選擇性剪接中的剪接模式

1、選擇性剪接中的剪接模式 有幾種不同的剪接模式（見圖1-1）1，6。最常見的模式是在成熟的mrna中跳過外顯子，使其包括或者剔除盒式外顯子（也稱為跳過的外顯子）。跳過外顯子的一個著名的例子是果蠅性別致死的基因（sxl），這是一個由性別決定的轉變。跳過sxl基因的第3外顯子，可以保持雌性的分化。sxl的第3外顯子包含一個早提前的終止密碼子，這個外顯子的存在合成出截短的、也有可能是非功能的蛋白質7，8。另一個剪接模式是外顯子互斥，這使得兩個相鄰外顯子中，僅有一個出現(xiàn)在最終產(chǎn)物中。人類成纖維細胞生長因子受體二號（fgfr-2）基因含有外顯子iiib和iiic，這兩者是互斥的。從外顯子iiib

2、得到的的基因產(chǎn)物，具有比纖維細胞生長因子低得多的聚合吸引力9。  不僅可以作用于整個外顯子，不同的剪接方式也可以只剪接外顯子的某一部分。5'或3'選擇性剪接位點的選擇，通過加上、或者不加上與外顯子側面相連的支鏈而生成，從而造成多樣性。果蠅無子（fru）和雙性別（dsx）基因包含了雌性特有的選擇性剪接位點，前者在5端，而后者在3'端。由于選擇性剪接位點的不同，造成支鏈的細小差異10，11。 選擇性剪接可發(fā)生在轉錄體的任意一端。選擇性終止外顯子不僅改變最后一個外顯子的包含性，而且還影響聚腺苷酸化位點的選擇。在許多情況下，它可以在最后的外顯子中生

3、成提前的終止密碼子，并且生成功能性截短的多肽或者產(chǎn)生無意義介導衰變（nmd，即，由于終止密碼子位于最后外顯子與外顯子的結點上游超過50-55堿基對處，從而造成的mrna的降解）2，12，13。鈣調節(jié)激素（降鈣素）基因包括6個外顯子。成熟的的降鈣素轉錄體包括前四個外顯子，并使用位于第4外顯子上的多聚腺苷酸化位點，從而生成甲狀腺c細胞中超過98%的基因產(chǎn)物。同時，在大腦和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，通過將前三個、第五和第六個外顯子編碼成降鈣素相關肽的前體，并利用下游的腺苷酸化位點（cgrp），從而產(chǎn)生差異14，15。同樣，選擇性啟動子的使用使得可以選擇不同的轉錄啟動子，這樣通常會影響到第一個外顯子。盡管人們普

4、遍將其當作轉錄調控，選擇性啟動子的使用和選擇性剪接有很大的關聯(lián)。人們已經(jīng)觀察到，有選擇性啟動子的基因更容易進行選擇性剪接，同時，選擇性啟動子的數(shù)量與不同選擇性的剪接方式的數(shù)量正相關16。鼠標單羧酸轉運蛋白二號（mct2）基因有幾種選擇性的啟動子，由此形成五種獨特的首外顯子（1a - 1e）。外顯子1c用于各種組織中，而其他的外顯子則是有組織特異性的17。 除此以外，內含子同樣可以參與選擇性剪接。在內含子保留性中，整個內含子可以被包括或排除。對于人類來說，這種模式是罕見的1。然而，最近的研究表明，在已知的人類基因中，這個頻率比想象中要高得多（約15）18。內含子的保留性在植物中比在其他

5、真核生物中常見19。例如，對于擬南芥，50以上的案例都是關于內含子保留性的20。人類fosb（fbj 小鼠骨肉瘤病毒致癌基因對等質b）基因的最后一個外顯子包含一個140堿基對的序列，它可以剪接出來，產(chǎn)生一個截斷的產(chǎn)物fosb。通過觀察動物長期的藥物依賴性，檢測fosb的表達21。 基本剪接機制無論是選擇性還是組成型剪接，用的都是同一種基本剪接機制，稱為剪接體。剪接體識別和選擇的剪接位點（外顯子和內含子的結點），同時，催化打破并重組rna鏈。剪接體主要由五個小核核糖核蛋白（snrnp）u1，u2，u4，u5和u6組成。其中包括尿苷豐富的小核rna和多種蛋白質。它們能識別前體mrna上的

6、剪接信號，并與其他輔助剪接因子交互22-24。 在剪接中，三個保留序列元素是必須的。這些保留序列元素可以是經(jīng)典或異常的剪接節(jié)點，多嘧啶束和分支點（見圖1-2）22，23。剪接位點含有包括外顯子和內含子結點的短序列。gu和ag二核苷酸在外顯子的5'和3'端通常來說是分別不變的。在剪接結合中，這種類型的gu-ag對被稱為經(jīng)典剪接位點。它存在于超過98%的哺乳動物基因組中25。異常的剪接位點含有如gc-ag、at-ac之類的二核苷酸對，at-ac等。這種情況比較罕見。多嘧啶束是指位于內含子的3端，且緊鄰3剪接位點的uc豐富的片段。這是幾種剪接因子的結合位點，如u2 snrn

7、p輔助因子（u2af）和多嘧啶束結合蛋白（ptb）26。分支點（也稱為分支位點）位于多嘧啶束的上游。對于人和老鼠來說，分支點和3'剪接結點間的平均距離大約是30至40個堿基對27。雖然分支點序列在哺乳動物中是可變的 ，分支點的突變可以促使由組成型剪接到選擇性剪接的轉變27。 剪接體由一種被稱為剪接體循環(huán)的連續(xù)方式組成。其中包括識別、添加、重排和釋放小核核糖核蛋白（見圖1-2）。u1是第一個加入剪接體的的小核核糖核蛋白，并結合5'剪接位點。接下來，u2小核核糖核蛋白被u2af結合到分支結點上。接著，u4/u5/u6三小核核糖核蛋白加入到預剪接體中。在蛋白質和rna的重排

8、后，催化型剪接體形成了，并催化兩個酯交換反應，在剪接為點上進行剪接和重組。束狀的外顯子和套索狀的內含子然后依次按照順序釋放。此后，剪接體變得不穩(wěn)定，因此解離。所有的小核核糖核蛋白可以在之后新的剪接體循環(huán)中重新使用22-24。 選擇性剪接的生物學作用選擇性剪接在許多不同的生物體中有關鍵作用。敲除小鼠體內調節(jié)選擇性剪接的許多剪接因子基因會導致胚胎致死或嚴重的失調28。剪接因子的過度表達也有有害的影響。人們在許多種腫瘤的觀察中發(fā)現(xiàn)，癌癥和許多剪接因子的過度表達是有關聯(lián)的29。作為一種轉錄后基因調控的主要方式，它在不同的階段參與細胞的分化與細胞死亡的過程。在大腦的發(fā)育中，一種未知的基因開關影

9、響一個剪接因子，多嘧啶束結合蛋白（ptb），將其替換為相近的旁系同源體，神經(jīng)中樞多嘧啶束結合蛋白（nptb）。這將改變眾多剪接靶基因的剪接方式，以及ptb/nptb和其他剪接因子，最終影響細胞分化，決定細胞是神經(jīng)元還是非神經(jīng)元的命運30，31。大量的細胞凋亡因子同樣通過選擇性剪接調控，比如腫瘤壞死因子的膜相關死亡信號受體（tnf），fas基因，bcl-2基因族，ced-4基因族，細胞凋亡蛋白酶族32-34。bcl-x是bcl-2族的一員。bcl-x基因包含3個外顯子。四個bcl-2同源（bh）域，bh1到bh4，位于第2外顯子上。長版的bcl-x l包含整個第2外顯子（因此包括所有四個bh域）

10、，從而抑制細胞凋亡。短亞型中的一種bcl-x s使用第2外顯子上的選擇性5'剪接位點，缺失了bh1和2。bcl-x s拮抗由bcl-x l產(chǎn)生的細胞凋亡抑制，從而導致細胞死亡。bcl-x l在有長壽命有絲分裂后期細胞的組織中表達較多，列入成年人的腦細胞，然而，bcl-x s大多在經(jīng)歷過渡期的細胞中找到，例如正在發(fā)育的淋巴細胞33，35，36。 通過選擇性剪接的轉錄后基因調控通常有兩種方式。首先，通過無意義介導衰變（nmd），使得基因表達的數(shù)量降低。在選擇性剪接中，內含子保留和蛋白質編碼區(qū)域的骨架變化，很容易產(chǎn)生帶有可翻譯終止密碼子的轉錄體。正常的終止密碼子通常屬于最后一個外顯

11、子，而不是跟著外顯子和外顯子的結點。然而，在外顯子和外顯子的結合點上游超過50-55堿基對處有提前的終止密碼子的轉錄體，容易產(chǎn)生無意義介導衰變13。沒有充足的證據(jù)說明，無意義介導衰變形成的選擇性剪接異構體揭示了那些擁有提前的終止密碼子的不正常的轉錄體通常從轉錄池中被移除37，38。退化通常發(fā)生在細胞核中39，40。據(jù)估計，大約三分之一的人類基因選擇性剪接 通過無意義介導衰變的形式退化41。在人類和老鼠保留的的五分之一被跳過的外顯子中，至少有一種異構體因為無意義介導衰變而退化37。其次，選擇性剪接可以選擇性地包含可以編碼出活性蛋白域的外顯子，從而改變基因功能。在關于人類的1300個選擇性剪接案例

12、的大規(guī)模的研究中，在不同的mrna異構體中，30的基因顯示出不同的保留域42。最后，五十種常見的選擇性剪接蛋白域中的大多數(shù)都與蛋白質和蛋白質的相互作用有關43。  選擇性剪接也是蛋白質多樣性的一個主要來源。不是一個基因對應一種蛋白質，蛋白質的數(shù)量遠遠比基因數(shù)量大。在許多高等真核生物中，人們已經(jīng)觀察到，一種基因可能有幾十，甚至上千種功能性產(chǎn)物，比如人體內的鈣激活鉀離子通道和橋粒鈣黏著蛋白44。一個極端的例子是果蠅dscam基因，人類唐氏綜合癥細胞黏附分子的同源體，可能會產(chǎn)生超過38,000異形體45。通過調整和映射到基因組序列，許多表達序列標簽被發(fā)現(xiàn)，來代替相同基因的不同部分

13、，用以指示選擇性剪接的mrna轉錄體的存在。44。此外，蛋白質組學研究也表明，大多數(shù)選擇性剪接的轉錄體實際上可以表達為足夠檢測數(shù)量的蛋白質46。因此，通過選擇性剪接，一個相對較小的基因組，可以有效地產(chǎn)生大量的蛋白質。選擇性剪接調控機制在選擇性剪接中，剪接位點識別的調控是一個復雜的、和許多因素相關的動態(tài)平衡。調控分為兩大類，反式調節(jié)蛋白與順式作用元素，通常是在調控的關鍵。還有其他的序列信號的參與，如外顯子/內含子長度和核心剪接信號1。 反式剪接因子反式剪接因子是參與（選擇性）剪接和剪接調控的蛋白質。一般來說，剪接因素包括剪接體合成中的核心剪接因子，例如小核核糖核蛋白和u2af。但是，這

14、些因素一般不直接關系到選擇性剪接調控。因此，我們只討論非小核核糖核蛋白的蛋白質在剪接調控中的作用。 剪接因子可分為三大類：富絲氨酸/精氨酸蛋白族，不均核糖核蛋白族和其他蛋白質47。富絲氨酸/精氨酸（sr）蛋白族是研究反式作用因子族的最好例子。它由一些可標記的保留剪接因子組成（見表4-2）。sr族成員通常有兩個保留模型：在n末端有一到兩個rna的識別圖案（rrm），在c末端有帶有可選性絲氨酸和精氨酸的富精氨酸/絲氨酸rs域。rrm決定rna結合的特異性。rs域將其他組件添加到基本剪接機制中，并域分支位點和5剪接位點作用48-50。一般來說，在組成型和選擇性剪接中，在前體mrna上的sr蛋白質合成，促進外顯子的包容。科學家已經(jīng)提出了幾種模型，用以解釋s