放燒復(fù)合傷小鼠小腸粘膜免疫變化與腸源性感染關(guān)系的研究

1、放燒復(fù)合傷小鼠小腸粘膜免疫變化與腸源性感染關(guān) 系的研究放燒復(fù)合傷小鼠小腸粘膜免疫變化與腸源性感染關(guān)系的研究中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志1999年第1期艾國(guó)平粟永萍劉曉宏王東海王軍平程天民冉新澤摘要 目的：探討放射損傷、燒傷與放燒復(fù)合傷后小鼠小腸粘膜免疫變化 及其用細(xì)胞因子調(diào)控后與腸源性感染的關(guān)系。方法：采用斑點(diǎn)雜交、免疫組化、免疫酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌培養(yǎng)等方法。結(jié)果：三類傷組傷后均出現(xiàn)小腸粘液sIgA含量顯著降低，漿細(xì)胞數(shù)量減少，腸道細(xì)菌移居增多，腸系膜淋巴結(jié) IL-4mRNAfe達(dá)降低，尤以復(fù)合傷組最重。用IL-4蛋白調(diào)控后，三類傷組腸 道漿細(xì)胞的數(shù)量增多，小腸粘液中 sIgA含量相應(yīng)增加，腸道細(xì)菌

2、移居減少。結(jié)論：傷后粘液中sIgA的降低與腸源性感染的發(fā)生密切相關(guān)，其原因與分泌 sIgA的淋巴細(xì)胞數(shù)量減少和功能障礙有關(guān)；而促進(jìn)粘膜免疫功能恢復(fù)，對(duì)減低 腸源性感染發(fā)生較為有利。關(guān)鍵詞：放燒復(fù)合傷小腸粘膜免疫腸源性感染大量研究證實(shí)口2、燒傷后腸上皮機(jī)械屏障和粘膜免疫屏障的損害是腸源 性感染發(fā)生的主要因素。腸上皮細(xì)胞和腸道淋巴細(xì)胞對(duì)輻射高度敏感，在放燒 復(fù)合傷這樣一個(gè)特定的損傷條件下，腸源性感染可能更為突出，而小腸粘膜免 疫變化有什么特點(diǎn)？與腸源性感染的關(guān)系如何？怎樣防治？本實(shí)驗(yàn)為此進(jìn)行了研 究。材料和方法1 .實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種 健康雄性小鼠110只，體重2025g,由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物中心提供。

3、2 .致傷和分組：照射源為6°CoT射線，全身一次均勻照射8gy,吸收劑量 率為56.358.2 cGy/min;燒傷采用3%8周汽油燃燒背部致15%勺出度燒傷(病 理切片證實(shí))；復(fù)合傷則于30分鐘內(nèi)先燒后照射。實(shí)驗(yàn)設(shè)正常、放射、燒傷、 復(fù)合傷等4個(gè)對(duì)照組和放射防治、燒傷防治、復(fù)合傷防治等3個(gè)治療組。每組設(shè)6和72小時(shí)2個(gè)時(shí)相點(diǎn)。治療組6小時(shí)取材者于傷前2、1和當(dāng)天各腹股溝 皮下注射1次白細(xì)胞介素4(IL-4)0.05 ml(6 000U);72小時(shí)取材者傷后連續(xù)給藥3天。正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。每組 6只動(dòng)物。3 .檢測(cè)指標(biāo)：小鼠肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌培養(yǎng)：用LB和麥康凱培養(yǎng)

4、基，37c孵育24小時(shí)，計(jì)數(shù)菌落數(shù)量。小鼠小腸粘液 sIgA測(cè)定：用免疫酶 聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。卷腸切片，IgA免疫組化觀測(cè)：按SP試劑盒說明改進(jìn)后進(jìn) 行，光鏡觀察，計(jì)數(shù)10根絨毛漿細(xì)胞數(shù)，換算出每根絨毛的漿細(xì)胞數(shù)。腸系 膜淋巴結(jié)IL-4的斑點(diǎn)雜交：用地高辛標(biāo)記的約 500 bp IL-4 探針與腸系膜淋巴 結(jié)提取的RNA1點(diǎn)雜交，結(jié)果進(jìn)行薄層掃描分析。4 .統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用哈佛統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行雙因素方差分析及均數(shù)間的顯著性 差異檢驗(yàn)。結(jié)果1 .傷后小鼠肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果傷后6小時(shí)細(xì)菌移居的嚴(yán)重程度依次為：復(fù)合傷組放射損傷組燒傷 組，兩傷復(fù)合后大于單一傷但小于兩單傷之和；以腸系膜淋巴結(jié)細(xì)

5、菌移居數(shù)量 最多，脾臟次之，肝臟最少；用IL-4防治和治療后細(xì)菌的移居率較致傷組明顯 減少。2 .小腸粘液sIgA的變化傷后6小時(shí)，小腸粘液中sIgA的吸光度（A值）均降低，與正常對(duì)照相比， 差異有非常顯著性（P<0.01）；而用IL-4防治后sIgA的A值則明顯升高；但72 小時(shí)與6小時(shí)組問差異無顯著性（見表1）。表1小鼠小腸粘液中sIgA的A值（x ±s）sIgA的A值組別6小時(shí)72小時(shí)正常0.47 ±0.050.46 ±0.03*0.23 ±0.03*0.27 ±0.02燒傷燒+治0.40 ±0.05 "0.47

6、 ±0.03 "放射*0.25 ±0.02*0.28 ±0.0 2放+治0.43 ±0.04 "0.49 ±0.05 "復(fù)合傷0.28 ±0.03*0.26 ±0.05復(fù)+治, 0.49 ±0.030.49 ±0.04 "p<0.01;與正常組比較*P<0.013.小鼠注：n=6; 與相應(yīng)傷情組比較 小腸IgA免疫組化觀測(cè)用IgA單抗可特異顯示，分泌IgA的漿細(xì)胞與IgA起反應(yīng)的漿細(xì)胞主要分 布于小腸固有層和淋巴濾泡中，傷后 6和72小時(shí)，漿細(xì)胞數(shù)量明顯

7、減少（P< 0.01）,以復(fù)合傷組減少程度最為明顯；傷后 72小時(shí)較6小時(shí)稍有增多，但差異 無顯著性；而用IL-4防治和治療后漿細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P<0.05，見表2）。表2小鼠小腸固有層漿細(xì)胞的數(shù)量（個(gè)/每根絨毛）漿細(xì)胞數(shù)量組別6小時(shí)72小時(shí)正常17.6 ±1.616.9 ±2.1燒傷*8.2 ±0.8*9.0 ±0.7燒+治13.4 ±1.1 *515.8 ±1.3*"放射*7.6 ±0.8*9.2 ±0.8放+治* 13.2 ±0.816.0 ±1.2*"復(fù)

8、合傷6.0 ±0.7*7.8 ±1.0復(fù)+治*12.4 ±1.013.6 ±1.1 *"注：n=6; 與相應(yīng)傷情組比較P<0.01 ;與正常組比較*P< 0.05, *P<0.014.傷后腸系膜淋巴結(jié)IL-4基因表達(dá)的變化傷后6和72小時(shí)組與正常對(duì)照比較，腸系膜淋巴結(jié) IL-4mRNA表達(dá)均降低 (P< 0.01) , 72小時(shí)較6小時(shí)表達(dá)增強(qiáng)(P< 0.05),但仍低于正常對(duì)照組(P< 0.01,見表 3)。表3小鼠腸系膜淋巴結(jié)IL-4mRNA的變化(mv/ms)IL-4mRNA組別72小時(shí)6小時(shí)正常29.

9、4 ±1.828.6 ±1.218.6 ±1.18.9 ±0.612.2 ±0.6燒傷10.6 ±0.8放射14.8 ±0.6復(fù)合傷注：n=6;與正常組比較*P< 0.01;與6小時(shí)組比較不< 0.05討論1 .腸粘膜免疫屏障損害與腸源性感染的關(guān)系腸道是一個(gè)有菌的環(huán)境。生理狀況下，腸道菌群微生態(tài)之間、腸粘液層、腸上皮細(xì)胞及細(xì)胞間的緊密連接、上皮下基底膜及腸淋巴組織等共同構(gòu)成腸道特有的抗感染屏障，而不發(fā)生腸源性感染。燒傷早期，腸壁組織血液循環(huán)障礙明顯，腸絨毛細(xì)胞灶性變性壞死，腸固有層中漿細(xì)胞數(shù)量減少，腸粘液中 sI

10、gA含量降低，引發(fā)腸源性感染。腸上皮細(xì)胞及腸道淋巴組織均具有高度輻射敏感性，與單純燒傷比較， 8gy 放射損傷和復(fù)合傷腸上皮細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重，絨毛上皮壞死脫落后造成上皮屏障“缺口”，細(xì)菌易于入侵；加之射線對(duì)淋巴細(xì)胞的直接抑制，腸道淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，相應(yīng)合成分泌IgA 的漿細(xì)胞數(shù)量明顯減少， sIgA 含量降低，腸源性感染加重。2 . 粘膜免疫障礙機(jī)理及調(diào)控本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，放射損傷、燒傷及放燒復(fù)合傷后腸粘液中 sIgA 呈不同程度降低，經(jīng)調(diào)控提高IgA 分泌量后，腸源性感染的發(fā)生率降低，程度減輕，表明腸道粘膜免疫中的sIgA 水平與腸源性感染的發(fā)生密切相關(guān)。體外細(xì)菌粘附實(shí)驗(yàn)3 表明正常小腸粘液有抗大

11、腸桿菌粘附培養(yǎng)的IEC-6( 正常大鼠空腸上皮細(xì)胞株)的作用，而燒傷動(dòng)物腸粘液的這種作用明顯減弱；又將IgA 單抗與正常粘液中和，其作用顯著減弱，說明小腸粘液中 IgA 有抗細(xì)菌粘附腸上皮細(xì)胞的作用。不少研究證實(shí)4， 5 IgA 在抗腫瘤及某些腸道疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此，如何調(diào)控IgA 具有重要理論意義和實(shí)用價(jià)值。IgA由漿細(xì)胞合成分泌，漿細(xì)胞由 B淋巴細(xì)胞分化而來，B淋巴細(xì)胞增殖分 化受TGF-B、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等細(xì)胞因子調(diào)控。其中IL- 4又稱B細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1(BCGF-1)，是目前報(bào)道的唯一能促進(jìn)靜止 B淋巴細(xì) 胞增殖的細(xì)胞因子，同時(shí)還能促

12、進(jìn)特異的重鏈穩(wěn)定區(qū) (CH)Ig 類型的轉(zhuǎn)換，使IgM型B細(xì)胞轉(zhuǎn)換成IgA型B細(xì)胞9、這些體外研究結(jié)果表明IL-4在調(diào)控B 細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化中有重要作用。我們研究觀察到三種損傷后腸系膜淋巴組織中IL-4mRNA的表達(dá)有不同程度降低，以復(fù)合傷最明顯；相應(yīng)地，復(fù)合傷組的漿細(xì)胞數(shù)量減少最顯著，小腸粘液中IgA下降程度最明顯，腸源性感染最嚴(yán)重。對(duì)機(jī)體補(bǔ)充IL-4 ,上述損害明顯減輕。因此，我們強(qiáng)調(diào)對(duì)損傷后調(diào)控IL-4等基因表達(dá)或者補(bǔ)充IL-4等蛋白對(duì)調(diào)控B細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)漿細(xì)胞合成分泌IgA, 對(duì)防治腸源性感染有實(shí)際意義。本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金資助（項(xiàng)目號(hào)：39670289）作者單位：400038重

13、慶，第三軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)系全軍復(fù)合傷研究所 （艾 國(guó)平、粟永萍、劉曉宏、王軍平、程天民、冉新澤 ）；解放軍第二六四醫(yī)院燒傷 科（王東海）參考文獻(xiàn)1馬利，黎鰲，肖光夏，等.腸源性感染的實(shí)驗(yàn)研究.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 1990,12（1）:1-69.2Cappler WA.Reduction in biliary IgA after burn injury. Am Surg, 1992,25(4):338-340.3白曉東，粟永萍，劉賢華.嚴(yán)重?zé)齻竽c粘液成分變化與腸源性感染的 關(guān)系.中華整形燒傷外科雜志、1996, 12: 90-92.4蔡文琴，王伯瀛.實(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué)與核酸分子雜交技術(shù).成都：四

14、川科 學(xué)技術(shù)出版社，1994.258-266.5Brandtzaeg P.The role of humoral mucosal immunity in the induction and maintenance of chronic airway infections. Am J Respir Cirt Care Med, 1995,151:2081-2087.6Herman F,Garret N,Thomas J.Mucosal immunity to HIV-1 systemic and vaginal antibody responses after intranasal immunization with the HIV-1 C4/V3 peptide T1 sP10MN(A).J Immunol, 1996,157:462-472.7Howard M.Identification of a T cell derived B cellgrowth factor distinct from interleukin-2.J Exp Med, 1982,1