引物設(shè)計實例分析DJ

1、引物設(shè)計基本原則 引物長度（primer length） 產(chǎn)物長度（product length） 序列tm值 (melting temperature) g+c含量（composition） 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu) （duplex formation and hairpin） 閱讀框1. 引物的長度 一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，即taq酶的最適溫度2.產(chǎn)物的長度 擴(kuò)增片段長度為100600堿基對.3. tm值 引物的tm值一般控制在55-60度, 盡可能保證上下游引物的tm值一致,一般不超過2度. 如果引物中的g+c含量相對偏

2、低,則可以使引物長度稍長,而保證一定的退火溫度. tm=2(a+t)+4(c+g)4. 引物的gc含量 有效引物中(g+c)的比例為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的gc含量不能相差太大。5.堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布 引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應(yīng)超過3個連續(xù)的g或c，因這樣會使引物在g+c富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。 6. 引物自身 引物間3端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致pcr反應(yīng)失敗 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿

3、基不能大于3bp。7. 引物之間 兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。8.引物的3端 引物的延伸是從3端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能， 9.引物的5端 引物的5端限定著pcr產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5端修飾包括：加酶切位點；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合dna序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。 10.密碼子的簡并 如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生

4、簡并，會影響擴(kuò)增特異性與效率。11.引物的特異性 引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補(bǔ)堿基同源。 任務(wù)任務(wù)設(shè)計設(shè)計dj-1蛋白表達(dá)引物蛋白表達(dá)引物plasmid 1:plasmid 2第一步：檢索第一步：檢索dj-1mrna基本序列基本序列l(wèi)ocus nm_057143 1097 bp mrna linear rod 1 gtgccgagca cagttactgg aaggcttaac caaagttttg atgcctggga accgcgcagg61 aaaaacacgc ggaacgtgct tcacagtggc ggctaactgc tctcgttcgc tgtg

5、cagagc121 cgtctggcag ggttgacctc ctaaagggat attccatctt tattaatcat tagtagtgtg181 gtcagagact tagcaccatt ggtctccccc aacctggtcc agacatttca gcagtttatc241 ggaacagcaa caacagcaac aaaaccttca aaatttacaa gtctttaaga aatagaaatg301 gcatccaaaa gagctctggt catcctagcc aaaggagcag aggagatgga gacagtgatt361 cctgtggaca tca

6、tgcggcg agctgggatt aaagtcaccg ttgcaggctt ggctgggaag421 gaccccgtgc agtgtagccg tgatgtagtg atttgtccgg ataccagtct ggaagaagca481 aaaacacagg gaccatacga tgtggttgtt cttccaggag gaaatctggg tgcacagaac541 ttatctgagt cggctttggt gaaggagatc ctcaaggagc aggagaacag gaagggcctc 601 atagctgcca tctgtgcggg tcctacggcc ctgc

7、tggctc acgaagtagg ctttggatgc 661 aaggttacat cgcacccatt ggctaaggac aaaatgatga acggcagtca ctacagctac 721 tcagagagcc gtgtggagaa ggacggcctc atcctcacca gccgtgggcc tgggaccagc 781 ttcgagtttg cgctggccat tgtggaggca ctcagtggca aggacatggc taaccaagtg 841 aaggccccgc ttgttctcaa agactagaga gcccaagccc tggaccctgg ac

8、ccccaggc 901 tgagcaggca ttggaagccc actagtgtgt ccacagccca gtgaacctgg cattggaagc 961 ccactagtgt gtccacagcc cagtgaacct caggaactaa cgtgtgaagt agcccgctgc 1021 tcaggaatct cgccctggct ctgtactatt ctgagccttg ctagtagaat aaacagttcc 1081 ccaagctcct gacggct 第二步：利用primer premier 5設(shè)計引物primer1: 5 atggcatccaaaagag .p

9、rimer2: 5 tctagtctttgagaaca . primer premier5.0是由加拿大的premier公司開發(fā)的專業(yè)用于pcr或測序引物以及雜交探針的設(shè)計、評估的軟件，其主要界面分為序列編輯窗口（genetank），引物設(shè)計窗口（primer design），酶切分析窗口（restriction sites）和紋基分析窗口（motif），這里我們主要介紹其引物設(shè)計功能 。 打開程序首先進(jìn)入的是序列編輯參看這是根據(jù)模板序列尋找引物的界面，在該界面中可以設(shè)定所要搜索的引物的類型，包括pcr引物，測序引物和雜交探針以及引物所在的鏈；另外也能設(shè)定搜索引物的范圍，以及最終pcr產(chǎn)物的長

10、度和引物的長度等。 automatic search 自動搜索在結(jié)果窗口中給出了程序給該對引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和長度以及產(chǎn)物的長度。通過直接點擊各對引物在相應(yīng)引物搜尋界面中相應(yīng)的顯示引物的各種信息。包括其各種參數(shù)和各種可能存在的不利結(jié)構(gòu)。 primer premier能即時分析引物二級結(jié)構(gòu)。在左下的兩排按鈕可以顯示發(fā)現(xiàn)了何種二級結(jié)構(gòu)，也顯示二級結(jié)構(gòu)的自由能數(shù)值g 單位kcal/mol。 edit primer 引物編輯窗口可以用來設(shè)計用于定點突變的引物或分析一條已有引物序列?？梢允褂胏trl-x ctrl-c和ctrl-v快捷鍵來實施剪切拷貝和粘貼刪除當(dāng)前引物序列,

11、并從剪貼板上粘貼是分析一條已有引物的好方法。進(jìn)行粘貼時paste 粘貼窗口會激活，用以將引物序列轉(zhuǎn)化為反向互補(bǔ)或反向互補(bǔ)形式，也可以手工鍵入引物序列。一旦引物被編輯發(fā)點擊analyze 按鈕即可分析編輯后的引物。 引物長度 引物的長度控制著引物的特異性和在pcr反應(yīng)中的退火溫度.對越多數(shù)實驗適宜引物長度為18到24個堿基,等于或少于15堿基的短引物有時用于簡單的基因作圖或特殊的文庫構(gòu)建library protocol ,28到35堿基的長引物對于從一系列高度相關(guān)的分子中擴(kuò)增序列和特殊樣本的克隆能起到重要作用。長pcr引物能給擴(kuò)增帶來更好的特異性,長引物也允許通過降低退火溫度來能提高反應(yīng)的靈敏度

12、,不過長引物通常更易于形成包括發(fā)卡結(jié)構(gòu)二聚體自身互補(bǔ)等二級結(jié)構(gòu)。 理論上在合適的融鏈溫度范圍內(nèi)最短的引物能在特異性和高效性間獲得較好的平衡。 為設(shè)計一條高效引物有幾個參數(shù)必須考慮primer premier搜索所考慮的參數(shù)依次如下 tm 融鏈溫度：primer premier根據(jù)相鄰二堿基對作用理論nearest neighbor theory 來計算融鏈溫度。pcr反應(yīng)的合適tm范圍為56到63c。 gc% gc含量：對于pcr反應(yīng)來說gc含量在50%左右比較合適而對于測序引物和雜交探針來說gc含量至少應(yīng)為50%。 degeneracy 多義性：當(dāng)設(shè)計多義引物時應(yīng)盡量減少引物多義性這樣會帶來

13、更好的特異性應(yīng)盡量避免3末端的多義性因為這里即使一個堿基的錯配都能阻止引物延伸。 3 end stability 3 末端穩(wěn)定性：引物穩(wěn)定性影響它的錯配效率。一條理想的引物應(yīng)該有一個穩(wěn)定性較強(qiáng)的5 末端和相對穩(wěn)定性較弱的3 末端，如果引物3 穩(wěn)定性強(qiáng)有可能在即使5 末端不配對的情況下造成錯配形成非特異性擴(kuò)secondary bands。 而3 末端穩(wěn)定性低的引物較好的原因是在引物發(fā)生錯配時由于3 末端不太穩(wěn)定引物結(jié)合不穩(wěn)定而難以延伸。 gc clamp gc鉗：引物與目的位點的有效結(jié)合需要有穩(wěn)定的5 末端，這一段有較強(qiáng)穩(wěn)定性的5 末端稱為gc鉗。它保證引物與模板的穩(wěn)定結(jié)合。 secondary

14、 structures 二級結(jié)構(gòu) 二級結(jié)構(gòu)是引物設(shè)計中必須考慮的一個重要因素二級結(jié)構(gòu)能顯著影響反應(yīng)中能與模板正確結(jié)合的引物數(shù)量。發(fā)卡結(jié)構(gòu)的存在能限制引物與目的位點的結(jié)合能力，從而降低擴(kuò)增效率。形成發(fā)卡環(huán)的引物則不能在pcr擴(kuò)增中發(fā)揮作用。 hairpin 發(fā)卡結(jié)構(gòu) 發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是由于引物自身的互補(bǔ)堿基分子內(nèi)配對造成,引物折疊形成的二級結(jié)構(gòu)，并由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是分子內(nèi)的反應(yīng),僅僅需要三個連續(xù)堿基配對.發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可以用自由能衡量,自由能大小取決于堿基配對釋放的能量以及折疊dna形成發(fā)卡環(huán)所需要的能量,如果自由能值大于0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,從而不會干擾反應(yīng).如果自由能值小于0 則該結(jié)構(gòu)可以干

15、擾反應(yīng)。按下按鈕all 可以顯示其具體結(jié)構(gòu)。 dimer 二聚體 引物之間的配對區(qū)域能形成引物二聚體，它是相同或不同的兩條引物之間形成的二級結(jié)構(gòu)。它造成引物二聚體擴(kuò)增并減少目的擴(kuò)增，產(chǎn)物二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向引物之間形成，如果配對區(qū)域在3 末端問題會更為嚴(yán)重，3 末端配對很容易引起引物二聚體擴(kuò)增使用dimer report功能可以預(yù)測二聚體的形成。 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過4.5 ，二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的能值越高越穩(wěn)定，越不符合要求。 false priming 錯配 如果引物可以結(jié)合除目的位點外的其他區(qū)域擴(kuò)增效率將明顯降低，目的產(chǎn)物帶將減少或出現(xiàn)涂布（smear

16、 ），primer premier會檢查每一條引物是否會與整個序列的其他位點形成局部的錯配，3 末端連續(xù)幾個堿基配對形成錯配的傾向要高于引物上游區(qū)域同樣數(shù)量的堿基配對?？梢苑謩e設(shè)定確認(rèn)為錯配的3 末端或引物全長形成連續(xù)堿基配對的數(shù)量。 pair rating 匹配度評分 匹配度低的引物對常常不太有效，是因為在同樣退火溫度下，tm低的引物決定擴(kuò)增的特異性，而tm高的引物更易于形成非特異性結(jié)合而造成錯誤的起始。primer premier會計算每一對引物的匹配度100分為滿分并按照分?jǐn)?shù)按降序排列計。pair rating formula for determining single primer

17、rating rating = 100 - (g (dimer)1.7 +g (hairpin) )1.4 +g (false priming)1.5) formula for determining primer pair rating rating = average of sense and anti-sense primer rating - (tm difference between primers) * 1.7) - (dg cross dimer) * 1.3)第三步：酶切位點primer1: 5 atggcatccaaaagag （gc:60%,tm：64）primer2:

18、5 tctagtctttgagaaca （gc:57%,tm：66）ecor i : gaattc primer1: 5 gaattc atggcatccaaaagag primer2: 5 ggtacc tctagtctttgagaaca kpn i： ggtacc 第四步 保護(hù)堿基primer1: 5 ccggaattcatggcatccaaaagagprimer2: 5 cgg ggtacc tctagtctttgagaacahttp:/ blast驗證引物驗證引物進(jìn)入網(wǎng)頁：/blast/點擊basic blast中的nucleotid

19、e blast選項在enter query sequence欄中輸入引物序列： 注：文獻(xiàn)報道abcg2的引物為5-ctgagatcctgagcctttgg-3;5-tgcccatcacaacatcatct-3簡便的做法是同時輸入上下游引物。輸入上下游引物系列都從5 3。 輸入上游引物后，加上20個字母n，再輸入下游引物，如下圖：在choose search set欄中： database根據(jù)預(yù)操作基因的種屬定了，本引物可選human genomic + transcript或others (nr etc.)。 在program selection中：選擇somewhat similar sequences (blastn)項，如下圖： 在此界面最下面關(guān)鍵要點擊algorithm para