)掃描或者電鏡檢查分光光度計(jì)掃描或者電鏡檢查膠體金保存膠體金保存 潔凈玻璃器皿，放入少潔凈玻璃器皿，放入少量防腐劑，少量分裝備用量防腐劑，少量分裝備用9金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)免疫金免疫金制備制備膠體金與抗膠

5、體金與抗原抗體等大原抗體等大分子物質(zhì)結(jié)分子物質(zhì)結(jié)合形成合形成制備制備原理原理將蛋白質(zhì)吸附到膠體金顆粒表面將蛋白質(zhì)吸附到膠體金顆粒表面而結(jié)合的過(guò)程而結(jié)合的過(guò)程環(huán)境環(huán)境ph值和離子強(qiáng)度是影響吸附值和離子強(qiáng)度是影響吸附的主要因素的主要因素10金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)免疫金的制備免疫金的制備技術(shù)技術(shù)要點(diǎn)要點(diǎn)膠體金溶液膠體金溶液phph值的調(diào)配值的調(diào)配0.2mollk2co3或者或者0.1mollhcl調(diào)整到標(biāo)記調(diào)整到標(biāo)記蛋白質(zhì)帶等電點(diǎn)貨稍偏堿。蛋白質(zhì)帶等電點(diǎn)貨稍偏堿。通常要經(jīng)多次試驗(yàn)通常要經(jīng)多次試驗(yàn)。蛋白質(zhì)最適用量的確定蛋白質(zhì)最適用量的確定用標(biāo)記蛋白質(zhì)作系列稀釋，用標(biāo)記蛋白質(zhì)作系列稀釋，分別取分別

6、取0.1ml0.1ml蛋白質(zhì)稀釋液加蛋白質(zhì)稀釋液加入入1ml1ml膠體金溶液中，并設(shè)不膠體金溶液中，并設(shè)不加蛋白質(zhì)的對(duì)照管加入加蛋白質(zhì)的對(duì)照管加入10%nacl10%nacl溶液溶液0.1ml0.1ml混勻、靜混勻、靜置置2 2小時(shí)。選以紅色不變管中小時(shí)。選以紅色不變管中蛋白質(zhì)含量最低為穩(wěn)定蛋白質(zhì)含量最低為穩(wěn)定1ml1ml膠膠體金所必需蛋白質(zhì)的量。體金所必需蛋白質(zhì)的量。膠體金的標(biāo)記膠體金的標(biāo)記按照最適比，在電磁按照最適比，在電磁攪拌下將所需要量的攪拌下將所需要量的膠體金加入一定量的膠體金加入一定量的蛋白質(zhì)溶液中，加入蛋白質(zhì)溶液中，加入一定量的穩(wěn)定劑，調(diào)一定量的穩(wěn)定劑，調(diào)整整phph至至8.58

7、.5，離心，離心，輕吸上清液，用緩沖輕吸上清液，用緩沖液懸浮，恢復(fù)原體積液懸浮，恢復(fù)原體積后再離心，重復(fù)操作后再離心，重復(fù)操作2 2、3 3次。次。膠體金結(jié)合物的膠體金結(jié)合物的純化與鑒定純化與鑒定純化：超速離心法純化：超速離心法和凝膠過(guò)濾法和凝膠過(guò)濾法鑒定：電鏡測(cè)定顆鑒定：電鏡測(cè)定顆粒的平均直徑以及粒的平均直徑以及免疫組化濾紙模型免疫組化濾紙模型測(cè)定結(jié)合物的特異測(cè)定結(jié)合物的特異性、敏感性性、敏感性保存保存用稀釋液配制用稀釋液配制成工作濃度保成工作濃度保存存11金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)金免疫測(cè)定技術(shù)分類金免疫測(cè)定技術(shù)分類斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn) digfa斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)斑點(diǎn)金層析

8、試驗(yàn) dica（ dot immunogold chromatographic assay）12金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)dijfadijfa將抗原抗體點(diǎn)加在固相載體硝酸纖維素薄膜上，制將抗原抗體點(diǎn)加在固相載體硝酸纖維素薄膜上，制成抗原抗體包被的微孔濾膜并貼置于吸水材料上成抗原抗體包被的微孔濾膜并貼置于吸水材料上標(biāo)本中的抗原抗體被膜上的抗體抗原捕獲，無(wú)關(guān)蛋標(biāo)本中的抗原抗體被膜上的抗體抗原捕獲，無(wú)關(guān)蛋白隨液體濾出白隨液體濾出 加入膠體金標(biāo)記物在滲濾中與相應(yīng)的抗原抗體結(jié)合。加入膠體金標(biāo)記物在滲濾中與相應(yīng)的抗原抗體結(jié)合。陽(yáng)性反應(yīng)：膜上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)陽(yáng)性反應(yīng)：膜上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)斑點(diǎn)金免

9、疫滲濾試驗(yàn)原理原理13金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)14金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù) digfa雙抗體夾心雙抗體夾心法測(cè)抗原法測(cè)抗原digfa-間接法測(cè)抗體間接法測(cè)抗體抗體結(jié)合在微孔濾膜抗體結(jié)合在微孔濾膜的中央的中央 加待測(cè)標(biāo)加待測(cè)標(biāo)本本 加金標(biāo)抗體加金標(biāo)抗體 潔洗滌劑后，潔洗滌劑后，陽(yáng)陽(yáng)性結(jié)果，膜中央呈現(xiàn)性結(jié)果，膜中央呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)紅色斑點(diǎn) 抗原包被在微孔濾膜抗原包被在微孔濾膜上滴加待測(cè)標(biāo)本上滴加待測(cè)標(biāo)本加洗滌劑后滴加加洗滌劑后滴加金標(biāo)抗抗體加洗滌金標(biāo)抗抗體加洗滌劑后，劑后，陽(yáng)性結(jié)果，膜中陽(yáng)性結(jié)果，膜中央呈紅色斑點(diǎn)央呈紅色斑點(diǎn)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)斑點(diǎn)金免疫滲濾試

10、驗(yàn)15金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)digfa-間接法測(cè)抗體間接法測(cè)抗體陽(yáng)性陽(yáng)性陰性陰性固相膜固相膜固相固相抗原抗原待測(cè)待測(cè)抗體抗體金標(biāo)二抗人金標(biāo)二抗人人人iggigg斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)16金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)digfadigfa雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法測(cè)抗原ab操作：加樣操作：加樣a； 加加金標(biāo)記物金標(biāo)記物； 洗滌洗滌b， 觀察觀察具體步驟如下： （1 1）將反應(yīng)板平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，于小孔內(nèi)滴加血清標(biāo)本）將反應(yīng)板平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，于小孔內(nèi)滴加血清標(biāo)本a 1a 12 2滴，待完全滲滴，待完全滲入。入。 （2 2）于小孔內(nèi)滴加金標(biāo)記物物試劑）于小孔內(nèi)滴加金標(biāo)記物物試劑1

11、 12 2滴，待完全滲入。滴，待完全滲入。 （3 3）于小孔內(nèi)滴加洗滌液）于小孔內(nèi)滴加洗滌液b 2b 23 3滴，待完全滲入。滴，待完全滲入。 （4 4）判讀結(jié)果：）判讀結(jié)果：在膜中央有清晰的淡紅色斑點(diǎn)顯示者判為陽(yáng)性反應(yīng)；反之，在膜中央有清晰的淡紅色斑點(diǎn)顯示者判為陽(yáng)性反應(yīng)；反之，則為陰性反應(yīng)。斑點(diǎn)呈色的深淺相應(yīng)地提示陽(yáng)性強(qiáng)度。則為陰性反應(yīng)。斑點(diǎn)呈色的深淺相應(yīng)地提示陽(yáng)性強(qiáng)度。 斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)17金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù) 原理和免疫滲透試驗(yàn)相同。原理和免疫滲透試驗(yàn)相同。 不同在一個(gè)是穿流一個(gè)是橫流。不同在一個(gè)是穿流一個(gè)是橫流。dica原理原理斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)1

12、8金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)圖示斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)圖示斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)19金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)digfa 穿流（flow through）dica 橫流（lateral flow）斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)20金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)雙抗體夾心法雙抗體夾心法測(cè)抗原測(cè)抗原 間接法間接法測(cè)抗體測(cè)抗體 競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原測(cè)抗原斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)21金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)c 陰性b 陽(yáng)性dica-dica-雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法測(cè)抗原斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)22金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)dica-間接法測(cè)抗體間接法測(cè)抗體c 陰性b 陽(yáng)性斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)23金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)陰性弱陽(yáng)性陽(yáng)性dica競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原檢測(cè)線顏色強(qiáng)度與sd濃度負(fù)相關(guān)斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)斑點(diǎn)金層析試驗(yàn)24金免疫分析技術(shù)金免疫分析技術(shù)檢測(cè)檢測(cè)hcghcg，afpafp、輪狀病毒、輪狀病毒、a a族鏈球族鏈球菌、衣原