金免疫分析技術課件

1、金免疫分析技術1金免疫分析技術金免疫分析技術21、膠體金的制備原理、方法、注意事項、質量鑒定、膠體金的制備原理、方法、注意事項、質量鑒定、膠體金保存膠體金保存2、免疫金的制備原理、技術要點免疫金的制備原理、技術要點3、免疫金免疫金 測定技術測定技術3金免疫分析技術金免疫分析技術 膠體金（colloidal gold）也稱金溶膠（goldsol），是金鹽被還原成原子金后形成的金顆粒懸液。什么叫膠體金什么叫膠體金4金免疫分析技術金免疫分析技術zeta電位可以使膠體金顆粒之間相互排斥，以維持膠體金的穩(wěn)定狀態(tài)。 基礎金核雙離子 內層負離子（auc12） zeta電位 外層離子層 h+分散在膠體間的溶液

2、中5金免疫分析技術金免疫分析技術膠體金的制備膠體金的制備制備原理制備原理還原法還原法：用一定量的還原劑把一定濃度的金用一定量的還原劑把一定濃度的金鹽溶液還原成金離子。鹽溶液還原成金離子。常用的金鹽是氯金酸常用的金鹽是氯金酸還原劑是枸櫞酸鈉、鞣酸、維生素還原劑是枸櫞酸鈉、鞣酸、維生素c、白磷、白磷、硼氫化鈉硼氫化鈉6金免疫分析技術金免疫分析技術膠體金的制備膠體金的制備制備方法制備方法氯金酸水溶液加熱沸騰攪拌著加入枸櫞酸鈉水溶液 金黃色的氯金酸水溶液在2min內變?yōu)樽霞t色 再煮沸15min冷卻后以蒸餾水恢復到原體積7金免疫分析技術金免疫分析技術膠體金的制備膠體金的制備注意注意事項事項1 1）、玻璃

3、容器的清潔容器使用前必須酸洗和硅化）、玻璃容器的清潔容器使用前必須酸洗和硅化硅化的一般過程硅化的一般過程 用用5%5%的二氯二甲硅烷的氯仿溶液浸泡玻璃容器的二氯二甲硅烷的氯仿溶液浸泡玻璃容器1min1min，室溫干燥后，用蒸餾水沖洗，在干燥備用。，室溫干燥后，用蒸餾水沖洗，在干燥備用。2 2）、試劑、水質和環(huán)境）、試劑、水質和環(huán)境 使用氯金酸時不能用金屬藥匙，避使用氯金酸時不能用金屬藥匙，避免接錯天平秤盤雙蒸餾水，實驗室盡量無塵免接錯天平秤盤雙蒸餾水，實驗室盡量無塵phph值值3.03.05.85.8的的檸檬酸磷酸鹽、檸檬酸磷酸鹽、ph5.8ph5.88.38.3的的tris-hcltris-

4、hcl和和phph值值8.58.510.310.3的硼酸的硼酸氫氧化鈉等緩沖容量大的緩沖系統(tǒng)，但應控制濃度不要太高氫氧化鈉等緩沖容量大的緩沖系統(tǒng)，但應控制濃度不要太高8金免疫分析技術金免疫分析技術膠體金的制備膠體金的制備質量鑒定和膠體金保存質量鑒定和膠體金保存質量鑒定外觀檢查質量鑒定外觀檢查 清亮透明懸液清亮透明懸液顆粒大小與均一性檢查顆粒大小與均一性檢查 肉眼觀察或肉眼觀察或分光光度計掃描或者電鏡檢查分光光度計掃描或者電鏡檢查膠體金保存膠體金保存 潔凈玻璃器皿，放入少潔凈玻璃器皿，放入少量防腐劑，少量分裝備用量防腐劑，少量分裝備用9金免疫分析技術金免疫分析技術免疫金免疫金制備制備膠體金與抗膠

5、體金與抗原抗體等大原抗體等大分子物質結分子物質結合形成合形成制備制備原理原理將蛋白質吸附到膠體金顆粒表面將蛋白質吸附到膠體金顆粒表面而結合的過程而結合的過程環(huán)境環(huán)境ph值和離子強度是影響吸附值和離子強度是影響吸附的主要因素的主要因素10金免疫分析技術金免疫分析技術免疫金的制備免疫金的制備技術技術要點要點膠體金溶液膠體金溶液phph值的調配值的調配0.2mollk2co3或者或者0.1mollhcl調整到標記調整到標記蛋白質帶等電點貨稍偏堿。蛋白質帶等電點貨稍偏堿。通常要經多次試驗通常要經多次試驗。蛋白質最適用量的確定蛋白質最適用量的確定用標記蛋白質作系列稀釋，用標記蛋白質作系列稀釋，分別取分別

6、取0.1ml0.1ml蛋白質稀釋液加蛋白質稀釋液加入入1ml1ml膠體金溶液中，并設不膠體金溶液中，并設不加蛋白質的對照管加入加蛋白質的對照管加入10%nacl10%nacl溶液溶液0.1ml0.1ml混勻、靜混勻、靜置置2 2小時。選以紅色不變管中小時。選以紅色不變管中蛋白質含量最低為穩(wěn)定蛋白質含量最低為穩(wěn)定1ml1ml膠膠體金所必需蛋白質的量。體金所必需蛋白質的量。膠體金的標記膠體金的標記按照最適比，在電磁按照最適比，在電磁攪拌下將所需要量的攪拌下將所需要量的膠體金加入一定量的膠體金加入一定量的蛋白質溶液中，加入蛋白質溶液中，加入一定量的穩(wěn)定劑，調一定量的穩(wěn)定劑，調整整phph至至8.58

7、.5，離心，離心，輕吸上清液，用緩沖輕吸上清液，用緩沖液懸浮，恢復原體積液懸浮，恢復原體積后再離心，重復操作后再離心，重復操作2 2、3 3次。次。膠體金結合物的膠體金結合物的純化與鑒定純化與鑒定純化：超速離心法純化：超速離心法和凝膠過濾法和凝膠過濾法鑒定：電鏡測定顆鑒定：電鏡測定顆粒的平均直徑以及粒的平均直徑以及免疫組化濾紙模型免疫組化濾紙模型測定結合物的特異測定結合物的特異性、敏感性性、敏感性保存保存用稀釋液配制用稀釋液配制成工作濃度保成工作濃度保存存11金免疫分析技術金免疫分析技術金免疫測定技術分類金免疫測定技術分類斑點金免疫滲濾試驗斑點金免疫滲濾試驗 digfa斑點金層析試驗斑點金層析

8、試驗 dica（ dot immunogold chromatographic assay）12金免疫分析技術金免疫分析技術dijfadijfa將抗原抗體點加在固相載體硝酸纖維素薄膜上，制將抗原抗體點加在固相載體硝酸纖維素薄膜上，制成抗原抗體包被的微孔濾膜并貼置于吸水材料上成抗原抗體包被的微孔濾膜并貼置于吸水材料上標本中的抗原抗體被膜上的抗體抗原捕獲，無關蛋標本中的抗原抗體被膜上的抗體抗原捕獲，無關蛋白隨液體濾出白隨液體濾出 加入膠體金標記物在滲濾中與相應的抗原抗體結合。加入膠體金標記物在滲濾中與相應的抗原抗體結合。陽性反應：膜上呈現(xiàn)紅色斑點陽性反應：膜上呈現(xiàn)紅色斑點斑點金免疫滲濾試驗斑點金免

9、疫滲濾試驗原理原理13金免疫分析技術金免疫分析技術斑點金免疫滲濾試驗斑點金免疫滲濾試驗14金免疫分析技術金免疫分析技術 digfa雙抗體夾心雙抗體夾心法測抗原法測抗原digfa-間接法測抗體間接法測抗體抗體結合在微孔濾膜抗體結合在微孔濾膜的中央的中央 加待測標加待測標本本 加金標抗體加金標抗體 潔洗滌劑后，潔洗滌劑后，陽陽性結果，膜中央呈現(xiàn)性結果，膜中央呈現(xiàn)紅色斑點紅色斑點 抗原包被在微孔濾膜抗原包被在微孔濾膜上滴加待測標本上滴加待測標本加洗滌劑后滴加加洗滌劑后滴加金標抗抗體加洗滌金標抗抗體加洗滌劑后，劑后，陽性結果，膜中陽性結果，膜中央呈紅色斑點央呈紅色斑點斑點金免疫滲濾試驗斑點金免疫滲濾試

10、驗15金免疫分析技術金免疫分析技術digfa-間接法測抗體間接法測抗體陽性陽性陰性陰性固相膜固相膜固相固相抗原抗原待測待測抗體抗體金標二抗人金標二抗人人人iggigg斑點金免疫滲濾試驗斑點金免疫滲濾試驗16金免疫分析技術金免疫分析技術digfadigfa雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原ab操作：加樣操作：加樣a； 加加金標記物金標記物； 洗滌洗滌b， 觀察觀察具體步驟如下： （1 1）將反應板平放于實驗臺上，于小孔內滴加血清標本）將反應板平放于實驗臺上，于小孔內滴加血清標本a 1a 12 2滴，待完全滲滴，待完全滲入。入。 （2 2）于小孔內滴加金標記物物試劑）于小孔內滴加金標記物物試劑1

11、 12 2滴，待完全滲入。滴，待完全滲入。 （3 3）于小孔內滴加洗滌液）于小孔內滴加洗滌液b 2b 23 3滴，待完全滲入。滴，待完全滲入。 （4 4）判讀結果：）判讀結果：在膜中央有清晰的淡紅色斑點顯示者判為陽性反應；反之，在膜中央有清晰的淡紅色斑點顯示者判為陽性反應；反之，則為陰性反應。斑點呈色的深淺相應地提示陽性強度。則為陰性反應。斑點呈色的深淺相應地提示陽性強度。 斑點金免疫滲濾試驗斑點金免疫滲濾試驗17金免疫分析技術金免疫分析技術 原理和免疫滲透試驗相同。原理和免疫滲透試驗相同。 不同在一個是穿流一個是橫流。不同在一個是穿流一個是橫流。dica原理原理斑點金層析試驗斑點金層析試驗1

12、8金免疫分析技術金免疫分析技術斑點金層析試驗圖示斑點金層析試驗圖示斑點金層析試驗斑點金層析試驗19金免疫分析技術金免疫分析技術digfa 穿流（flow through）dica 橫流（lateral flow）斑點金層析試驗斑點金層析試驗20金免疫分析技術金免疫分析技術雙抗體夾心法雙抗體夾心法測抗原測抗原 間接法間接法測抗體測抗體 競爭法競爭法測抗原測抗原斑點金層析試驗斑點金層析試驗21金免疫分析技術金免疫分析技術c 陰性b 陽性dica-dica-雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原斑點金層析試驗斑點金層析試驗22金免疫分析技術金免疫分析技術dica-間接法測抗體間接法測抗體c 陰性b 陽性斑點金層析試驗斑點金層析試驗23金免疫分析技術金免疫分析技術陰性弱陽性陽性dica競爭法測抗原競爭法測抗原檢測線顏色強度與sd濃度負相關斑點金層析試驗斑點金層析試驗24金免疫分析技術金免疫分析技術檢測檢測hcghcg，afpafp、輪狀病毒、輪狀病毒、a a族鏈球族鏈球菌、衣原