第三章高效液相色譜法B

1、第三節(jié)第三節(jié) 高效液相色譜法的主要類高效液相色譜法的主要類型及其分離原理型及其分離原理一、液液色譜法（或稱液液分配色譜一、液液色譜法（或稱液液分配色譜法）法） 分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異( (一一) )固定相固定相 載體載體+ +固定液（物理或機(jī)械涂漬法）固定液（物理或機(jī)械涂漬法） 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實(shí)用系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實(shí)用常用的幾類載體常用的幾類載體 ：（1 1）表面多孔型載體（薄殼型微珠載體）表面多孔型載體（薄殼型微珠載體） 由直徑為由直徑為303040 40 m m的實(shí)心玻璃球和厚度約為的實(shí)心玻璃球和厚度約為

2、1 12 2 m m 的多孔性外層所組成的多孔性外層所組成 （2 2）全多孔型載體：）全多孔型載體：由硅膠、硅藻土等材料制由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑成，直徑30 30 50 50 m m 的多孔型顆粒的多孔型顆粒 （3 3）全多孔型微粒載體：）全多孔型微粒載體：由由nmnm級(jí)的硅膠微粒堆級(jí)的硅膠微粒堆積而成，又稱堆積硅珠。這種載體粒度為積而成，又稱堆積硅珠。這種載體粒度為5 5 10 10 m m 固定液固定液 由于液相色譜中，流動(dòng)相參與選擇作用，流由于液相色譜中，流動(dòng)相參與選擇作用，流動(dòng)相極性的微小變化，都會(huì)使組分的保留值動(dòng)相極性的微小變化，都會(huì)使組分的保留值出現(xiàn)較大的差異。出現(xiàn)較大的差

3、異。 液相色譜中，只需幾種不同極性的固定液即液相色譜中，只需幾種不同極性的固定液即可。如可。如,氧二丙腈（氧二丙腈（odpnodpn），聚乙二），聚乙二醇（醇（pegpeg），十八烷（），十八烷（odsods）和角鯊?fù)楣潭ㄒ海┖徒酋復(fù)楣潭ㄒ旱鹊取? (二二) )流動(dòng)相流動(dòng)相 要求流動(dòng)相對(duì)固定相的溶解度盡可能小，要求流動(dòng)相對(duì)固定相的溶解度盡可能小，因此固定液和流動(dòng)相的性質(zhì)往往處于因此固定液和流動(dòng)相的性質(zhì)往往處于兩兩個(gè)極端個(gè)極端 正相色譜正相色譜固定液極性固定液極性 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性 極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱 適于分離極性組分適于分離極性組分

4、 反相色譜反相色譜固定液極性固定液極性 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性 極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱 適于分離非極性組分適于分離非極性組分二、化學(xué)鍵合相色譜法二、化學(xué)鍵合相色譜法 （一）原理（一）原理 化學(xué)鍵合相：利用化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)共價(jià)鍵化學(xué)鍵合相：利用化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)共價(jià)鍵將有機(jī)基團(tuán)鍵合在載體（硅膠）表面，形成將有機(jī)基團(tuán)鍵合在載體（硅膠）表面，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的固定相均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的固定相 分離機(jī)制：分配分離機(jī)制：分配 + 吸附（以吸附（以llc為基礎(chǔ)）為基礎(chǔ)） 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 不易流失；不易流失； 熱穩(wěn)定性好熱穩(wěn)定性好 化學(xué)性

5、能好；化學(xué)性能好； 載樣量大載樣量大 適于梯度洗脫適于梯度洗脫 （二）固定相（二）固定相 載體：幾乎都用載體：幾乎都用硅膠硅膠。一般可分三類：一般可分三類：（1 1）疏水基團(tuán)）疏水基團(tuán) 如不同鏈長(zhǎng)的烷烴（如不同鏈長(zhǎng)的烷烴（c c8 8和和c c1818。）。）和苯基等和苯基等（2 2）極性基團(tuán)）極性基團(tuán) 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3 3）離子交換基團(tuán)）離子交換基團(tuán) 如作為陰離子交換基團(tuán)的胺如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基，季鍍鹽；作為陽(yáng)離子交換基，季鍍鹽；作為陽(yáng)離子交換 基團(tuán)的磺酸等基團(tuán)的磺酸等. .鍵合固定相的制備鍵合固定相的制備（l l）硅氧碳鍵型（硅酸酯型）（硅

6、氧碳鍵型（硅酸酯型）（si-o-c si-o-c ）鍵合）鍵合相相 最先用于液相色譜的健合固定相最先用于液相色譜的健合固定相, ,用醇與硅醇基用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應(yīng)。發(fā)生酯化反應(yīng)。 由于這類鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，由于這類鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性具有良好的傳質(zhì)特性, ,但這些酯化過(guò)的硅膠填料但這些酯化過(guò)的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇適用于不含水或醇的流動(dòng)相的流動(dòng)相（2 2）硅氮型（）硅氮型（si-n si-n ）鍵合相）鍵合相 將硅膠表面的羥基先轉(zhuǎn)化成鹵素（氯化），再與將硅膠表面的羥基先轉(zhuǎn)化成鹵素（氯化），再與

7、各種有機(jī)胺反應(yīng)，可以得到各種不同極性基因的鍵合各種有機(jī)胺反應(yīng)，可以得到各種不同極性基因的鍵合相?？捎梅菢O性或強(qiáng)極性的溶劑作為流動(dòng)相相?？捎梅菢O性或強(qiáng)極性的溶劑作為流動(dòng)相（3 3）硅碳型（）硅碳型（ si-c si-c）鍵合相）鍵合相 將硅膠表面氯化后，使將硅膠表面氯化后，使si-clsi-cl鍵轉(zhuǎn)化為鍵轉(zhuǎn)化為si-csi-c鍵。在這鍵。在這類固定相中，有機(jī)基團(tuán)直接鍵合在硅膠表面上。類固定相中，有機(jī)基團(tuán)直接鍵合在硅膠表面上。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 該反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時(shí)，必須限該反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時(shí)，必須限制制ph在在48范圍內(nèi)范圍內(nèi).（4 4）硅烷化（）硅烷化（siosiosisic c）

8、鍵合固定相）鍵合固定相 將硅膠與有機(jī)氯硅烷或烷氧基硅烷反應(yīng)制備。將硅膠與有機(jī)氯硅烷或烷氧基硅烷反應(yīng)制備。具有相當(dāng)?shù)哪蜔嵝院突瘜W(xué)穩(wěn)定性，是目前應(yīng)用最具有相當(dāng)?shù)哪蜔嵝院突瘜W(xué)穩(wěn)定性，是目前應(yīng)用最為廣泛的鍵合相。為廣泛的鍵合相。 固定相在固定相在 ph = 2ph = 28.5 8.5 范圍內(nèi)對(duì)水穩(wěn)定，有范圍內(nèi)對(duì)水穩(wěn)定，有機(jī)分子與載體間的結(jié)合牢固，固定相不易流失穩(wěn)機(jī)分子與載體間的結(jié)合牢固，固定相不易流失穩(wěn)定性好。定性好。例：例：十八烷基硅烷鍵合相（簡(jiǎn)稱十八烷基硅烷鍵合相（簡(jiǎn)稱odsods或或c c1818）：）： 是最是最常用的非極性鍵合相。它們用于反相色譜法，在常用的非極性鍵合相。它們用于反相色譜法

9、，在7070以下和以下和 ph 2ph 28 8范圍內(nèi)可正常工作范圍內(nèi)可正常工作（三）流動(dòng)相（三）流動(dòng)相 1 1、正相鍵合相色譜法、正相鍵合相色譜法 流動(dòng)相極性小于固定相極性。常用非極性溶流動(dòng)相極性小于固定相極性。常用非極性溶劑如烷烴類溶劑，樣品組分的保留值可用加入劑如烷烴類溶劑，樣品組分的保留值可用加入適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑（調(diào)節(jié)劑）的辦法調(diào)節(jié)洗脫強(qiáng)適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑（調(diào)節(jié)劑）的辦法調(diào)節(jié)洗脫強(qiáng)度。常用溶劑有：氯仿、二氯甲烷、乙腈、醇度。常用溶劑有：氯仿、二氯甲烷、乙腈、醇類等。類等。 適用于分離中等極性化合物，如脂溶性維生適用于分離中等極性化合物，如脂溶性維生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有機(jī)氯農(nóng)藥素、

10、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有機(jī)氯農(nóng)藥2 2、反相鍵合相色譜法、反相鍵合相色譜法 流動(dòng)相極性大于固定相極性，多以水或無(wú)機(jī)流動(dòng)相極性大于固定相極性，多以水或無(wú)機(jī)鹽緩沖液為主體，再加入一種能與水相混溶的鹽緩沖液為主體，再加入一種能與水相混溶的有機(jī)溶劑（有機(jī)溶劑（ 如甲醇、乙睛、四氫呋喃等）為如甲醇、乙睛、四氫呋喃等）為調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)。 固定相一般為固定相一般為c c1818、 c c8 8 應(yīng)用最廣泛應(yīng)用最廣泛 正相色譜和反相色譜正相色譜和反相色譜的差別：正相色譜和反相色譜的差別：正相色譜正相色譜反相色譜反相色譜固定相極性固定相極性大大小小流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性小至中等小至中等中至大中至大組分流出順序組分

11、流出順序極性小的組分先流出極性小的組分先流出極性大的組分先流出極性大的組分先流出流動(dòng)相極性增大流動(dòng)相極性增大保留時(shí)間變小保留時(shí)間變小保留時(shí)間變大保留時(shí)間變大分離組分分離組分油溶性或水溶性的極性油溶性或水溶性的極性和強(qiáng)極性化合物和強(qiáng)極性化合物非極性、極性或離子型非極性、極性或離子型化合物化合物三、液固色譜法（或稱吸附色譜法）三、液固色譜法（或稱吸附色譜法）（一）原理（一）原理1、分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面、分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異吸附活性中心能力的差異)1(0msrvvktt msvvkk 分離前提：分離前提：k k不等或不等或k k不等不等2、固定相

12、：與、固定相：與lc比，固定相粒徑不同（比，固定相粒徑不同（17% 17% 分配色譜分配色譜 硅膠失活硅膠失活載體載體 吸附的水吸附的水固定液固定液四、離子交換色譜法（四、離子交換色譜法（iec iec ）（一）原理（一）原理 利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來(lái)測(cè)利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來(lái)測(cè)定溶液中定溶液中陽(yáng)離子和陰離子陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法。利的一種分離分析方法。利用不同用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離來(lái)實(shí)現(xiàn)分離 適用無(wú)機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物適用無(wú)機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等

13、生物大分子。的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣因此，應(yīng)用范圍較廣rso3-h+m+rso3-m+ h+陰離子交換：陰離子交換： rnr3+cl-+x-rnr3+x-+ cl-一般形式：一般形式： r一一ab rba陽(yáng)離子交換：陽(yáng)離子交換：待測(cè)離子與離子交換樹(shù)脂固定相上待測(cè)離子與離子交換樹(shù)脂固定相上帶電荷基團(tuán)或游離的離子發(fā)生可逆帶電荷基團(tuán)或游離的離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)交換反應(yīng)（二）固定相（二）固定相 種類種類陽(yáng)離子交換樹(shù)脂陽(yáng)離子交換樹(shù)脂強(qiáng)酸性強(qiáng)酸性弱酸性弱酸性陰離子交換樹(shù)脂陰離子交換樹(shù)脂強(qiáng)堿性強(qiáng)堿性弱堿性弱堿性nr2nhrnh2n (ch3)3xnc2h4oh(ch3

14、)2x-so3hcooh-po3h（三）流動(dòng)相（三）流動(dòng)相 通常是鹽類的緩沖溶液通常是鹽類的緩沖溶液 改變改變 流動(dòng)相的流動(dòng)相的 phph 緩沖劑（平衡離子）的類型緩沖劑（平衡離子）的類型 離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度 加入有機(jī)溶劑、配位劑等加入有機(jī)溶劑、配位劑等 常用的緩沖劑有：常用的緩沖劑有：磷酸鹽、乙酸鹽、檸磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、氨水等檬酸鹽、甲酸鹽、氨水等 五、離子對(duì)色譜法五、離子對(duì)色譜法 離子對(duì)色譜法是將一種（或數(shù)種）與離子對(duì)色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對(duì)離子或反溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶離子）加到流動(dòng)相或固定相中

15、，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對(duì)，從而控制溶質(zhì)離質(zhì)離子結(jié)合形成離子對(duì)，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。子保留行為的一種色譜法。離子對(duì)形成機(jī)理離子對(duì)形成機(jī)理 把和被測(cè)物把和被測(cè)物離子離子a a電荷相反的電荷相反的離子離子b b（對(duì)離子或反離子）加入到流動(dòng)相中，（對(duì)離子或反離子）加入到流動(dòng)相中，使待測(cè)使待測(cè)離子離子a a與與反離子反離子b b形成形成abab，該，該abab離子對(duì)離子對(duì)的性質(zhì)與的性質(zhì)與a a離子離子或或b b離子離子的性質(zhì)不同，即間接改變了待測(cè)離子的的性質(zhì)不同，即間接改變了待測(cè)離子的保留特性。保留特性。 有機(jī)相有機(jī)相水相水相水相水相baba離子對(duì)試劑離子對(duì)試劑 用于陰離子分離的

16、對(duì)離子：用于陰離子分離的對(duì)離子： 烷基銨類，烷基銨類，如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲基銨等基銨等 用于陽(yáng)離子分離的對(duì)離子：用于陽(yáng)離子分離的對(duì)離子：烷基磺酸類，烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉如己烷磺酸鈉 固定相和流動(dòng)相固定相和流動(dòng)相 性質(zhì)同鍵合相色譜，選擇不同的離子性質(zhì)同鍵合相色譜，選擇不同的離子對(duì)試劑可以分離酸、堿和離子、非離子的對(duì)試劑可以分離酸、堿和離子、非離子的混合物混合物 六、離子色譜法六、離子色譜法 以離子交換樹(shù)脂為固定相，電解質(zhì)溶液為以離子交換樹(shù)脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相，通常以電導(dǎo)檢測(cè)器為通用檢測(cè)器。流動(dòng)相，通常以電導(dǎo)檢測(cè)器為通用檢測(cè)器。 對(duì)

17、對(duì)離子型化合物的離子型化合物的分析，離子色譜法是目分析，離子色譜法是目前唯一能獲得快速、靈敏、準(zhǔn)確和多組分效果前唯一能獲得快速、靈敏、準(zhǔn)確和多組分效果的方法，檢測(cè)手段已擴(kuò)展到電導(dǎo)檢測(cè)器之外的的方法，檢測(cè)手段已擴(kuò)展到電導(dǎo)檢測(cè)器之外的其它類型的檢測(cè)器，如電化學(xué)檢測(cè)器，紫外光其它類型的檢測(cè)器，如電化學(xué)檢測(cè)器，紫外光度檢測(cè)器?？煞治龅碾x子從無(wú)機(jī)和有機(jī)陰離子度檢測(cè)器?？煞治龅碾x子從無(wú)機(jī)和有機(jī)陰離子到金屬陽(yáng)離子，從有機(jī)陽(yáng)離子到糖類、氨基酸到金屬陽(yáng)離子，從有機(jī)陽(yáng)離子到糖類、氨基酸等均可用離子色譜法進(jìn)行分析。等均可用離子色譜法進(jìn)行分析。七、空間排阻色譜法七、空間排阻色譜法（一）分離原理（一）分離原理凝膠內(nèi)具有

18、一定凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴大小的孔穴小分子可完全滲透入內(nèi)，最小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱后洗出色譜柱中等體積的分中等體積的分子部分滲透子部分滲透體積大的分子不能滲透到孔穴中去體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)而被排阻，較早地被淋洗出來(lái) 固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)凝膠凝膠, ,類似于分子篩，類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。這樣，樣品分子基本上按其分子大但孔徑比分子篩大。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。小，排阻先后由柱中流出。（二）固定相凝膠（二）固定相凝膠 凝膠是含有大量液體（一般為水）的柔軟而富凝膠是含有大量液體（一般

19、為水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)而具有立體網(wǎng)于彈性的物質(zhì)，是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。狀結(jié)構(gòu)的多聚體。 軟質(zhì)凝膠軟質(zhì)凝膠分類分類 半硬質(zhì)凝膠半硬質(zhì)凝膠 硬質(zhì)凝膠硬質(zhì)凝膠1 1、軟質(zhì)凝膠、軟質(zhì)凝膠種類：種類：如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)交聯(lián)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：特點(diǎn)： 微孔能吸入大量的溶劑，并能溶漲到它干微孔能吸入大量的溶劑，并能溶漲到它干體的許多倍體的許多倍 適用于水溶性溶劑作流動(dòng)相，一般用于小適用于水溶性溶劑作流動(dòng)相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜在高效液相色譜分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜在高效液相色譜中。中。2 2、半硬

20、質(zhì)凝膠（有機(jī)凝膠）、半硬質(zhì)凝膠（有機(jī)凝膠）種類：種類：如苯乙烯二乙烯苯交聯(lián)共聚物凝膠如苯乙烯二乙烯苯交聯(lián)共聚物凝膠特點(diǎn)：特點(diǎn)：能耐較高壓力，適用于有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，能耐較高壓力，適用于有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，有一定可壓縮性，可填得緊密，柱效較高。缺有一定可壓縮性，可填得緊密，柱效較高。缺點(diǎn)：在有機(jī)溶劑中有輕度膨脹。點(diǎn)：在有機(jī)溶劑中有輕度膨脹。 3 3、硬質(zhì)凝膠（無(wú)機(jī)凝膠）、硬質(zhì)凝膠（無(wú)機(jī)凝膠） 是具有一定孔徑范圍的多孔性凝膠，如多孔是具有一定孔徑范圍的多孔性凝膠，如多孔硅膠、多孔玻璃珠等硅膠、多孔玻璃珠等 凝膠化學(xué)惰性、穩(wěn)定性及機(jī)械強(qiáng)度均好，耐凝膠化學(xué)惰性、穩(wěn)定性及機(jī)械強(qiáng)度均好，耐高溫，使用壽命長(zhǎng)，

21、但裝柱時(shí)易碎，不易裝高溫，使用壽命長(zhǎng)，但裝柱時(shí)易碎，不易裝緊，柱效較低。緊，柱效較低。（三）流動(dòng)相（三）流動(dòng)相選擇依據(jù)（從樣品的溶解性考慮）選擇依據(jù)（從樣品的溶解性考慮） 流動(dòng)相應(yīng)與凝膠本身有相似性流動(dòng)相應(yīng)與凝膠本身有相似性 黏度低黏度低 與樣品的折光率相差大與樣品的折光率相差大 能潤(rùn)濕凝膠，防止吸附作用能潤(rùn)濕凝膠，防止吸附作用 常用的流動(dòng)相有四氫呋喃、甲苯、常用的流動(dòng)相有四氫呋喃、甲苯、n n，n-n-二甲二甲基甲酸胺、三氯甲烷（凝膠滲透色譜）；水（凝基甲酸胺、三氯甲烷（凝膠滲透色譜）；水（凝膠過(guò)濾色譜）等。膠過(guò)濾色譜）等。第四節(jié)第四節(jié) 液相色譜法流動(dòng)相液相色譜法流動(dòng)相一、流動(dòng)相選擇的一般要

22、求一、流動(dòng)相選擇的一般要求 1 1、流動(dòng)相的純度、流動(dòng)相的純度 2 2、流動(dòng)相與固定相不互溶，不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、流動(dòng)相與固定相不互溶，不發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 3 3、對(duì)試樣要有適宜的溶解度、對(duì)試樣要有適宜的溶解度 4 4、必須與檢測(cè)器匹配、必須與檢測(cè)器匹配 5 5、溶劑的粘度要小，可以降低色譜柱的阻力、溶劑的粘度要小，可以降低色譜柱的阻力 二、常用溶劑的極性二、常用溶劑的極性 常用溶劑的極性順序?yàn)椋撼Ｓ萌軇┑臉O性順序?yàn)椋?水（極性最大）水（極性最大）、甲酰胺、甲酰胺、乙腈、甲醇、乙腈、甲醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃、醋酸乙酯、乙醚、丙醇、丙酮、四氫呋喃、醋酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、環(huán)己烷、己烷、二氯甲烷

23、、氯仿、環(huán)己烷、己烷、 三、流動(dòng)相的選擇三、流動(dòng)相的選擇 根據(jù)流動(dòng)相所起的作用，可以把溶劑分為根據(jù)流動(dòng)相所起的作用，可以把溶劑分為底劑底劑和和洗脫劑洗脫劑兩種兩種 底劑底劑決定基本的色譜分離情況決定基本的色譜分離情況 洗脫劑洗脫劑則是為了調(diào)節(jié)試樣組分的滯留并對(duì)某幾則是為了調(diào)節(jié)試樣組分的滯留并對(duì)某幾個(gè)組分具有選擇性的分離作用個(gè)組分具有選擇性的分離作用 1 1、鍵合相色譜法、鍵合相色譜法正相色譜：正相色譜：底劑底劑采用低極性溶劑，如正己烷、苯、氯仿等；采用低極性溶劑，如正己烷、苯、氯仿等；洗脫劑洗脫劑則根據(jù)試樣的性質(zhì)，有針對(duì)性地選擇極性則根據(jù)試樣的性質(zhì)，有針對(duì)性地選擇極性較強(qiáng)的溶劑如醚、酯、酮、醇

24、和酸等；較強(qiáng)的溶劑如醚、酯、酮、醇和酸等；反相色譜中：反相色譜中： 以水為流動(dòng)相的主體，以加入不同配比的有以水為流動(dòng)相的主體，以加入不同配比的有機(jī)溶劑作調(diào)節(jié)劑。常用的有機(jī)溶劑是甲醇、乙機(jī)溶劑作調(diào)節(jié)劑。常用的有機(jī)溶劑是甲醇、乙腈、二氧六環(huán)、四氫呋喃等腈、二氧六環(huán)、四氫呋喃等2 2、離子交換色譜法、離子交換色譜法 離子交換色譜法在含水介質(zhì)中進(jìn)行離子交換色譜法在含水介質(zhì)中進(jìn)行 組分的保留值可用流動(dòng)相中鹽的濃度組分的保留值可用流動(dòng)相中鹽的濃度（或離子強(qiáng)度）和（或離子強(qiáng)度）和phph來(lái)控制，增加鹽來(lái)控制，增加鹽的濃度導(dǎo)致保留值降低。的濃度導(dǎo)致保留值降低。3 3、排阻色譜法、排阻色譜法 排阻色譜法所用的溶

25、劑必須與凝膠本身非常排阻色譜法所用的溶劑必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤(rùn)濕凝膠并防止吸附作用。相似，這樣才能潤(rùn)濕凝膠并防止吸附作用。 對(duì)分離高分子有機(jī)化合物，采用的溶劑主要對(duì)分離高分子有機(jī)化合物，采用的溶劑主要是四氫呋喃、甲苯、間甲苯酚、是四氫呋喃、甲苯、間甲苯酚、n,n-n,n-二甲基甲二甲基甲酰胺等酰胺等 生物物質(zhì)的分離主要用水、緩沖鹽溶液、乙醇生物物質(zhì)的分離主要用水、緩沖鹽溶液、乙醇及丙酮等及丙酮等 第五節(jié)第五節(jié) 色譜分離條件選擇色譜分離條件選擇一、一、 減小柱內(nèi)展寬，提高柱效減小柱內(nèi)展寬，提高柱效l l、固定相、固定相 選粒徑小的、分布均勻的球形固定相選粒徑小的、分布均勻的球形固定相

26、 首選化學(xué)鍵合相，勻漿法裝柱首選化學(xué)鍵合相，勻漿法裝柱2 2、流動(dòng)相、流動(dòng)相 選用低粘度的流動(dòng)相，有利于增大組選用低粘度的流動(dòng)相，有利于增大組分在溶劑中的擴(kuò)散系數(shù)分在溶劑中的擴(kuò)散系數(shù)dmdm，減少傳質(zhì)阻力，減少傳質(zhì)阻力 例：甲醇、乙腈等例：甲醇、乙腈等3 3、 流速流速 約約1ml/min1ml/min4 4、柱溫的選擇：、柱溫的選擇： 選室溫選室溫25250 0c c左右左右二、減少柱外展寬二、減少柱外展寬1 1、柱前展寬：、柱前展寬： 主要由進(jìn)樣引起，減小進(jìn)樣器的死體積主要由進(jìn)樣引起，減小進(jìn)樣器的死體積 2 2、柱后展寬：、柱后展寬： 主要由接管、檢測(cè)器流通池體積及檢測(cè)器響主要由接管、檢測(cè)

27、器流通池體積及檢測(cè)器響應(yīng)時(shí)間等因素所引起應(yīng)時(shí)間等因素所引起22114kknr ucah流動(dòng)相流動(dòng)相采用粘度小、低流速的采用粘度小、低流速的勻的固定相勻的固定相：采用粒度小、填充均：采用粒度小、填充均n12121212rrrrvvttkkkk溫影響?。┵|(zhì)和固定相性質(zhì)（受柱：調(diào)整流動(dòng)相種類、性0ttvvkvcvcwwkrmsmmssms?。┑呐浔龋ㄊ苤鶞赜绊戄^：調(diào)整流動(dòng)相和固定相k三、分離類型的選擇三、分離類型的選擇1 1、分析的、分析的目的目的是什么是什么 2 2、分析對(duì)象、分析對(duì)象性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)是什么？是什么？3 3、分析樣品的、分析樣品的復(fù)雜程度復(fù)雜程度，大概有，大概有多少種多少種

28、組分組分4 4、樣品、樣品量量、樣品的、樣品的形態(tài)形態(tài)5 5、要求的、要求的檢測(cè)限、測(cè)定限、靈敏度、分析時(shí)間檢測(cè)限、測(cè)定限、靈敏度、分析時(shí)間6 6、有無(wú)分析、有無(wú)分析實(shí)例和標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)例和標(biāo)準(zhǔn)樣品以及以及相關(guān)分析資料相關(guān)分析資料7 7、實(shí)驗(yàn)設(shè)備實(shí)驗(yàn)設(shè)備情況情況液相色譜分離類型選擇參考表液相色譜分離類型選擇參考表第六節(jié)第六節(jié) 高效液相色譜法的應(yīng)用高效液相色譜法的應(yīng)用一、在食品分析中的應(yīng)用一、在食品分析中的應(yīng)用1 1、食品營(yíng)養(yǎng)成分分析：蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、食品營(yíng)養(yǎng)成分分析：蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機(jī)酸（鄰苯二甲酸、色素、維生素、香料、有機(jī)酸（鄰苯二甲酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸等）、有機(jī)

29、胺、礦物質(zhì)等；檸檬酸、蘋(píng)果酸等）、有機(jī)胺、礦物質(zhì)等；2 2、食品添加劑分析：甜味劑、防腐劑、著色劑、食品添加劑分析：甜味劑、防腐劑、著色劑（合成色素如檸檬黃、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、（合成色素如檸檬黃、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)等）、抗氧化劑等；日落黃、亮藍(lán)等）、抗氧化劑等；3 3、食品污染物分析：霉菌毒素（黃曲霉毒素、食品污染物分析：霉菌毒素（黃曲霉毒素、黃桿菌毒素、大腸桿菌毒素等）、微量元素、黃桿菌毒素、大腸桿菌毒素等）、微量元素、多環(huán)芳烴等。多環(huán)芳烴等。 二、在環(huán)境分析中的應(yīng)用二、在環(huán)境分析中的應(yīng)用 多環(huán)芳烴（特別是稠環(huán)芳烴）、農(nóng)藥（如氨多環(huán)芳烴（特別是稠環(huán)芳烴）、農(nóng)藥（如氨基甲酸脂類，反相色譜）殘留等。基甲酸脂類，反相色譜）殘留等。三、在生命科學(xué)中的應(yīng)用三、在生命科學(xué)中的應(yīng)用1 1、低分子量物質(zhì)，如氨基酸、有機(jī)酸、有機(jī)胺、低分子量物質(zhì)，如氨基酸、有機(jī)酸、有機(jī)胺、類固醇、卟啉、糖類、維生素等的分離和測(cè)定。類固醇、卟啉、糖類、維生素等的分離和測(cè)定。2 2、高分子量物質(zhì)，如多肽、核糖核酸、蛋白質(zhì)、高分子量物質(zhì)，如多肽、核糖核酸、蛋白質(zhì)和酶（各種胰島素、