受體配體簡(jiǎn)基礎(chǔ)教學(xué)

1、第八節(jié)第八節(jié)受體的放射性配體結(jié)合分析受體的放射性配體結(jié)合分析（radioligand binding assay of receptors, rba） 岳岳 凌凌1教學(xué)資料一、總一、總 論論 受體受體（receptor，r） 細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)能識(shí)別生物活性物質(zhì)并與細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)能識(shí)別生物活性物質(zhì)并與之結(jié)合，進(jìn)而引起生物學(xué)效應(yīng)的生物大分子。之結(jié)合，進(jìn)而引起生物學(xué)效應(yīng)的生物大分子。 2教學(xué)資料 配體配體（ligand，l） 能與受體特異性結(jié)合的生物活性分子。能與受體特異性結(jié)合的生物活性分子。 配體配體 內(nèi)源性配體內(nèi)源性配體外源性配體外源性配體3教學(xué)資料 rba 原理是基于放射性核素標(biāo)記的配體與特

2、異受體的理化結(jié)原理是基于放射性核素標(biāo)記的配體與特異受體的理化結(jié)合反應(yīng)。合反應(yīng)。 應(yīng)用放射性標(biāo)記配體和組織、細(xì)胞或含有受體的制劑一應(yīng)用放射性標(biāo)記配體和組織、細(xì)胞或含有受體的制劑一起溫育，使受體和配體充分結(jié)合，形成受體起溫育，使受體和配體充分結(jié)合，形成受體-配體復(fù)合物，配體復(fù)合物，終止反應(yīng)后，用過濾或離心的方法除去未被結(jié)合的標(biāo)記終止反應(yīng)后，用過濾或離心的方法除去未被結(jié)合的標(biāo)記物，測(cè)定受體物，測(cè)定受體-配體復(fù)合物的放射性，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理，可配體復(fù)合物的放射性，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理，可求得受體對(duì)配體的親和力和受體的最大結(jié)合容量。求得受體對(duì)配體的親和力和受體的最大結(jié)合容量。 4教學(xué)資料 rba的分類的分類 定量定

3、量rba 可以測(cè)定靶組織或靶細(xì)胞中能與配體結(jié)合的受體可以測(cè)定靶組織或靶細(xì)胞中能與配體結(jié)合的受體數(shù)（以結(jié)合位點(diǎn)數(shù)表示）及研究受體的親和力（常數(shù)（以結(jié)合位點(diǎn)數(shù)表示）及研究受體的親和力（常以平衡解離常數(shù)表示）。以平衡解離常數(shù)表示）。 定性定性rba 發(fā)現(xiàn)和確定新的受體和受體亞型，及在分子水平研發(fā)現(xiàn)和確定新的受體和受體亞型，及在分子水平研 究受體究受體-配體的相互作用等。配體的相互作用等。 5教學(xué)資料 rba的應(yīng)用的應(yīng)用 神經(jīng)遞質(zhì)神經(jīng)遞質(zhì) 激素和藥物等的作用機(jī)制激素和藥物等的作用機(jī)制 疾病的病因和發(fā)病機(jī)制疾病的病因和發(fā)病機(jī)制 新藥設(shè)計(jì)和藥物篩選新藥設(shè)計(jì)和藥物篩選 受體顯像與受體介導(dǎo)治療受體顯像與受體介

4、導(dǎo)治療 6教學(xué)資料二、概二、概 述述1. 受體的分類受體的分類 類(class) 膜受體 核受體 亞類（subclass） 型 (type) 亞型 (subtype) 7教學(xué)資料2. 受體與配體結(jié)合的基本特點(diǎn)受體與配體結(jié)合的基本特點(diǎn)1）可飽和性）可飽和性(saturability) 2）特異性）特異性(specificity) 3）適度的親和力（）適度的親和力（affinity） 4）可逆性）可逆性(reversibility) 5）識(shí)別能力）識(shí)別能力(recognition)和生物效應(yīng)的一致性和生物效應(yīng)的一致性8教學(xué)資料受體與配體特異性結(jié)合的特點(diǎn)：受體與配體特異性結(jié)合的特點(diǎn)：親和力高，結(jié)合容

5、量小。親和力高，結(jié)合容量小。親和力：受體與配體的結(jié)合能力。親和力：受體與配體的結(jié)合能力。平衡解離常數(shù)（平衡解離常數(shù)（equilibrium dissociation constant，kd） 指占據(jù)半數(shù)受體所需的配體濃度。指占據(jù)半數(shù)受體所需的配體濃度。 kd值愈小，表明親和力愈高；值愈小，表明親和力愈高；kd值愈大，親和力愈低。值愈大，親和力愈低。9教學(xué)資料三、單位點(diǎn)系統(tǒng)三、單位點(diǎn)系統(tǒng)rba的基本規(guī)律的基本規(guī)律（一）簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)受體和配體結(jié)合反應(yīng)的基本規(guī)律一）簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)受體和配體結(jié)合反應(yīng)的基本規(guī)律 1. 質(zhì)量作用定律質(zhì)量作用定律 k1,v1 r + l rl k2,v2 根據(jù)質(zhì)量作用定律

6、根據(jù)質(zhì)量作用定律： v1 = k1 r l v2 = k2 rl 10教學(xué)資料 當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡后，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡后， v1 = v2 即：即： k1 rl = k2 rl 則平衡解離常數(shù)（則平衡解離常數(shù)（kd）的數(shù)學(xué)表達(dá)式（）的數(shù)學(xué)表達(dá)式（1.1）為）為： kd k2 rl k1 rl11教學(xué)資料2. 飽和曲線飽和曲線(saturation curve)1）飽和曲線）飽和曲線 當(dāng)配體的濃度從零開始上升時(shí)，形成的復(fù)合物也逐漸當(dāng)配體的濃度從零開始上升時(shí)，形成的復(fù)合物也逐漸增多。但由于受體數(shù)量有限，又是可逆反應(yīng)，因此增多。但由于受體數(shù)量有限，又是可逆反應(yīng)，因此rl的的增加不是直線上升，而是一條上升先

7、快后慢的曲線，最后增加不是直線上升，而是一條上升先快后慢的曲線，最后絕大部分受體與配體結(jié)合時(shí)，絕大部分受體與配體結(jié)合時(shí)，rl的增加就非常緩慢，漸的增加就非常緩慢，漸趨水平，即受體已經(jīng)飽和了，此即飽和曲線趨水平，即受體已經(jīng)飽和了，此即飽和曲線 。12教學(xué)資料2）設(shè)設(shè)lt為配體的初始濃度，為配體的初始濃度，rt為受體的為受體的 初始濃度，則有：初始濃度，則有： l = lt rl r = rt rl 將上式代入將上式代入(1.1)式，經(jīng)整理得式，經(jīng)整理得： rl2-rlrt+lt+kd+rtlt=0 13教學(xué)資料 飽和曲線的形狀和飽和曲線的形狀和kd有關(guān)（如圖有關(guān)（如圖1）。圖圖1 kd對(duì)飽和曲線

8、的影響對(duì)飽和曲線的影響 14教學(xué)資料飽和曲線曲線的高度取決于飽和曲線曲線的高度取決于rt（如圖（如圖2）。）。 圖圖2 rt對(duì)飽和曲線影響對(duì)飽和曲線影響15教學(xué)資料3. scatchard作圖作圖由式（由式（1.1）整理可得）整理可得： kd rt-rll rl 將上式整理可得將上式整理可得： rl = rt 1_ rl l kd kd 16教學(xué)資料 以復(fù)合物濃度以復(fù)合物濃度rl為橫坐標(biāo)，以復(fù)合物濃度和游為橫坐標(biāo)，以復(fù)合物濃度和游離配體的濃度比值離配體的濃度比值rl/l為縱坐標(biāo)作圖，即為為縱坐標(biāo)作圖，即為scatchard作圖。作圖。 簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)scatchard作圖為一條直

9、線，斜作圖為一條直線，斜率為率為 -（1/kd），橫軸截距為），橫軸截距為rt，縱軸截距為，縱軸截距為rt/ kd（見圖（見圖3）。）。17教學(xué)資料圖圖3 簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)rba的的scatchard作圖作圖18教學(xué)資料（二）非特異性結(jié)合（二）非特異性結(jié)合(non-specific binding，nsb)nsb 在在rba系統(tǒng)中，放射性配體除與受體特異性結(jié)合外，還系統(tǒng)中，放射性配體除與受體特異性結(jié)合外，還可與其他成分（如非特異蛋白、反應(yīng)容器、分離材料等）可與其他成分（如非特異蛋白、反應(yīng)容器、分離材料等）結(jié)合。結(jié)合。nsb的特點(diǎn)的特點(diǎn) 親和力小而結(jié)合容量大，不易被飽和，隨反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)

10、配親和力小而結(jié)合容量大，不易被飽和，隨反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)配體濃度增加而線性增大，而且這種結(jié)合與生物效應(yīng)無(wú)關(guān)（見體濃度增加而線性增大，而且這種結(jié)合與生物效應(yīng)無(wú)關(guān)（見圖圖4）。）。19教學(xué)資料圖圖4 飽和曲線實(shí)驗(yàn)中飽和曲線實(shí)驗(yàn)中tb、sb和和nsb的關(guān)系的關(guān)系20教學(xué)資料在在rba的數(shù)據(jù)處理時(shí)，測(cè)得的總結(jié)合的放射性的數(shù)據(jù)處理時(shí)，測(cè)得的總結(jié)合的放射性(total binding，tb)，必須減去，必須減去nsb，才能得到特，才能得到特異性結(jié)合異性結(jié)合(specific binding，sb)的數(shù)據(jù)。的數(shù)據(jù)。21教學(xué)資料四、四、rba的基本方法的基本方法 離體離體rba的基本方法可概述如下：的基本方法可概述如

11、下： 1. 制備待測(cè)受體的離體標(biāo)本（組織切片、細(xì)胞懸液、細(xì)胞制備待測(cè)受體的離體標(biāo)本（組織切片、細(xì)胞懸液、細(xì)胞組分的分離制備等）組分的分離制備等） 2. 加樣（標(biāo)本、放射性標(biāo)記配基、緩沖液、非標(biāo)記配基等）加樣（標(biāo)本、放射性標(biāo)記配基、緩沖液、非標(biāo)記配基等） 3. 溫育溫育 4. 分離結(jié)合和游離的放射性標(biāo)記配體分離結(jié)合和游離的放射性標(biāo)記配體 5. 測(cè)定結(jié)合部分的放射性測(cè)定結(jié)合部分的放射性 6. 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理22教學(xué)資料 標(biāo)記配體的基本要求標(biāo)記配體的基本要求 1）高比活度）高比活度 2）親和力高）親和力高 3）特異性強(qiáng)）特異性強(qiáng) 4）放射化學(xué)純度高）放射化學(xué)純度高23教學(xué)資料五、定量五、定量rba

12、的數(shù)據(jù)處理的數(shù)據(jù)處理定量定量rba主要是通過已知標(biāo)記配體的量主要是通過已知標(biāo)記配體的量和比活度，以及測(cè)得的樣本的數(shù)據(jù)，應(yīng)和比活度，以及測(cè)得的樣本的數(shù)據(jù)，應(yīng)用數(shù)學(xué)模型求出受體的有關(guān)參數(shù)如受體用數(shù)學(xué)模型求出受體的有關(guān)參數(shù)如受體密度密度rt、kd等。等。24教學(xué)資料1. 單點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)處理單點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)處理通常是計(jì)算飽和區(qū)的受體密度，即受體最大結(jié)合容量通常是計(jì)算飽和區(qū)的受體密度，即受體最大結(jié)合容量（maximum binding capacity，rmax）。）。受體密度的表示方式有以下幾種：受體密度的表示方式有以下幾種： 胞漿胞膜等的受體含量：胞漿胞膜等的受體含量：fmol/mg蛋白；蛋白；

13、胞核的受體含量：胞核的受體含量：fmol/mgdna； 完整細(xì)胞受體的含量：結(jié)合位點(diǎn)完整細(xì)胞受體的含量：結(jié)合位點(diǎn)/cell（site/cell）或）或 fmol/106細(xì)胞。細(xì)胞。25教學(xué)資料單點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)只適用于簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)，其計(jì)算公式單點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)只適用于簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)，其計(jì)算公式如下：如下： rt = _rl的cpm_ 探測(cè)效率（）配體比活度標(biāo)本的蛋白量（dna量）或細(xì)胞數(shù)26教學(xué)資料2. 簡(jiǎn)單單位點(diǎn)簡(jiǎn)單單位點(diǎn)rba的多點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)的多點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)多點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)可分為簡(jiǎn)單單位點(diǎn)和雙位點(diǎn)多點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)可分為簡(jiǎn)單單位點(diǎn)和雙位點(diǎn)(多位點(diǎn)多位點(diǎn))兩方面，它們又可各自分為飽和曲線實(shí)驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)兩方面，它們又可各自分為飽和曲

14、線實(shí)驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)兩類。結(jié)合實(shí)驗(yàn)兩類。 27教學(xué)資料簡(jiǎn)單單位點(diǎn)飽和曲線的數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)單單位點(diǎn)飽和曲線的數(shù)據(jù)處理1. scatchard模型模型 以復(fù)合物濃度以復(fù)合物濃度rl為橫坐標(biāo)，以復(fù)合物濃度和游為橫坐標(biāo)，以復(fù)合物濃度和游離配體的濃度比值離配體的濃度比值rl/l為縱坐標(biāo)作圖，實(shí)際應(yīng)為縱坐標(biāo)作圖，實(shí)際應(yīng)用時(shí)，用時(shí)，rl/l的濃度比值由放射性的比值的濃度比值由放射性的比值b/f代代表。表。28教學(xué)資料具體公式如下具體公式如下： ： rl = b = rt 1_ rl l f kd kd 以以b/f對(duì)對(duì)rl作圖應(yīng)為一條直線，斜率為作圖應(yīng)為一條直線，斜率為-(1/kd)，直線與橫軸的交點(diǎn)為直線與橫軸

15、的交點(diǎn)為rt值，與縱軸交點(diǎn)為值，與縱軸交點(diǎn)為rt/kd。29教學(xué)資料2. 計(jì)算機(jī)曲線擬合計(jì)算機(jī)曲線擬合飽和曲線的直接表達(dá)式為：飽和曲線的直接表達(dá)式為： rl2-rlrt+lt+kd+rtlt=0其中，其中，lt是自變量（橫坐標(biāo)），是自變量（橫坐標(biāo)），rl是因變量（縱坐標(biāo)），是因變量（縱坐標(biāo)），rt和和kd是固定值。應(yīng)用計(jì)算機(jī)以最小二乘法或穩(wěn)健回歸是固定值。應(yīng)用計(jì)算機(jī)以最小二乘法或穩(wěn)健回歸法進(jìn)行曲線擬合，可以得到法進(jìn)行曲線擬合，可以得到rt和和kd的值。的值。30教學(xué)資料應(yīng)應(yīng) 用用1. 放射受體顯像：放射受體顯像： 放射性配體與靶細(xì)胞上受體結(jié)合，顯像。放射性配體與靶細(xì)胞上受體結(jié)合，顯像。31教學(xué)資料32教學(xué)資料33教學(xué)資料34教學(xué)資料2. 受體介導(dǎo)的靶向治療受體介導(dǎo)的靶向治療 放射性配體注入體內(nèi)，到相應(yīng)受體高密度的放射性配體注入體內(nèi)，到相應(yīng)受體