矮型雞于正常型雞的miRNA表達(dá)譜分析

1、摘 要在現(xiàn)代社會，肥胖問題已經(jīng)成為全球性的一個(gè)公共健康疾病，引起了人們越來越多的關(guān)注。脂肪的生長涉及多基因表達(dá)、多信號途徑及網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控，過程極其復(fù)雜。microrna（mirna）是一類存在于真核生物體內(nèi)，大小為1825nt的非編碼(non-coding)內(nèi)源性小分子物質(zhì)，在多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、以及脂肪的生成代謝中發(fā)揮重要作用。選用小鼠、大鼠和雞胚等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來研究脂肪的生成機(jī)制，已經(jīng)為解決肥胖問題提供了一些依據(jù)。但是選用矮小型雞與正常型雞來作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對脂肪的生成機(jī)制進(jìn)行研究還未見報(bào)道。為了研究這兩個(gè)品種雞之間脂肪生成的差別，我們選用7周齡的矮小型雞和正常型雞做為

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，運(yùn)用mirna微陣列技術(shù)分析腹脂中mirna的表達(dá)譜,芯片結(jié)果顯示：mir-10b，mir-148a，mir-199-3p，let-7k在矮小型雞中表達(dá)上調(diào)，正常型雞表達(dá)下調(diào)，其中mir-10b達(dá)到極顯著差異(p0.05)；mir-181a-5p，mir-2188在矮小型中表達(dá)下調(diào)，正常型雞表達(dá)上調(diào)，達(dá)到顯著差異（p0.01）。分析與脂肪生成相關(guān)的差異表達(dá)的mirna的功能，能為人類和伴侶動(dòng)物的肥胖癥等能量代謝綜合征尋找新的治療靶標(biāo)以及調(diào)控家畜的脂肪組織發(fā)育從而改善肉質(zhì)提供借鑒和參考。關(guān)鍵詞：雞 mirna 脂肪the analysis of mirna profiles in ab

3、dominal fat of dwarf chicken and normal chickenxia liangcollege of science, south china agricultural university， guangzhou 510642，chinaabstract：in modern society, obesity has become a global public healthy problem, more and more people pay attention to it. the signaling pathway of fat growth involve

4、d in polygene expression, and network control, the process is extremely complex.micrornas (mirnas) are a class of small non-coding rnas (approximately 1825 nucleotides in length), existing in eukaryotic organisms, are involved in the regulatory network of many biological processes and play an import

5、ant role in many processes ,including cell proliferation, cell differentiation, apoptosis, and fat metabolism. study the generation mechanism of fat with mice, rats and chicken embryos has provided some basis to solve the problem of obesity. but choose dwarf chicken and normal chicken as experimenta

6、l animals to study the mechanism of fat formation has not been reported. to investigate the different of fat formation in two types of chicken,we choose 7- week old dwarf chicken and normal chicken as experimental animals. we have adopted mirna microarray technology to analyze the expression profile

7、 of mirna in abdominal fat. the results showed that mir-10b,mir-148a,mir-199-3p,let-7k up-regulated in dwarf chickens, down-regulated in normal chickens, and mir-10b up-regulated extremely significant (p<0.01)；mir-181a-5p，mir-2188 down-regulated in dwarf chickens and up-regulated significant in n

8、ormal chickens(p<0.05). studying the mirnas expressed differently and analyzing their function can provide reference for solve the problems of obesity in human and company animals.key words：chickens mirna fat 目 錄1前言12 材料與方法32.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物.32.2 主要試劑及儀器32.3 樣本的采集32.4 用于microrna 表達(dá)譜分析的樣品總rna制備32.5 芯片檢測43

9、結(jié)果與分析43.1 總rna提取及檢測43.2 mirna 檢測芯片圖53.3 mirna檢出率63.4 矮小型雞與正常型雞腹脂mirna表達(dá)譜73.5 矮小型雞與正常型雞腹脂mirna差異表達(dá)譜.94 討論9參 考 文 獻(xiàn)11致 謝131前言在現(xiàn)代社會，肥胖、型糖尿病問題已經(jīng)成為了一個(gè)公共性的健康疾病，越來越多的引起了人們的關(guān)注。它們的病理過程涉及脂類代謝和脂肪形成，深入理解脂肪形成的分子機(jī)制，對解決這些疾病的防治問題具有重要意義。 一直以來，脂肪組織被認(rèn)為是帶有一些優(yōu)良特性且能儲存能量的惰性組織，例如它可做為絕緣物質(zhì)以及機(jī)械性地支撐更重要的結(jié)構(gòu)。1994年瘦素的發(fā)現(xiàn)，預(yù)示著人們逐漸意識到脂

10、肪細(xì)胞是整個(gè)身體能量平衡的必要調(diào)節(jié)劑。這些細(xì)胞分泌一些蛋白，它們的調(diào)節(jié)過程因體內(nèi)平衡血壓免疫功能血管形成以及能量平衡狀態(tài)的不同而不同(tong, 2001; farmer, 2006; rosen, 2006)。脂肪細(xì)胞來源于多能間充質(zhì)干細(xì)胞。脂肪生成為兩個(gè)階段。第一是定型，這是分化特征出現(xiàn)前確定分化方向的過程，多功能間充質(zhì)干細(xì)胞分化成前體脂肪細(xì)胞，失去了向其他方向細(xì)胞分化的能力，但是在形態(tài)學(xué)上與先前細(xì)胞不能區(qū)分開；第二是終端分化，細(xì)胞具有了成熟脂肪細(xì)胞的特性：脂質(zhì)的轉(zhuǎn)移和合成，對胰島素的敏感性以及脂肪細(xì)胞特殊蛋白的分泌。microrna(mirna)是一類大小約1825nt的內(nèi)源性非編碼小r

11、na分子，具有高度保守性，其本身不具有開放閱讀框(open reading frame, orf)，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列rna，是一種廣泛存在的對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的分子。mirna廣泛存在于真核生物中，其序列和功能在不同物種間非常保守。1993年, lee等（1993）在秀麗新小桿線蟲(caenorhabditis elegan)中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)定時(shí)調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因lin-4。此后,研究者又在線蟲c.elegan中發(fā)現(xiàn)第二個(gè)異時(shí)性開關(guān)基因let-7。2001年10月 science報(bào)道了研究者從線蟲、果蠅和人體克隆的幾十個(gè)類似c.elegan的lin-4 的小rna基因,稱為micr

12、orna（mirna）。隨后多個(gè)研究小組在包括動(dòng)物、果蠅、植物、病毒等多種生物物種中鑒別出上千個(gè)mirnas。從micrornas被發(fā)現(xiàn)至今，人們對micrornas研究的熱情一直劇增。人們發(fā)現(xiàn)micrornas在許多生物過程中都具有調(diào)節(jié)作用，包括調(diào)節(jié)發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化，凋亡以及脂肪細(xì)胞分化。研究表明，mirna不但調(diào)控動(dòng)物脂肪細(xì)胞的分化， 還參與脂類代謝及與脂類代謝相關(guān)的激素內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，有的甚至與肥胖、型糖尿病等脂類代謝病的基本病理相關(guān)（poy m n，2007；takanabe r，2008）。esau c等（2006）研究發(fā)現(xiàn)mir -122直接調(diào)節(jié)體內(nèi)脂類代謝，將mir -122 的

13、反義寡核苷酸投予小鼠可增加肝臟脂肪酸氧化作用，同時(shí)降低脂肪酸合成；刪除mir -14 導(dǎo)致動(dòng)物甘油三酯和甘油二酯水平增加（xu p，2003）；這些研究事實(shí)表明， 通過mirnas 功能的研究，可以加深對脂肪形成和脂類代謝性疾病的病理生理過程的分子機(jī)制了解，并將mirnas 作為這些代謝性疾病治療的潛在靶點(diǎn)。目前，雖然對mirnas 調(diào)節(jié)動(dòng)物脂肪細(xì)胞分化和脂類代謝的了解還不多，但mirnas 自身的調(diào)節(jié)特點(diǎn)及其潛在應(yīng)用價(jià)值，使其必將成為未來幾年該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。并且，mirna作為小調(diào)控rna,研究其對脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用,可以從一個(gè)新的角度了解脂肪組織的生長發(fā)育機(jī)理。本研究以7周齡ghr缺

14、失型矮小型雞為研究對象，以正常型雞為參照，采用微陣列基因芯片技術(shù)檢測矮小型雞（dw-）和正常型雞（normal）腹脂中的mirna表達(dá)情況，分析mirna的表達(dá)譜，找出差異表達(dá)的mirna,為進(jìn)一步篩選出與脂肪生成相關(guān)的mirna,并探討其在脂肪生成過程中的作用機(jī)制提供依據(jù)。2 材料與方法2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來自于南海種禽有限公司。2個(gè)品種均為隱性白羽洛克雞。其中一個(gè)以隱性白羽洛克雞為基礎(chǔ)，通過導(dǎo)入矮小型基因（dw）并經(jīng)多個(gè)世代的選育，形成了遺傳性能穩(wěn)定的矮小型隱性白羽洛克雞，簡稱矮小型雞（dwarf chicken）；另一個(gè)為體型正常的隱性白羽洛克雞，簡稱正常型雞（normal chic

15、ken）。2.2 主要試劑及儀器固相rna酶清除劑購于天根有限公司；北京六一電泳儀dyy-cc型；蘇州sw-cj-1 cu型雙人單面凈化工作臺；2.3 樣本的采集隨機(jī)抽取按常規(guī)飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)至7周齡的矮小型雞和正常型雞各9只，用經(jīng)depc水處理過的器械分離出腹脂，分別裝入凍存管中，迅速置于液氮（-196）中保存；2.4 用于microrna 表達(dá)譜分析的樣品總rna制備矮小型雞與正常型雞腹脂的總rna的抽提按照常規(guī)的trizol提取方法進(jìn)行?？俽na的提取采用invitrogen 公司的trizol reagent 進(jìn)行。所接觸的所有器械都預(yù)先用rna酶固相清除劑進(jìn)行處理。（1）將50100mg

16、組織用液氮研磨成粉末狀后，加入1ml trizol reagent 勻漿，室溫靜置5min，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，4 12000×g 離心10min,收集上清至新的離心管中；（2）rna的分離：加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩混勻，靜置15min至分層明顯，4 12000×g 離心15min，離心后分成3層，上層為無色水層，中間為白色蛋白層，下層為紅色有機(jī)層，rna主要在上層無色水相中；（3）rna的沉淀：小心吸取上清新的ep管中，注意不要將中間層和有機(jī)層吸入管中，加入同等體積冰上預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置1015min，4 12000×g 離心10mi

17、n；（4）rna的洗滌：去上清，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)白色膠狀沉淀。加入1ml 75%現(xiàn)配的冰上預(yù)冷的乙醇，輕輕晃動(dòng)，4 12000×g 離心10min；（一般重復(fù)3次）（5）rna的溶解：棄盡上清，用移液器將剩余液體徹底吸掉，注意不要吸到沉淀。室溫放置510min，至乙醇完全揮發(fā)，即rna沉淀稍稍透明即可，如果過度干燥，會使rna難以溶解。加入適量的depc水，冰上放置35min，幫助rna溶解。（6）rna的保存：提取的rna應(yīng)立即用于下一步實(shí)驗(yàn)或置-80凍存。（7）rna的檢測：采用紫外分光光度計(jì)和變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總rna的濃度和質(zhì)量。2.5 芯片檢測首先將7周齡的矮小型

18、雞和正常型雞的腹脂按序號每3個(gè)樣品等量混合成1個(gè)rna池，每個(gè)品種各有3個(gè)rna池。7周齡的腹脂rna池，正常型雞以nf-1、nf-2、nf-3編號，矮小型雞以df-1、df-2、df-3編號。實(shí)驗(yàn)按2個(gè)品種進(jìn)行設(shè)計(jì)，分別包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。rna樣品采用polya聚合酶擴(kuò)展3末端形成polya尾，把一個(gè)寡核苷酸標(biāo)記連接到polya尾上用于熒光染色。采用特定標(biāo)記的cy5染料進(jìn)行熒光染色。通過微循環(huán)泵在芯片上進(jìn)行雜交，過夜。雜交體系采用100µl 6×sspe的緩沖系統(tǒng)（0.90m nacl，60mm na2hpo4,6mm edta, ph6.8）,含25%甲酰胺，34。雜

19、交后用激光掃描儀（genepix 4000b）收集雜交信號的圖像，并使用array-pro 圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)字化處理?？鄢尘爸?，采用lowess（locally-weighted regression）方法對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理（normalization）（bolstad等，2003）。采用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算出兩組檢測信號的比率、p值和t值。mirna表達(dá)譜檢測由聯(lián)川生物公司（lc sciences）完成。芯片探針依據(jù)mirbase 19.0版（http:/www.sanger.ac.uk/software/rfam/mirna/）列出的mirna進(jìn)行設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)所采用的mirna檢

20、測芯片共包含789個(gè)探針。3 結(jié)果與分析3.1 總rna提取及檢測腹脂總rna提取后，各取rna樣品1µl進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，約15min后于紫外檢測儀上進(jìn)行觀察并拍照。如圖1-1，圖1-2所示，rna樣品的28s、18s條帶清晰，上樣孔中無殘留。應(yīng)用分光光度計(jì)進(jìn)一步測定rna樣品的純度，結(jié)果顯示a260與a280比值均在1.9以上，表明rna樣品質(zhì)量完全符合芯片分析要求（表1-1）。圖1-1 正常型雞腹脂總rna檢測結(jié)果fig.1-1 the detection results of total rna in normal chicken圖1-2 矮小型雞腹脂總rna檢測結(jié)果f

21、ig.1-1 the detection results of total rna in dwarf chicken表1-1 正常型雞與矮小型雞總rna檢測結(jié)果table 1-1 the detection results of total rna樣品編號a260/280a260/230濃度（µg/µl）總量（µg）樣品質(zhì)量描述sample no.concentrationtotal quantitydescription of qualitynf-11.972.090.5704.43rna完好nf-21.912.070.3404.14rna完好nf-31.922

22、.040.3504.16rna完好df-11.962.020.3204.05rna完好df-21.932.020.2304.55rna完好df-31.951.940.2403.85rna完好3.2 mirna 檢測芯片圖對矮小型雞和正常型雞7周齡的腹脂mirna表達(dá)譜進(jìn)行芯片分析。部分mirna檢測芯片圖見圖1-2。 圖1-2 mirna檢測芯片圖fig.1-2 the detection results of mirna chip3.3 mirna檢出率本實(shí)驗(yàn)所采用的mirna檢測芯片共包含789個(gè)探針。矮小型雞和正常型雞7周齡腹脂中mirna的檢出率見表1-2。表1-2 矮小型雞和正常型雞

23、腹脂中mirna檢出率 table 1-2 mirna detection rates in abdominal fat of dwarf and normal chickens組織類型histological types品種variety檢出率 detection rate探針數(shù)probessignal3232signal512signal5127周齡腹脂矮小型雞564（71.5%）151（19.1%）74(9.4%)789正常型雞554（70.2%）144（18.3%）91(11.5%)789從檢測結(jié)果來看，以檢出信號值32為標(biāo)準(zhǔn)，7周齡腹脂中，矮小型雞檢測出mirna共225個(gè)，檢出率為

24、28.5%；正常型雞檢測出mirna共235個(gè)，檢出率為29.8%。3.4 矮小型雞與正常型雞腹脂mirna表達(dá)譜圖1-3 矮小型雞和正常型雞7周齡腹脂mirna表達(dá)譜（signal2000）fig.1-3 mirna expression profiles of abdominal fat of 7-week-old dwarf and normal chickens(signal2000) 3.5 矮小型雞與正常型雞腹脂mirna差異表達(dá)譜圖1-3 矮小型雞和正常型雞7周齡腹脂mirna表達(dá)譜（512signal2000）fig.1-3 mirna expression profiles

25、of abdominal fat of 7-week-old dwarf and normal chickens(512signal2000） 通過比較我們發(fā)現(xiàn)，矮小型雞和正常型雞腹脂mirna表達(dá)譜非常接近，只有少數(shù)mirna在不同品種之間存在顯著差異，表現(xiàn)出物種內(nèi)的保守性（表1-3）。其中mir-10b，mir-148a，mir-199-3p，let-7k在矮小型雞中表達(dá)上調(diào)，正常型雞表達(dá)下調(diào)，其中mir-10b達(dá)到極顯著差異(p0.05)；mir-181a-5p，mir-2188在矮小型中表達(dá)下調(diào)，正常型雞表達(dá)上調(diào)，達(dá)到顯著差異（p0.01）。表1-3 矮小型雞與正常型雞腹脂mirna差

26、異表達(dá)譜table 1-3 differential mirna expression profiles of abdominal fats in dwarf and normal chickens組織類型histological typesmirna矮小型雞dwarf chicken正常型雞normal chickenfold changesp-value腹脂mir-10b479±59181±281.963.50e-03mir-181a-5p2180±2603151±3120.282.62e-02mir-148a2584±3571574

27、77;2730.503.01e-02mir-199-3p4615±6953274±2980.244.43e-02mir-2188387±122743±1500.884.66e-02let-7k656±124334±780.943.36e-02注：fold change 指正常型雞與矮小型雞腹脂中mirna表達(dá)量的比值。4 討論 近年來，肥胖、ii型糖尿病等已成為嚴(yán)重危害人類健康的代謝性疾病，它們的病理過程涉及脂類代謝和脂肪形成，因此深入了解脂肪形成的分子機(jī)制，對解決這些疾病的防治具有重要意義。microrna是一類存在于真核生物體內(nèi)，

28、大小為1825nt的非編碼內(nèi)源性的小分子物質(zhì)。廣泛存在于病毒、動(dòng)物和植物等許多生物的基因組中，其編碼基因大多與已知的蛋白編碼或非編碼基因重疊，且多以基因簇形式位于小于310 kb的間隔區(qū)內(nèi)，與其宿主基因的mrna一起表達(dá)。mirna在不同物種、不同組織中具有高度保守性，具有時(shí)間性、空間性和組織特異性，如mirna-1、mirna-206等與心臟和骨骼肌特異性mirna(mccarthy j j et al ，2007；sokol n s et al，2005)，mirna-143為脂肪特異性mirna（trakooljul n et al，2010）， mirna-375在胰臟特異性表達(dá)（kl

29、oosterman w p et al，2007）自1993年lee等在秀麗新小桿線蟲（c.elegans）中意外發(fā)現(xiàn)一種定時(shí)調(diào)控胚胎后期發(fā)育的首個(gè)mirna-lin4以來，越來越多的mirna被發(fā)現(xiàn)。目前，基于計(jì)算機(jī)基礎(chǔ)的生物信息學(xué)預(yù)測估計(jì)，mirna約占整個(gè)基因組基因的2%3%，調(diào)控約1/3的mrna，mirna的這一作用使之成為生命科學(xué)界現(xiàn)研究的熱點(diǎn)。microrna是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，主要作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，主要采用降解靶mrna和抑制靶mrna的翻譯兩種作用方式調(diào)控基因的表達(dá)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，mirna在動(dòng)植物的發(fā)育、細(xì)胞生長分化和凋亡、脂肪代謝等生命活動(dòng)過程中發(fā)揮

30、重要的調(diào)控作用。例如在腫瘤發(fā)生機(jī)制方面，mirna可能是潛在的癌基因或者抑癌基因，并且由于mirna是作為基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯過程中的調(diào)節(jié)分子，在腫瘤的發(fā)生過程中起到一個(gè)調(diào)控的樞紐作用，已經(jīng)有專家預(yù)測，把mirna作為腫瘤生物治療的靶分子將比編碼基因作為靶分子更加有效（chen c z et al，2005）。并且，目前實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)mirna與多種人類疾病有關(guān)，包括多種癌癥，艾滋病，冠心病等，因此mirna已成為相關(guān)疾病治療的新的靶位點(diǎn)（trovatom et al，2004）。而且mirna將成為疾病診斷、預(yù)防和治療的重要工具 (firea, xu set al，1998)。目前，已有很多種

31、方法用于研究檢測mirna的表達(dá)，但原理上分為兩類:一種是探針雜交方法，包括northern blot，microrna芯片，基于微球雜交的檢測方法，鎖定核苷酸的原位雜交（lna-ish）等；另一種是擴(kuò)增技術(shù)的檢測方法，為基于pcr的檢測方法。其中，microrna芯片技術(shù)采用大規(guī)模微陣列技術(shù)，在一片芯片上同時(shí)固定多個(gè)與mirna序列互補(bǔ)的探針，然后加入經(jīng)過標(biāo)記的樣本rna，雜交后進(jìn)行信號檢測，可以一次性對大量的生物分子進(jìn)行檢測分析，大大提高了篩選的速度和通量，是目前檢測整個(gè)基因組內(nèi)mirna表達(dá)及調(diào)控水平變化最有效的方法。因此，通過基因芯片技術(shù)檢測7周齡的矮小型雞與正常型雞肝臟和腹脂中差異表

32、達(dá)的mirna, 可能會為肥胖癥的生物治療提供依據(jù)。microrna的發(fā)現(xiàn)豐富了人們對蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)控的認(rèn)識，有助于在rna水平對靶mrna分子進(jìn)行更迅速和有效的調(diào)節(jié)。 參 考 文 獻(xiàn)chen c z. micrornas as oncogenes and tumor suppressors. n engl j med, 2005, 353 (17): 1768 1771esau c,davis s, murray s f,et al . mir -122 re gulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targetin

33、g j . cell met ab,2006,3(2) : 87 -98farmer sr. transcriptional control of adipocyte formation j. cell metab, 2006, 4(4): 263-273.firea, xu s, montgomery m k, et al.potent and specific genetic interference by double-stranded rna in caenorhabditis elegansj.natrue,1998; 391(6669): 744-5)lee rc, feinbau

34、mrl, ambros v. the c. elegans heterochronic genelin24encodes small rnaswithantisensecomplementaritytolin214j. cell ,1993, 75(5) :8432854mccarthy j j,esser k a,andrade f h. microrna-206 is overexpressed in the diaphragm but not the hindlimb muscle of mdx mousej. am j physiol cell physiol ,2007,293（1）：c451-457poy m n,spranger m,stoffel m. micrornas and the regulation of glucose and lipid metabolism j . diabetes obes metab,2007,9( 2) : 67 - 73rosen ed, macdougald oa. adipocyte differentiation from the inside outj. nat rev mol cell biol, 2006, 7(12): 885-896.sokol n s, ambro