多位點(diǎn)序列分型高教課堂

1、 兩種分型方法的比較兩種分型方法的比較 mlst的步驟的步驟mlst的方案設(shè)計(jì)的方案設(shè)計(jì)mlst的由來(lái)的由來(lái)實(shí)例分析實(shí)例分析根據(jù)酶的電泳遷移率的不同來(lái)描述變異根據(jù)酶的電泳遷移率的不同來(lái)描述變異 選定管家酶 淀粉膠檢測(cè) 不同電泳遷移速率 電泳譜等位基因的變異性揭示微生物基因多樣性不能推斷特殊位點(diǎn)的堿基序列不能推斷特殊位點(diǎn)的堿基序列不同實(shí)驗(yàn)室間的分型結(jié)果不能進(jìn)行比不同實(shí)驗(yàn)室間的分型結(jié)果不能進(jìn)行比較較mlst是由多位點(diǎn)酶電泳是由多位點(diǎn)酶電泳(mlee)衍生出來(lái)衍生出來(lái)的的 一種分型方法一種分型方法在在1998年年,maiden等首次將等首次將mlst應(yīng)用于腦應(yīng)用于腦膜炎奈瑟菌分型膜炎奈瑟菌分型一種基

2、于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方一種基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法法通過(guò)通過(guò)pcrpcr擴(kuò)增多個(gè)管家基因內(nèi)部片段擴(kuò)增多個(gè)管家基因內(nèi)部片段測(cè)定其序列，分析菌株的變異測(cè)定其序列，分析菌株的變異mlst方法一般測(cè)定方法一般測(cè)定610個(gè)管家基因內(nèi)部個(gè)管家基因內(nèi)部400600bp的核苷酸序列，每個(gè)位點(diǎn)的序的核苷酸序列，每個(gè)位點(diǎn)的序列根據(jù)其發(fā)現(xiàn)的時(shí)間順序賦予一個(gè)等位基列根據(jù)其發(fā)現(xiàn)的時(shí)間順序賦予一個(gè)等位基因編號(hào)，每一株菌的等位基因編號(hào)按照指因編號(hào)，每一株菌的等位基因編號(hào)按照指定的順序排列就是它的等位基因譜定的順序排列就是它的等位基因譜 ，也即，也即是這株菌的序列型（是這株菌的序列型（sequence type,s

3、t）。）。這樣得到的每個(gè)這樣得到的每個(gè)st均代表一組單獨(dú)的核苷均代表一組單獨(dú)的核苷酸序列信息酸序列信息 。序列型（序列型（ sequence-typying, sts ）等同）等同于于mlee得出的電泳型得出的電泳型(electrophoretic type, et）通過(guò)比較通過(guò)比較st可以發(fā)現(xiàn)菌株的相關(guān)性可以發(fā)現(xiàn)菌株的相關(guān)性,即密切即密切相關(guān)菌株具有相同的相關(guān)菌株具有相同的st或僅有極個(gè)別基因或僅有極個(gè)別基因位點(diǎn)不同的位點(diǎn)不同的st,而不相關(guān)菌株的而不相關(guān)菌株的st至少有至少有3個(gè)或個(gè)或3個(gè)以上基因位點(diǎn)不同個(gè)以上基因位點(diǎn)不同mlst技術(shù)針對(duì)看家基因設(shè)計(jì)引物對(duì)其進(jìn)行技術(shù)針對(duì)看家基因設(shè)計(jì)引物對(duì)其

4、進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測(cè)序擴(kuò)增和測(cè)序,得出每個(gè)菌株各個(gè)位點(diǎn)的得出每個(gè)菌株各個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)值等位基因數(shù)值,然后進(jìn)行等位基因圖譜然后進(jìn)行等位基因圖譜(allelic profile)或或序列類型序列類型(sequence types, sts)鑒定，鑒定，再根據(jù)等位基因圖譜使用配對(duì)差異矩陣再根據(jù)等位基因圖譜使用配對(duì)差異矩陣(matrix pair-wise differences)等方法構(gòu)建等方法構(gòu)建系統(tǒng)樹圖進(jìn)行聚類分析。系統(tǒng)樹圖進(jìn)行聚類分析。三要素：三要素：選擇經(jīng)過(guò)初步篩選的菌株選擇經(jīng)過(guò)初步篩選的菌株選擇具有獨(dú)特特征的基因位點(diǎn)選擇具有獨(dú)特特征的基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)用于基因擴(kuò)增和序列測(cè)定的引物設(shè)計(jì)用于基因擴(kuò)

5、增和序列測(cè)定的引物根據(jù)已有的分型方法和流行病學(xué)資料，選根據(jù)已有的分型方法和流行病學(xué)資料，選擇擇100株左右具有代表性的菌株作為分析對(duì)株左右具有代表性的菌株作為分析對(duì)象。象。理論上，這些選定的菌株要代表所研究細(xì)理論上，這些選定的菌株要代表所研究細(xì)菌的群體，而不是僅僅包含那些對(duì)人致病菌的群體，而不是僅僅包含那些對(duì)人致病的克隆。的克隆。收集的菌株最好具有代表性，不僅僅由一收集的菌株最好具有代表性，不僅僅由一個(gè)亞型組成。個(gè)亞型組成。全基因組序列的測(cè)定大大方便全基因組序列的測(cè)定大大方便mlst位點(diǎn)位點(diǎn)的選擇一般選擇的選擇一般選擇10到到20株菌評(píng)價(jià)株菌評(píng)價(jià)10至至15個(gè)備選位點(diǎn)。個(gè)備選位點(diǎn)。最終采用最終

6、采用 7個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)和分析。個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)和分析。 如果需要提高分辨力，可以加入個(gè)別非保如果需要提高分辨力，可以加入個(gè)別非保守的基因，例如表面抗原基因或者毒力基守的基因，例如表面抗原基因或者毒力基因，這樣比增加管家基因的個(gè)數(shù)將更有效因，這樣比增加管家基因的個(gè)數(shù)將更有效目的片段長(zhǎng)度：目的片段長(zhǎng)度：400600bp所有引物調(diào)整為同一退火溫度，所有引物調(diào)整為同一退火溫度， 以適用于以適用于大范圍流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和群體研究大范圍流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和群體研究為了發(fā)現(xiàn)引物結(jié)合位點(diǎn)可能存在的變異，為了發(fā)現(xiàn)引物結(jié)合位點(diǎn)可能存在的變異， 每個(gè)位點(diǎn)都應(yīng)該設(shè)計(jì)一對(duì)以上引物每個(gè)位點(diǎn)都應(yīng)該設(shè)計(jì)一對(duì)以上引物實(shí)際運(yùn)用中，對(duì)

7、于已有的成熟mlst方案的細(xì)菌，可直接從mlst數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取方案。/收集病收集病原微生原微生物標(biāo)本物標(biāo)本基因組基因組dna的獲取的獲取pcr擴(kuò)增目擴(kuò)增目的基因的基因片段片段目的片目的片段的核段的核酸序列酸序列測(cè)定測(cè)定整合核整合核酸序列酸序列信息信息根據(jù)分析的細(xì)菌群體組成根據(jù)分析的細(xì)菌群體組成1.以等位基因編號(hào)和以等位基因編號(hào)和st編號(hào)為基本分析單編號(hào)為基本分析單位位 提交到提交到mlst分析網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（分析網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（www.mlst. net） start和和eburst 2.直接分析核苷酸序列直接分析核苷酸序列 上傳到上傳到genbank比對(duì)服務(wù)器進(jìn)行比對(duì)

8、服務(wù)器進(jìn)行blast比對(duì)驗(yàn)比對(duì)驗(yàn)證證數(shù)據(jù)分析得到數(shù)據(jù)分析得到等位基因圖譜等位基因圖譜新的新的sts則找出則找出對(duì)應(yīng)的對(duì)應(yīng)的clonal complex在數(shù)據(jù)庫(kù)中在數(shù)據(jù)庫(kù)中找出相應(yīng)的找出相應(yīng)的sts群體進(jìn)化研究群體進(jìn)化研究分子流行病學(xué)分子流行病學(xué)研究研究菌群結(jié)構(gòu)菌群結(jié)構(gòu)調(diào)查調(diào)查菌群遺傳菌群遺傳學(xué)分析學(xué)分析疾病的全疾病的全球性監(jiān)控球性監(jiān)控鑒定暴發(fā)鑒定暴發(fā)性疾病的性疾病的病原體病原體mlst結(jié)果分析流程圖遺傳學(xué)上具有相關(guān)性但并不相同的細(xì)菌的遺傳學(xué)上具有相關(guān)性但并不相同的細(xì)菌的集合集合,被稱為是同源復(fù)合體被稱為是同源復(fù)合體(the clonal complex),也叫克隆型。也叫克隆型。以其核心的基因

9、型來(lái)命名。以其核心的基因型來(lái)命名。分型方法分型方法分型力分型力可分辨率可分辨率可重復(fù)性可重復(fù)性結(jié)果易解結(jié)果易解釋性釋性易操作性易操作性費(fèi)用費(fèi)用rapd較好較好較高較高一般一般一般一般簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便低低pcr-rflp好好一般一般一般一般一般一般簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便低低aflp較好較好高高一般一般好好簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便中中mlst較好較好較高較高好好好好簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便較高較高pfge好好高高好好好好復(fù)雜復(fù)雜較高較高mlva很好很好高高好好好好簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便高高脈沖場(chǎng)凝膠電泳（脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pfge）比較所確定的高度變異片段高分辨力不適于進(jìn)行全面的流行病學(xué)調(diào)查及生物進(jìn)化分析不同實(shí)驗(yàn)間重復(fù)性較差標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)多位點(diǎn)序列分型（多位點(diǎn)序列分型（mlst）比較進(jìn)化較慢的位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)不同