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認(rèn)證類型：個(gè)人認(rèn)證

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IP屬地：湖北 上傳時(shí)間：2021-10-28 格式：DOCX 頁數(shù)：10 大?。?00.51KB 積分：30 舉報(bào) 版權(quán)申訴

1、一、稿約上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)為醫(yī)藥衛(wèi)生類綜合性學(xué)術(shù)期刊，月刊，每月28日出版，國(guó)內(nèi)外公開發(fā)行。本刊為中國(guó)科技核心期刊、中文核心期刊、中國(guó)高校優(yōu)秀科技期刊，主要被以下著名數(shù)據(jù)庫收錄：俄羅斯文摘雜志（AJ）、荷蘭文摘與引文數(shù)據(jù)庫（Scopus）、荷蘭醫(yī)學(xué)文摘（EMBASE）、美國(guó)化學(xué)文摘（CA）、美國(guó)劍橋科學(xué)文摘（自然科學(xué)）（CSA:NS）、日本科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)中國(guó)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫（JSTChina）、中國(guó)科技論文與引文數(shù)據(jù)庫(CSTPCD)統(tǒng)計(jì)源期刊(中國(guó)科技核心期刊)、中國(guó)科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫（CSCD）核心期刊、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊綜合評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫及中文核心期刊要目總覽。主要刊登醫(yī)學(xué)

2、基礎(chǔ)與臨床研究等領(lǐng)域所取得的新成果、新理論、新技術(shù)、新經(jīng)驗(yàn)。本刊設(shè)有論著（基礎(chǔ)研究、臨床研究、公共衛(wèi)生，等），綜述，述評(píng)，專家論壇，專題，短篇論著、技術(shù)與方法、病例報(bào)告等欄目，歡迎校內(nèi)外作者踴躍投稿。高原高峰?？母寮樘厥飧寮?，由作者介紹和論文兩部分組成。作者介紹為特別項(xiàng)目，需要作者照片1幅（高精度.jpg或.tif格式），以及作者的學(xué)術(shù)介紹文字300400字。論文的要求與學(xué)報(bào)常規(guī)相同。1投稿1.1 登錄網(wǎng)站（），注冊(cè)成為系統(tǒng)用戶，在線完成遠(yuǎn)程投稿。1.2 投稿后可在線或在手機(jī)微信平臺(tái)查詢稿件處理情況。1.3 來稿應(yīng)具有創(chuàng)新性、學(xué)術(shù)性、科學(xué)性、準(zhǔn)確性和可讀性。切勿抄襲剽竊、偽造、篡改、不當(dāng)署

3、名以及一稿兩投或多投。1.4編輯部將初審符合要求的稿件，按照稿件處理程序，聘請(qǐng)相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜疫M(jìn)行評(píng)審和學(xué)報(bào)主編終審，編輯部根據(jù)評(píng)審意見，以學(xué)術(shù)質(zhì)量為前提，公平、公正地取舍稿件。1.5稿件文責(zé)自負(fù)，凡被錄用的稿件，編輯部有權(quán)對(duì)稿件進(jìn)行技術(shù)性和文字性修改，凡涉及對(duì)原意的修改將征得作者同意。1.6期刊付印前按校樣版面向作者收取審稿費(fèi)和版面費(fèi)，同時(shí)支付稿酬，出版后贈(zèng)送當(dāng)期雜志2冊(cè)。2撰稿要求2.1文稿撰寫要求論點(diǎn)明確、文字精練、數(shù)據(jù)可靠、書寫規(guī)范。論著10 000字以內(nèi)（含圖、表），外文字符的大小寫、正斜體、上下角標(biāo)、符號(hào)應(yīng)正確運(yùn)用。2.2文題應(yīng)簡(jiǎn)明地反映文章的特定內(nèi)容，不使用非公知縮略詞，中文題名一般

4、不超過26個(gè)漢字，中英文題名含義應(yīng)一致。作者單位應(yīng)寫全稱（中英文），并注明城市及郵政編碼。如作者單位為二個(gè)或二個(gè)以上，在每一位作者的右上角標(biāo)注序號(hào)，單位名稱標(biāo)注相同的序號(hào)。2.3文章均需附中英文摘要。摘要一般不超過300字。除綜述外，中文摘要采用結(jié)構(gòu)式（目的、方法、結(jié)果和結(jié)論）；英文摘要須與中文摘要相對(duì)應(yīng)。中英文摘要一律采用第三人稱表述，不使用“本文”“作者”等作為主語。2.4關(guān)鍵詞（38個(gè)）選詞應(yīng)規(guī)范，應(yīng)盡量從主題詞表中選取，未被詞表收錄的詞如果確有必要也可作為關(guān)鍵詞選用，中英文關(guān)鍵詞應(yīng)對(duì)應(yīng)。2.5正文分為“引言”“材料與方法”“結(jié)果”和“討論”四個(gè)部分；病例報(bào)告分為“臨床資料”和“討論”二

5、個(gè)部分。文章編號(hào)采用三級(jí)標(biāo)題頂格排序，一級(jí)標(biāo)題以“1，2，3”排序，二級(jí)標(biāo)題以“1.1，1.2；2.1,2.2”排序，三級(jí)標(biāo)題以“1.1.1，1.1.2；2.1.1，2.1.2”排序，引言不排序。方法部分已有文獻(xiàn)記載的，引用文獻(xiàn)即可；若對(duì)文獻(xiàn)記載的方法進(jìn)行改進(jìn)或有創(chuàng)新應(yīng)詳細(xì)說明。結(jié)果可用文字、圖或表格形式表達(dá)，但三者內(nèi)容不宜重復(fù)。英文縮略詞應(yīng)先出現(xiàn)中英文全稱后方能直接運(yùn)用。量和單位須符合中華人民共和國(guó)法定計(jì)量單位最新標(biāo)準(zhǔn)。2.6文中圖表以先見文字后見圖表為原則，圖題、表題需中英文對(duì)照（一般不超過15字）。表格一律采用“三線表”，圖表直接置于正文中，圖表中內(nèi)容及注釋用中文表示。照片須另附文件（T

6、IF格式），組織學(xué)照片需注明染色方法及放大倍數(shù)。2.7首頁地腳線下注明論文的基金項(xiàng)目及其編號(hào)；第一作者簡(jiǎn)介包括姓名、出生年份、性別、職稱、學(xué)位及是否為研究生導(dǎo)師，并提供電子信箱；如有通訊作者，請(qǐng)注明姓名和電子信箱。2.8按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定書寫統(tǒng)計(jì)學(xué)符號(hào)。2.9參考文獻(xiàn)應(yīng)是文中直接引用的公開出版物，其中80%以上應(yīng)為近5年出版的文獻(xiàn)，采用順序編碼，并在正文相應(yīng)處右上角標(biāo)注，溫哥華格式書寫。期刊：作者.文題J.刊名，出版年份，卷（期）：起止頁碼。專著:作者.書名.版本(第1版免著)M.出版地：出版者，出版年：起止頁碼。論文集：作者.題名.編者.論文集名C.出版地：出版者.出版年：起止頁碼。學(xué)位論文：作

7、者.題名D.保存地點(diǎn)：保存單位，年份。專利文獻(xiàn)：專利申請(qǐng)者.題名P.專利國(guó)別，專利文獻(xiàn)種類，專利號(hào).出版日期?？茖W(xué)技術(shù)報(bào)告：作者.題名R.報(bào)告題名，編號(hào).出版地：出版者，出版年：起止頁碼。電子文獻(xiàn)：作者.題名EB/OL.電子文獻(xiàn)地址.發(fā)表或更新日期/引用日期。文獻(xiàn)作者3名以內(nèi)全部列出，4名以上只列前3名，后加“,等”或“,et al”；外文作者姓前名后，名用縮寫，不加縮寫點(diǎn)。外文作者名及雜志名的縮寫以PubMed格式為準(zhǔn)。 ?？?zé)編 曹智勇Tel63846590*776143flyczy 編輯部主任 徐敏Tel63846590*776141M

8、xu181上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)編輯部二、論文模板論著 基礎(chǔ)研究【作者介紹】 【作者介紹】撰寫要求：分為兩段。第一段介紹個(gè)人相關(guān)信息，如姓名（出生年份-）、學(xué)術(shù)頭銜、學(xué)歷等；第二段介紹學(xué)術(shù)背景，包括研究方向、研究成果等。請(qǐng)參照示例。 陳400-500字國(guó)強(qiáng)（1963-），上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授、博士生導(dǎo)師。中國(guó)科學(xué)院院士，醫(yī)學(xué)病理生理學(xué)家。1985年畢業(yè)于衡陽醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，1988年和1996年分別獲上海第二醫(yī)科大學(xué)碩士和博士學(xué)位。  長(zhǎng)期從事腫瘤尤其是急性髓細(xì)胞性白血病(AML)細(xì)胞命運(yùn)決定和腫瘤微環(huán)境調(diào)控機(jī)制研究。在低氧微環(huán)境方面，發(fā)現(xiàn)低氧通過低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-

9、1）的非轉(zhuǎn)錄功能，誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化，并揭示了Cbx4通過類泛素化修飾HIF-1控制肝癌新生血管生成與轉(zhuǎn)移的機(jī)制。在應(yīng)激微環(huán)境方面，發(fā)現(xiàn)了白血病干/祖細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化形成新的骨髓微環(huán)境和該高精度個(gè)人照片，jpg或tif格式微環(huán)境保護(hù)白血病細(xì)胞的機(jī)制。在化學(xué)生物學(xué)方面，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)抗腫瘤天然化合物，尤其是發(fā)現(xiàn)了腺花素通過靶向過氧化物還原酶家族成員，誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化。曾獲國(guó)家自然科學(xué)二等獎(jiǎng)、中華醫(yī)學(xué)科技一等獎(jiǎng)、上海市自然科學(xué)一等獎(jiǎng)、何梁何利科學(xué)與技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)等。Ajuba論文，具體要求見學(xué)報(bào)官網(wǎng)與Twist相互作用調(diào)控N-cadherin表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的影響陳寧1,2 宋立偉3 袁

10、曉圓1 王家敏1 侯照遠(yuǎn)11 上海交通大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，上海 200025；2 上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，上海 200025；3 上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院普外科，上海 200011摘要 目的 探索結(jié)直腸癌細(xì)胞中Ajuba與Twist之間的相互作用，及該作用對(duì)于結(jié)直腸癌遷移所產(chǎn)生的影響。方法 運(yùn)用免疫共沉淀方法驗(yàn)證外源性Ajuba與Twist蛋白之間是否存在相互作用；熒光素酶活性檢測(cè)Ajuba對(duì)于Twist下游靶基因N-cadherin啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性；構(gòu)建結(jié)直腸癌SW1116-shAjuba穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞遷移能力變化。

11、 結(jié)果 Ajuba與Twsit之間存在相互作用，并且Ajuba能通過Twist促進(jìn)N-cadherin的表達(dá)調(diào)控。在結(jié)直腸癌細(xì)胞SW1116-shAjuba穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)，Ajuba基因表達(dá)水平降低，蛋白表達(dá)下降，能抑制細(xì)胞遷移能力。結(jié)論 Ajuba是轉(zhuǎn)錄因子Twist的共活化因子，能夠促進(jìn)N-cadherin表達(dá)，增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力。關(guān)鍵詞 結(jié)直腸癌；Ajuba；Twist；N-cadherin；細(xì)胞遷移DOI 中圖分類號(hào) R735.3+5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A_基金項(xiàng)目基金標(biāo)明 國(guó)家自然科學(xué)基金（81172028，81372309，81402177）；上海市科委重點(diǎn)項(xiàng)目基金（13JC1

12、401302）(National Natural Science Foundation of China, 81172028, 81372309, 81402177; Project of Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, 13JC1401302)。作者簡(jiǎn)介 陳寧（1986），女，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士生；電子郵箱：chenning_biochem。通信作者 侯照遠(yuǎn)，電子郵箱：Joe_hou。Ajuba upregulates N-cadherin expression level and enhances CRC

13、 cells migration by interacting with TwistCHEN Ning1,2 SONG Li-wei3 YUAN Xiao-yuan1 WANG Jia-min1 HOU Zhao-yuan11.Department of Biochemistry and Molecular and Cell Biology, Basic Medicine Faculty, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China;2.Faculty of Medical Laboratory Science, Shanghai

14、 Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China；3. Department of General Surgery, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, ChinaAbstract Objective To observe the effect of the interaction between LIM protein Ajuba and transcript

15、ion factor Twist in colorectal cancer and to verify the affection on CRC cell migration ability. Methods Co-immunoprecipitation test was used to detect the interaction between Ajuba and Twist. The transcription activity level of N-cadherin promoter was estimated by luciferase report gene assay under

16、 the condition of exogenous Ajuba protein concentration gradient. Ajuba knock-down stable cell lines in SW1116 were established and the cell migration ability was tested by transwell assay. Results Exogenous Ajuba interacts with Twist, which can enhance the transcription activity of N-cadherin promo

17、ter, which is one of the classic target genes of Twist. When Ajuba were transfected in 293T cell in the concentration of 50、100、200ng/well, the luciferase activities were up-regulated. Similarly, when Ajuba transfected company with Twist, the results of the luciferase activity increase two-fold. In

18、SW1116-shAjuba cells, the cell migration abilities were repressed due to the down-regulation of Ajuba protein level. Conclusion LIM protein Ajuba is a new coactivator of transcription factor Twist, which can promote N-cadherin expression and enhance CRC cell migration ablity. Due to the high express

19、ion level of Ajuba protein in CRC, Ajuba may be a potential diagnostic marker to estimate the degree of tumor metastasis.Key words colorectal cancer；Ajuba；Twist；N-cadherin；cell migration 結(jié)直腸腫瘤(colorectal cancer , CRC)近年來呈現(xiàn)高發(fā)趨勢(shì)1。據(jù)研究調(diào)查顯示，CRC已成為第三位男性成年人常見腫瘤；而對(duì)于女性成年人來說，CRC的確診率僅次于乳腺腫瘤。在全球，每年約有123萬例新結(jié)直腸癌患

20、者被確診，其中超60萬例死于該疾病1。大約有30%的結(jié)直腸癌患者在就診時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤已出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移2，其中25%40%的患者在之后病程中將經(jīng)歷腫瘤復(fù)發(fā)，愈期遲緩。因此，尋找合適的腫瘤標(biāo)志物來監(jiān)測(cè)及診斷腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，對(duì)結(jié)直腸癌的治療愈后異常重要3,4。隨著對(duì)CRC研究的深入，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展、激發(fā)腫瘤遠(yuǎn)端遷移的蛋白被陸續(xù)報(bào)道。其中，有文獻(xiàn)表明LIM家族成員Ajuba在結(jié)直腸癌中高表達(dá)5。Ajuba基因位于人類染色體14q11.2，含有9個(gè)外顯子。其蛋白結(jié)構(gòu)與LIM家族的其他成員相似，C端為3個(gè)同源LIM結(jié)構(gòu)域，N端為1個(gè)富含甘氨酸和脯氨酸的preLIM區(qū)。LIM結(jié)構(gòu)域?yàn)?個(gè)雙鋅指結(jié)構(gòu)，通常

21、作為蛋白之間相互作用的交接面6。依據(jù)細(xì)胞類型及功能需要，Ajuba蛋白可在胞質(zhì)和/或核內(nèi)定位。Ajuba作為支架蛋白參與多種多元蛋白復(fù)合體的形成7，并由此參與細(xì)胞內(nèi)多種重要的生物學(xué)調(diào)控。作為轉(zhuǎn)錄因子Snail的共阻遏物，Ajuba參與下游靶基因上皮黏連蛋白E-cadherin的表達(dá)調(diào)控，是細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及轉(zhuǎn)移的必要調(diào)控因素8。同時(shí)，Ajuba招募精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(Prmt5)和HDACs共同抑制EMT進(jìn)展8。轉(zhuǎn)錄因子Twist是基礎(chǔ)螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)轉(zhuǎn)錄家族

22、的成員之一9，主要參與細(xì)胞分化和細(xì)胞譜系相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。與EMT相關(guān)的分子標(biāo)志物中，Twsit參與N-黏連蛋白(N-cadherin)的基因表達(dá)，對(duì)細(xì)胞間質(zhì)化轉(zhuǎn)變具有重要影響10,11?；谥暗膱?bào)道，本研究旨在探索結(jié)直腸癌細(xì)胞中Ajuba與Twist之間是否存在相互作用，及該作用對(duì)于結(jié)直腸癌遷移所產(chǎn)生的影響。1 材料與方法1.1 細(xì)胞及主要試劑 實(shí)驗(yàn)用人結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞株為上海市第九人民醫(yī)院普外科贈(zèng)送，293T細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室自有細(xì)胞株；高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)購于美國(guó)Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒、聚丙烯酰胺預(yù)制梯度凝膠購于Invitrogen公司；實(shí)驗(yàn)

23、用蛋白檢測(cè)抗體均購于CST公司。1.2細(xì)胞培養(yǎng) 在37、5%CO2條件下，將復(fù)蘇的細(xì)胞株(293T、SW1116)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行試驗(yàn)。SW1116細(xì)胞先后建立Ajuba敲除及過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，培養(yǎng)條件不變。1.3 試驗(yàn)方法1.3.1 構(gòu)建Ajuba穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系 依據(jù)Ajuba的基因序列設(shè)計(jì)干擾位點(diǎn)，構(gòu)建pLKO-shAjuba質(zhì)粒，質(zhì)粒序列及具體構(gòu)建方法在之前文獻(xiàn)中已有表述8。將SW1116細(xì)胞種于6孔板內(nèi)，待豐度達(dá)70%80%時(shí)，加入前期已制備的pLKO-shAjuba慢病毒液，及脂質(zhì)體polybrene(病毒液與polybrene體積比為1 0

24、00:1)。共培養(yǎng)24h后，撤去培養(yǎng)基。通過基因水平及蛋白水平檢測(cè)鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。1.3.2 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá) 去除細(xì)胞培養(yǎng)基，4預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞2次，用細(xì)胞刮刀沿平皿底面輕刮貼壁細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞并收集到15mL離心管內(nèi)。600×g 5min低溫離心，去除上清液，加入RIPA裂解液后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品置電浴鍋100加熱5min后瞬時(shí)離心，收獲沉淀，即可上樣。電泳恒壓分離蛋白樣品，初始電壓為90V，待蛋白Marker分開后，電壓調(diào)至120V直至整個(gè)電泳完成。采用濕轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)膜，恒流300mA 90min。5%脫脂牛奶室溫

25、封閉30min，加入商品說明書要求的稀釋一抗，4水平搖擺搖床過夜。回收一抗后，1×PBS緩沖液洗膜3次，10min/次。加入相應(yīng)種屬的熒光二抗，置于水平搖床室溫孵育3h?；厥斩?，1×PBS緩沖液洗膜3次，10min/次，隨后置于熒光顯影儀掃膜顯影。1.3.3 RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá) 依據(jù)人Ajuba基因的mRNA序列設(shè)計(jì)檢測(cè)引物。分別提取Ajuba敲除及過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板。以感染空載病毒質(zhì)粒的SW1116細(xì)胞作為對(duì)照，-actin作為內(nèi)參。應(yīng)用美國(guó)ABI公司7500型熒光定量PCR儀，按照Invitrogen PCR操作手冊(cè)進(jìn)行rea

26、l-Time PCR。PCR反應(yīng)條件：95 5min預(yù)變性, 94 30s, 55 30s, 72 30s;共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以2-CT值評(píng)估相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。1.3.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 在Transwell小室反面均勻涂上50L纖維黏連蛋白，超凈臺(tái)內(nèi)自然風(fēng)干2h，使其成為一層薄膜。將Matrigel基質(zhì)膠用無血清DMEM培養(yǎng)基按16稀釋，取25L稀釋液包被Transwell小室底部，置于37、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)熱30min，使Matrigel聚合成凝膠。用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整各組細(xì)胞數(shù)至5×105個(gè)細(xì)胞，上室加入200L無血清細(xì)胞懸液，下

27、室加入600L含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，95%甲醇固定30min，結(jié)晶紫染色30min，PBS清洗3次后用棉簽擦去上室殘留細(xì)胞，置于倒置顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品計(jì)數(shù)9個(gè)視野穿過的細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。1.3.5 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 依據(jù)GeneBank上提供的N-cadherin基因序列，設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)上游-1 400bp處及+10處引物，構(gòu)建pGL3-N-cadherin promoter報(bào)告基因質(zhì)粒。該報(bào)告基因質(zhì)粒為易靜教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送獲得。在鋪有293T細(xì)胞的24孔板內(nèi)分別瞬轉(zhuǎn)-半乳糖苷酶(-Gal) 20g/孔、pGL3-N-cad pr

28、omoter/pGL3-vector 150g/孔。并依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要相應(yīng)加入pcDNA3.1-Flag-Twist質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24h后，用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞2次，加入200L裂解液,置4水平搖床震蕩20min裂解細(xì)胞。取20L細(xì)胞裂解液分別檢測(cè)內(nèi)參-Gal及熒光firefly表達(dá)量。具體實(shí)驗(yàn)操作依據(jù)美國(guó)Promega公司提供的說明書進(jìn)行。1.3.6 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(co-immunoprecipitation, Co-IP) 收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞IP裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上或者4裂解30min, 12 000×g離心30 min后取上清。取少量裂解液以備Western blo

29、tting分析，剩余裂解液將1g相應(yīng)的抗體和1050 L protein A/G-beads加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜。免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C 以3 000 ×g速度離心5 min，將protein A/G-beads離心至管底；將上清液小心吸去，protein A/G-beads用1mL裂解緩沖液洗34次；最后加入15L的2×SDS 加樣緩沖液，100加熱10min后上樣SDS-PAGE，進(jìn)行Western blotting分析。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均為3次試驗(yàn)重復(fù)一致后獲得。定量

30、數(shù)據(jù)以± S表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用students t檢驗(yàn)，P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 Ajuba與轉(zhuǎn)錄因子Twist存在相互作用 為了驗(yàn)證Ajuba與Twist兩者之間是否存在相互作用，我們?cè)?93T細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染及共轉(zhuǎn)Ajuba和Twist外源性表達(dá)質(zhì)粒，48h后收獲細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。取1/10體積的蛋白裂解液檢測(cè)外源性蛋白表達(dá)水平(input)，從圖1可知，轉(zhuǎn)染效果良好，蛋白表達(dá)量基本一致。用抗HA-tag抗體檢測(cè)由protein A/G beads富集的抗myc-tag蛋白，可以發(fā)現(xiàn)標(biāo)記HA-tag的Twist蛋白在共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞蛋白中存在。這說明，

31、Ajuba與Twist之間存在相互作用。圖1 Ajuba與Twist通過外源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明存在相互作用Fig 1 Co-immunoprecipitation between Ajuba and Twist2.2 Ajuba協(xié)同Twist調(diào)控N-cadherin表達(dá)N-cadherin是轉(zhuǎn)錄因子Twist下游的經(jīng)典靶基因，同時(shí)也是細(xì)胞間質(zhì)化的主要標(biāo)志物之一12。我們選擇N-cadherin作為靶點(diǎn)，進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)來觀察Ajuba是否參與Twist對(duì)下游基因的調(diào)控。在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pGL3-N-cadherin promoter質(zhì)粒的同時(shí)，分別按0、50、100、200ng的

32、濃度轉(zhuǎn)入外源Ajuba表達(dá)質(zhì)粒。圖2A的結(jié)果表明，在加入50ng Ajuba后，熒光素酶活性即上升1倍。而當(dāng)轉(zhuǎn)入25ng Ajuba或/和50ng Twist表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，熒光素酶的活性大大增強(qiáng)，Ajuba協(xié)同Twist調(diào)控作用明顯(圖2B)。這證明，Ajuba協(xié)同輔助 Twist參與調(diào)控N-cadherin表達(dá)。 A：外源性Ajuba蛋白濃度梯度實(shí)驗(yàn)；B：Ajuba與Twsit共轉(zhuǎn)染報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。圖2 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)Ajuba對(duì)于N-cadherin基因表達(dá)的調(diào)控影響Fig 2 Transcription activity level of N-cadherin promoter w

33、as estimated by luciferase report gene assay2.3 構(gòu)建結(jié)直腸癌SW1116-Ajuba敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 在結(jié)腸癌組織中，Ajuba蛋白呈高表達(dá)水平5。我們選取了結(jié)直腸癌細(xì)胞中的SW1116，并用人靶向的pLKO-shAjuba 1#、2#慢病毒液感染細(xì)胞建立穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除細(xì)胞株。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)AJUBA基因表達(dá)水平，可發(fā)現(xiàn)干擾效果較好，基因水平均下調(diào)40%50%(圖3A)。Western blotting檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞蛋白表達(dá)情況，在圖3B的結(jié)果中可見，Ajuba蛋白水平亦發(fā)生下調(diào)。以上鑒定試驗(yàn)證明，SW1116-shAjuba穩(wěn)

34、轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建完成。 A：qPCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)AJUBA基因水平；B：Wester blotting法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ajuba蛋白表達(dá)水平。圖3 構(gòu)建并鑒定SW1116-shAjuba穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Fig 3 Establish the SW1116-shAjuba stable cell lines2.4 Ajuba可以促進(jìn)細(xì)胞遷移侵襲能力在小室內(nèi)同時(shí)鋪種相同數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，以感染空載病毒質(zhì)粒的SW1116-vector作為陰性對(duì)照，觀察干擾Ajuba蛋白表達(dá)的SW1116-shAjuba 1#、2#穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞侵襲能力的改變。從圖4A的結(jié)果可見，24h后細(xì)胞內(nèi)源性Ajuba蛋白

35、表達(dá)受到干擾后，細(xì)胞侵襲能力明顯下降，shAjuba1#、2#穩(wěn)轉(zhuǎn)株在鏡下可觀察到的細(xì)胞數(shù)量?jī)H為對(duì)照組的1/3，遷移細(xì)胞數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果存在明顯差異(P0.05)(圖4B)。 A：顯微鏡下拍攝穿膜細(xì)胞克隆，10× 20×；B：20×顯微鏡下遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。圖4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SW1116-shAjuba穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞遷移能力Fig 4 Transwell assay to estimate the cell migration ability3 討論腫瘤細(xì)胞如何發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移已成為腫瘤治療方案的關(guān)鍵點(diǎn)。目前已報(bào)道的與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的癌基因主要有結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移

36、相關(guān)基因-1(metastasis-associated in colon cancer-1, MACC1)13和皮層肌動(dòng)蛋白14，兩者都已證明其表達(dá)量的改變與結(jié)腸癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移息息相關(guān)。而本文的研究數(shù)據(jù)表明，Ajuba蛋白也參與了結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移與遠(yuǎn)端侵襲。細(xì)胞中高表達(dá)Ajuba基因，提高其蛋白水平后，細(xì)胞間質(zhì)化趨向明顯，侵襲能力增強(qiáng)。這些功能學(xué)作用的改變則是Ajuba通過與N-cadherin上游調(diào)控因子Twist相互作用，影響其對(duì)靶基因調(diào)控所形成的。而Ajuba與Twist相互作用的具體作用位點(diǎn)尚未明確，兩者間是如何發(fā)生結(jié)構(gòu)變化也待探尋，這就需要我們繼續(xù)通過構(gòu)建截短體、突變潛在的結(jié)合序

37、列來揭示其中的真相。Ajuba結(jié)構(gòu)中擁有具生物學(xué)功能的核受體(nuclear receptor, NR) 結(jié)合區(qū)域15，這些區(qū)域序列相對(duì)保守，在種屬間差異不大。Ajuba招募Prmt5時(shí)，其結(jié)合位點(diǎn)即為NR28；RAR橫跨NR2、NR3、NR4三個(gè)結(jié)合區(qū)與Ajuba相互結(jié)合16。這提示我們，Ajuba與Twist極有可能也是通過這些NR結(jié)合區(qū)直接相互作用，而具體細(xì)節(jié)還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確。此外，細(xì)胞內(nèi)源性Ajuba、Twist的蛋白水平存在差異，且主要的分布位點(diǎn)有所不同，對(duì)于兩者內(nèi)源性相互作用概率影響極大。之前的大量文獻(xiàn)中，Ajuba被證明是Snail、RAR等轉(zhuǎn)錄因子的共阻遏物8,16，抑制信

38、號(hào)通路的傳導(dǎo)。而在本次試驗(yàn)中，Ajuba對(duì)于N-cadherin的表達(dá)起到了輔助轉(zhuǎn)錄因子Twist功能的角色，其水平降低更抑制了細(xì)胞的侵襲能力，這表現(xiàn)出Ajuba在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控上起到的輔助活化作用。而Ajuba在結(jié)直腸癌中高表達(dá)亦是惡性腫瘤高侵襲性的表現(xiàn)。 綜上所述，LIM家族蛋白Ajuba作為轉(zhuǎn)錄因子Twist的共活化因子(coactivator)，參與調(diào)控細(xì)胞間質(zhì)化標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)，影響結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力。Ajuba表達(dá)量的檢測(cè)也有望作為結(jié)直腸癌是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)。參考文獻(xiàn)1 Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global can

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