實驗五原核表達

1、實驗五實驗五 原核原核表達表達一、原理一、原理v1、 e.colie.coli表達系統(tǒng)表達系統(tǒng)ve.colie.coli是重要的原核表達體系。在重是重要的原核表達體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入組基因轉(zhuǎn)化入e.colie.coli 菌株以后，通過菌株以后，通過溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達目的蛋白質(zhì)，將表達樣品進行目的蛋白質(zhì)，將表達樣品進行sds-sds-page page 以檢測表達蛋白質(zhì)以檢測表達蛋白質(zhì)。v本實驗采用異丙基硫代本實驗采用異丙基硫代-d-d-半乳糖半乳糖昔（昔（iptgiptg）誘導(dǎo)外源基因表達）誘導(dǎo)外源基因表達2.sds-2.sds-聚丙烯酰胺凝膠電

2、泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-pagesds-page） 使用含有十二烷基硫酸鈉（使用含有十二烷基硫酸鈉（ sdssds）和還原劑）和還原劑（通常為巰基乙醇）的樣品處理液對蛋白質(zhì)樣（通常為巰基乙醇）的樣品處理液對蛋白質(zhì)樣品進行處理（一般煮沸品進行處理（一般煮沸3-53-5分鐘），通過加熱分鐘），通過加熱和和sdssds可以使蛋白質(zhì)變性，多亞基的蛋白質(zhì)也可以使蛋白質(zhì)變性，多亞基的蛋白質(zhì)也將解離為單亞基。將解離為單亞基。vsdssds是變性劑，它能破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵是變性劑，它能破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用。巰基乙醇打開二硫鍵，因此使和疏水作用。巰基乙醇打開二硫鍵，因此使蛋白質(zhì)分子處于伸

3、展?fàn)顟B(tài)。蛋白質(zhì)分子處于伸展?fàn)顟B(tài)。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點結(jié)構(gòu)上的特點 蛋白質(zhì)在電場中的遷移率取決于它所帶的蛋白質(zhì)在電場中的遷移率取決于它所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素。凈電荷以及分子大小和形狀等因素。加入加入sdssds（十二烷基磺酸鈉）和少量巰基乙（十二烷基磺酸鈉）和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于它醇，則蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于它的的分子量，而與原來所帶電荷、分子形狀分子量，而與原來所帶電荷、分子形狀無關(guān)。無關(guān)。電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒子滯

4、后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒?；旌蠘悠坊旌蠘悠穾Э啄z帶孔膠 按分子按分子大小分離大小分離電泳方向電泳方向 電泳電泳 小分子小分子大分子大分子二、試劑二、試劑vlb培養(yǎng)基培養(yǎng)基 vsoc培養(yǎng)液培養(yǎng)液 v50 g/ml ampviptg vsds-page loading buffer sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳：試劑聚丙烯酰胺凝膠電泳：試劑v30%丙烯酰胺凝膠貯液丙烯酰胺凝膠貯液： 丙烯酰胺30 g， n, n-亞甲雙丙烯酰胺 0.8 gv4triscl/sds ph 8.8：18.2 g tris堿溶解于40 ml水中，用1 mol/l的鹽酸調(diào)ph為8.8后，定容到100 ml，

5、再加0.4 g sds。v4triscl/sds ph 6.8：6.05 g tris堿溶解于40 ml水中，用1 mol/l的鹽酸調(diào)ph為6.8后，定容到100 ml，再加0.4 g sds。v樣品緩沖液：樣品緩沖液：1 ml 4triscl/sds(ph 6.8)，1 g sds，2 ml -巰基乙醇，巰基乙醇，1 ml 0.1%溴酚蘭，溴酚蘭，5 ml 甘油，加蒸餾水定容甘油，加蒸餾水定容到到50 ml。v電極緩沖液：電極緩沖液：0.6 g tris堿，堿，2.88 g甘氨酸甘氨酸，0.1 g sdsv固定液固定液：50%甲醇，甲醇，10%冰醋酸冰醋酸v染色液：染色液：0.05%(w/v

6、)考馬斯亮藍考馬斯亮藍r-250，50%甲醇，甲醇，10%冰醋酸冰醋酸v脫色液：脫色液：7%冰醋酸，冰醋酸，5%甲醇甲醇 三、設(shè)備三、設(shè)備四、步驟四、步驟v1. e. coli bl21 (de3) 感受態(tài)的制備感受態(tài)的制備v2. 重組子轉(zhuǎn)化重組子轉(zhuǎn)化bl21v1）在預(yù)冷的）在預(yù)冷的ep管中加入管中加入1 l質(zhì)粒質(zhì)粒dna，加入，加入200 l bl21 (de3)感受態(tài)細胞，混勻后在冰浴感受態(tài)細胞，混勻后在冰浴上靜置上靜置30 min。v2） 42水浴熱沖擊水浴熱沖擊30 s，冰浴上放置，冰浴上放置10 min，加入加入0.8 ml soc培養(yǎng)液。置于培養(yǎng)液。置于37 振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)1 h

7、。v3） 取取0.1 ml涂布于加有抗生素的涂布于加有抗生素的lb培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基平板（50 g/ml amp）上，）上，37 培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)過夜。 3.3.原核表達原核表達v1)挑取上述方法得到的單菌落于挑取上述方法得到的單菌落于2 ml lb液液體培養(yǎng)基體培養(yǎng)基(氨芐青霉素氨芐青霉素50 g/ml)中。同時，中。同時，bl21作為對照（不加抗生素）。于作為對照（不加抗生素）。于37培養(yǎng)培養(yǎng)至至od600為為 0.5. v2)取取20 l菌液接種菌液接種2 ml lb液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基(氨氨芐青霉素芐青霉素50 g/ml), 37培養(yǎng)培養(yǎng)od600為為 0.5，v3)加入加入iptg最終濃

8、度梯度最終濃度梯度2mm ，18誘導(dǎo)誘導(dǎo)表達表達16h。v4)誘導(dǎo)結(jié)束后，用超聲波破碎細胞。誘導(dǎo)結(jié)束后，用超聲波破碎細胞。v5）1ml菌液加入菌液加入100l的的sds-page loading buffer，100煮沸煮沸5min。v6）?。┤?0l上清樣品點樣，分析上清樣品點樣，分析sds-page膠，觀察表達結(jié)果。膠，觀察表達結(jié)果。4.sds-pagev1) 1) 按下表配方制備按下表配方制備sds-pagesds-page凝膠，凝膠，加樣。先加樣。先10 ma10 ma恒流電泳至分離膠，恒流電泳至分離膠，再調(diào)為再調(diào)為15 ma15 ma恒流到電泳結(jié)束。恒流到電泳結(jié)束。sds-pagesds-page膠配方膠配方組分組分 12%分離膠分離膠(ml) 3.9%濃縮膠濃縮膠(ml) 丙烯酰胺貯液丙烯酰胺貯液 60.654triscl/sds, ph 8.83.754triscl/sds, ph 6.8 1.25ddh2o5.253.0510%過硫酸銨過硫酸銨 0.050.025temed 0.010.005v2) 考馬斯亮藍染色考馬斯亮藍染色v（1）：將聚丙烯酰胺凝膠用固定液固定）：將聚丙烯酰胺凝膠用固定液固定2