教學(xué)課件第7章第4節(jié)分子雜交和印跡技術(shù)3LMJ

1、基因操作第七章gene manipulating2021年10月29日3時(shí)02分12021年10月29日3時(shí)03分2molecular blotting & hybridization technology2021年10月29日3時(shí)03分3 marmum和doty1961年發(fā)現(xiàn)的dna變性復(fù)性現(xiàn)象是核酸雜交技術(shù)的理論基礎(chǔ)。(heteroduplex)2021年10月29日3時(shí)03分4一、印跡技術(shù)(blotting)u1975年edwen southern建立的dna印跡雜交。 指將電泳凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移(印跡)于固定化介質(zhì)如硝酸纖維素膜上并加以檢測(cè)分析的技術(shù)。支持物轉(zhuǎn)移緩沖液紙巾玻

2、璃板500g（1）印跡：電轉(zhuǎn)移真空負(fù)壓吸引轉(zhuǎn)移whatman濾紙凝膠whatman濾紙重物nc膜或尼龍膜毛細(xì)作用轉(zhuǎn)移2021年10月29日3時(shí)03分5 nc膜上載有的dna單鏈分子就可以在雜交液中與另一種dna或rna分子(稱為探針，可用同位素或非同位素標(biāo)記)進(jìn)行雜交。 具有互補(bǔ)序列的rna或dna標(biāo)記探針結(jié)合到存在于nc膜的dna分子上，經(jīng)放射自顯影或其他檢測(cè)技術(shù)就可以顯現(xiàn)雜交分子的有無(wú)和位置。（2）雜交：（3）顯示：2021年10月29日3時(shí)03分6（1）特定基因序列的定性和定量分析u核酸分子雜交應(yīng)用（2）基因克隆的篩選（3）酶切圖譜的制作（4）基因突變分析（5）疾病的診斷2021年10月

3、29日3時(shí)03分7二、探針的種類和制備探針(probe)的概念： 用來(lái)檢測(cè)某一特定核苷酸序列或基因序列的dna或rna的互補(bǔ)標(biāo)記片段： 與待測(cè)特定核苷酸的某一段序列相互補(bǔ)； 有明確的標(biāo)志用于后續(xù)的檢測(cè)。2021年10月29日3時(shí)03分8探針的種類寡核苷酸探針基因組dna探針cdna探針rna探針（一）常用探針的種類dna探針2021年10月29日3時(shí)03分91dna探針雙鏈探針:單鏈探針 從克隆在質(zhì)粒載體中的特異性基因片段制備；優(yōu)點(diǎn)則是容易制備。 用化學(xué)法合成或從克隆在m13噬菌體的特異性基因片段制備；優(yōu)點(diǎn)是在雜交反應(yīng)中可以排除互補(bǔ)鏈的干擾。2021年10月29日3時(shí)03分102rna探針早期

4、采用細(xì)胞mrna和病毒rna作探針 主要用于研究目的，而不是用于檢測(cè)。如篩選hiv的基因組dna克隆、進(jìn)行中的轉(zhuǎn)錄分析等式。 與dna單鏈探針相比，rna探針具有標(biāo)記效率高、易于純化、成本低和雜交信號(hào)強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn) 標(biāo)記是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過(guò)程，效率往往不高，且受多種因素的制約。2021年10月29日3時(shí)03分11（二）核酸探針的標(biāo)記 根據(jù)是否使用放射性標(biāo)記物可分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記；根據(jù)標(biāo)記物摻入情況可分為均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針。理想標(biāo)記物應(yīng)備條件不影響堿基對(duì)特異性有較高的化學(xué)穩(wěn)定性檢測(cè)方法高度特異、靈敏標(biāo)記及檢測(cè)方法簡(jiǎn)單環(huán)保，無(wú)損害價(jià)格低廉2021年10月29日3時(shí)03分12優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)

5、靈敏度和特異性極高半衰期短, 隨用隨標(biāo)1.放射性同位素標(biāo)記探針對(duì)各種酶促反應(yīng)無(wú)任何影響不影響堿基配對(duì)的特異性與穩(wěn)定性放射性污染 用于核酸探針標(biāo)記的放射性同位素主要有32p、3h和35s等；32p應(yīng)用最多。2021年10月29日3時(shí)03分13 32p的放射性較強(qiáng)，放射自顯影所需時(shí)間較短，靈敏度高，可廣泛應(yīng)用于各種印跡雜交。 缺點(diǎn)是半衰期短(14.3天)，射線散射嚴(yán)重，放射自顯影后x膠片上的信號(hào)有時(shí)邊緣不清。r-32p atpa-32p datp*3h2datp2021年10月29日3時(shí)03分14(1) dna切口平移 標(biāo)記法2021年10月29日3時(shí)03分15u核酸探針的標(biāo)記方法dna酶：在雙鏈

6、dna上隨機(jī)打開(kāi)若干個(gè)單鏈缺口，產(chǎn)生3-oh端。大腸桿菌dna聚合酶：53 dna聚合酶活性； 53 外切核酸酶活性。dna切口平移標(biāo)記法示意圖2021年10月29日3時(shí)03分16(2) dna隨機(jī)引物標(biāo)記法2021年10月29日3時(shí)03分17隨機(jī)引物：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096dna聚合酶klenow片段：保留53 dna聚合酶活性,弱35外切酶活性，無(wú)53外切酶活性。dna隨機(jī)引物標(biāo)記法示意圖2021年10月29日3時(shí)03分182021年10月29日3時(shí)03分195 3 3 5 完整雙鏈dna限制性內(nèi)切酶5 3 3 5 -32p-dntp其他3 種dntpk

7、lenow dna聚合酶5 3 3 5 變性5 3 3 5 5 末端突出的dna3 末端標(biāo)記的dna32p-末端標(biāo)記的單鏈dna探針1) dna的3末端標(biāo)記(3) dna的末端標(biāo)記2021年10月29日3時(shí)03分20 條件是有5-oh存在，人工合成寡核苷酸最常用；雙鏈dna需用堿性磷酸酶切除5-p后再標(biāo)記5pcpgptpa35ho-cpgptpa3t4噬菌體多核苷酸激酶-32p-atp532p-o-cpgptpa337，反應(yīng)10min, -32p-atp 需150 ci/反應(yīng)2) dna的5末端標(biāo)記堿性磷酸酶2021年10月29日3時(shí)03分21標(biāo)記探針的純化凝膠過(guò)濾層析 常用的凝膠基質(zhì)：sep

8、hadex g-50、bio-gel p-60選擇性沉淀 乙醇存在，醋酸銨可起此作用。2021年10月29日3時(shí)03分22u核酸探針的標(biāo)記方法(1) dna切口平移標(biāo)記法(2) dna隨機(jī)引物標(biāo)記法(7) rna探針的標(biāo)記(3) dna的末端標(biāo)記(4) cdna探針的標(biāo)記(5) 寡核苷酸探針的標(biāo)記(6) 單鏈dna探針的標(biāo)記2021年10月29日3時(shí)03分232. 非放射性標(biāo)記物優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)靈敏度較放射性同位素標(biāo)記低無(wú)放射性污染 用于核酸探針標(biāo)記的非放射性標(biāo)記物主要有生物素、地高辛和熒光素(fitc、羅丹明)等。穩(wěn)定性好,可較長(zhǎng)時(shí)間存放特異性較放射性同位素標(biāo)記低2021年10月29日3時(shí)03分24

9、2021年10月29日3時(shí)03分25the method used to produce nonradioactive dna molecules that carry a specific chemical marker that can be detected with an appropriate antibody.biotin-avidin systemdig-dutp 電泳,轉(zhuǎn)膜，紫外交聯(lián)固定dd2021年10月29日3時(shí)03分26ohnhhnshhoo關(guān)于生物素2021年10月29日3時(shí)03分27雜交：生物素標(biāo)記的探針與靶dna結(jié)合底物在hrp催化下,反應(yīng)發(fā)光洗膜封閉電泳,轉(zhuǎn)膜，紫

10、外交聯(lián)固定sahrp底物bbhrp標(biāo)記的鏈親和素與探針上的生物素結(jié)合2021年10月29日3時(shí)03分281.曝光：用濾紙吸去雜交膜上多余底物，作好標(biāo)記， 保鮮膜包裹，放在暗夾里，放上x(chóng)光片，曝光1-5 分鐘；2.顯影：取出x光片，按使用說(shuō)明書(shū)顯影和定影。后繼的化學(xué)發(fā)光檢測(cè) luminol化學(xué)發(fā)光原理 2021年10月29日3時(shí)03分29思考題：三、印跡技術(shù)的種類和用途（一）dna印跡雜交技術(shù)（二）rna印跡雜交技術(shù)（四）蛋白質(zhì)印跡雜交技術(shù)（三）其它核酸印跡雜交技術(shù)2021年10月29日3時(shí)03分302021年10月29日3時(shí)03分312021年10月29日3時(shí)03分322021年10月29日3

11、時(shí)03分332021年10月29日3時(shí)03分342021年10月29日3時(shí)03分35 將菌落或噬菌斑影印在尼龍膜上(以前用硝酸纖維膜)，這種膜只吸附單鏈dna； 用naoh處理，這樣不僅可以殺死細(xì)菌，同時(shí)可使dna變性吸附在膜上； 用無(wú)關(guān)的單鏈dna，如小牛胸腺dna和鮭魚(yú)精子dna預(yù)雜交。 膜經(jīng)中和后再將標(biāo)記探針和膜放在緩沖溶液中緩緩復(fù)性，經(jīng)放射自顯影來(lái)確定陽(yáng)性菌落。2021年10月29日3時(shí)03分362021年10月29日3時(shí)03分372021年10月29日3時(shí)03分38screening a genomic library by colony hybridization.2021年10月

12、29日3時(shí)03分39限制酶切位點(diǎn)限制酶消化 除去中間片段cos lr coscos l左臂r cos右臂真核生物染色體dna限制酶部分消化 外源dna與載體dna混合 連接反應(yīng) 體外包裝 用重組噬菌體感染大腸桿菌 20 kb dna 片段 cos lr cos20 kb 外源 dna 片段 gdna文庫(kù)10/29/2021 3:03 am402021年10月29日3時(shí)03分412021年10月29日3時(shí)03分42(1)蛋白樣品的制備(2) sds-page(3)轉(zhuǎn)膜(4)封閉(5)抗體雜交及 底物顯色蛋白樣品的制備2021年10月29日3時(shí)03分441m tris-hcl(ph6.8)10 m

13、l1m dtt20 mlsds4 g甘油甘油20 ml溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)0.2 g總體積總體積100ml100mm tris-hcl(ph6.8)200mm dtt4%sds20%甘油0.2%溴酚蘭ddh2o2sds-page上樣緩沖液： 按1:1與蛋白質(zhì)樣品混合，95-100加熱5-15min，冰上冷卻后，上樣20-25l，總蛋白量20-50g。2021年10月29日3時(shí)03分46staking gelseparating gel（2）sds聚丙烯酰胺凝膠電泳2021年10月29日3時(shí)03分47濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)（3）轉(zhuǎn)膜2021年10月29日3時(shí)03分48半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)2021年10月29日3時(shí)03分49常

14、用的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移膜種類種類 微孔大小微孔大小 結(jié)合能力結(jié)合能力 特點(diǎn)特點(diǎn)ncnc膜膜0.45 um 80-100 ug/cm2應(yīng)用廣泛 20kd易丟失pvdfpvdf膜膜0.22 um0.22 um 80-100 ug/cm2170-200 ug/cm2 20kd不易丟失容量大、強(qiáng)度高尼龍膜尼龍膜 480 ug/cm2 蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)（此步可以省略）只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記a蛋白探針的western印跡過(guò)程。 2021年10月29日3時(shí)03分51（4）封閉2021年10月29日3時(shí)03分52（5）抗體結(jié)合及底物顯色2021年10月29日3時(shí)03分532021年10月29日3時(shí)03分542021年10月29日3時(shí)03分552021年10月29日3時(shí)03分56 southern northern western樣品dnarna蛋白質(zhì)限