浸礦微生物群落基因組芯片的構(gòu)建與評估及其在酸性環(huán)境中的應(yīng)用

1、浸礦微生物群落基因組芯片的構(gòu)建與評估及其在酸性環(huán)境中的應(yīng)用采礦活動使金屬硫化礦大量暴露于地表 , 經(jīng)過自然與生物的氧化作用導(dǎo)致酸 性礦坑水AMD的產(chǎn)生,并造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。酸性礦坑水通常含有高濃度的金 屬離子與硫酸鹽，在AMD這樣的極端環(huán)境中仍然生存著多種微生物。這些微生物主要是細(xì)菌與古菌，它們的活動促進(jìn)AMD勺形成，同時這些微生 物對金屬的生物浸出以及環(huán)境的生物治理也具有重要的意義。 理解微生物群落的 結(jié)構(gòu),組成和環(huán)境適應(yīng)性有助于闡述微生物與礦石以及 AMD環(huán)境的生物與非生物 因素之間的內(nèi)在聯(lián)系。AMD境相比許多生態(tài)環(huán)境更加簡單，這使得我們可以更加深入地研究微生 物群落結(jié)構(gòu)和功能與地理化學(xué)

2、變量之間的關(guān)系。生物浸出過程中 , 微生物群落組 成以及種群比例受礦石種類與浸出條件影響較大。因此, 研究酸性礦坑水中的微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能活動具有重要的意義。本文利用基因芯片技術(shù)對微生物群落的多樣性進(jìn)行了研究。構(gòu)建并評估了適用于微生物群落結(jié)構(gòu)解析的群落基因組芯片 , 優(yōu)化了芯片雜 交檢測的技術(shù)方法，探索了它們在AME環(huán)境微生物群落分析上的應(yīng)用。傳統(tǒng)的微 生物群落結(jié)構(gòu)研究方法是以培養(yǎng)性狀為依據(jù) , 此類方法可以提供微生物群落多樣 性以及物種發(fā)育史等信息 ,但是其工作量巨大 ,對于群落多樣性的描述與量化仍 有其局限性。迅速開展的以核酸 基因為根底的分子生物學(xué)技術(shù)使微生物群落研究有了 顯著的進(jìn)展

3、。分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用過程對目標(biāo)基因的選擇是非常重要 的,16SrRNA或rDNA是微生物多樣性分析常用的基因，但它有識別能力的限制以 及不能直接反響微生物的代謝與生理特征的缺陷目前常用的各種分子生物學(xué)分析方法都有這樣那樣的缺點(diǎn) , 沒有一種適宜的 方法可以用來同時快速、適時、準(zhǔn)確、靈敏地檢測環(huán)境微生物群落的多樣性?；?因芯片是最近開展起來的基因組研究技術(shù)之一 , 現(xiàn)已說明它是在基因組規(guī)模上研 究基因表達(dá)和調(diào)控的一種強(qiáng)有力的研究工具 , 同時它也是研究原核和真核生物基 因多態(tài)性的極好方法?；蛐酒夹g(shù)可以同時但它在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用尚處于起步階段, 目前已有功能基因組芯片F(xiàn)GA、系統(tǒng)發(fā)育寡

4、核苷酸芯片POA和群落基因組芯片 CGA等三種基因芯片被用于環(huán)境微生物基因表達(dá)分析、比較基因組分析和混合 微生物群落的分析。 本文構(gòu)建并評估適用于菌種鑒定與群落分析的群落基因組芯 片。CGA1用51株純培養(yǎng)微生物的整個DNAS因組構(gòu)建的,根據(jù)可培養(yǎng)的微生物 來研究環(huán)境微生物群落。此方法類似于反向樣品根本組探針法RSGP,RSGP法是 一種利用基因組DNA雜交來鑒定微生物的方法。為了確定此種類型芯片在研究環(huán)境微生物多樣性的潛在作用 , 我們就其雜交 特異性、檢測靈敏度和定量性能進(jìn)行了研究。在特定實(shí)驗條件下 ,CGA的特異性 實(shí)驗說明目的DNA與同種細(xì)菌存在特異性雜交，同屬之間不存在非特異性雜交，

5、 即CGA可區(qū)分屬內(nèi)菌種的染色體基因組。對于標(biāo)記的純培養(yǎng)基因組DNA,CGA勺檢測靈敏度大約為0.2 ng,對于混合培 養(yǎng)物,檢測靈敏度大約為5 ng。對于純培養(yǎng)微生物,CGA具有定量特性，實(shí)驗說明 在0.2 ng至2000 ng的一定濃度范圍內(nèi)，DNA量與雜交信號強(qiáng)度之間存在明顯的線性關(guān)系 (r2=0.985)當(dāng)將來自與五種微生物的基因組 DNA以不同濃度混合并選取五個濃度梯度 進(jìn)行雜交實(shí)驗，DNA量與雜交信號強(qiáng)度之間顯著相關(guān)r2=0.95。使用CGA分別 雜交AMD環(huán)境樣品與生物浸出系統(tǒng)樣品,雜交結(jié)果顯示CGA可以有效分辨兩者之 間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性。CGA說明基因組芯片技術(shù)可以根據(jù)微生物基因型的變異應(yīng)用于確定微生物 群落的特性。評估微生物的群落組成和結(jié)構(gòu)要求對單個目的種群進(jìn)行定量分析 通過